一种编码低温α-淀粉酶的基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，尤其设及一种编码低溫a-淀粉酶的基因及其 编码的蛋白在水解淀粉中的应用。
【背景技术】
[0002] 淀粉酶是水解a-1,4-糖巧键的一类可作用于可溶性淀粉、糖元等多糖的酶。根 据淀粉酶的作用的方式可分为a-淀粉酶、0-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶。其中 a-淀粉酶广泛应用于酿造、食品、轻化工业、制药工业、石油开采等领域。近年来随着淀粉 质原料深加工的发展，a-淀粉酶更是凭借其多样化的特性成为了目前酶制剂研究的热点 方向之一。根据来源的不同a-淀粉酶可W分为细菌a-淀粉酶和真菌a-淀粉酶，细菌 a-淀粉酶的典型代表是地衣芽抱杆菌产生的耐高溫a-淀粉酶，水解淀粉的主要产物是 糊精，主要应用于发酵工业，而真菌a-淀粉酶的典型代表是有曲霉属产生的a-淀粉酶， 水解淀粉的产物主要是麦芽糖、低聚寡糖及少量的葡萄糖，广泛的应用于现代淀粉糖浆、赔 烤制品、啤酒酿制等行业。
[0003] 我国是一个农业大国，具有非常丰富的淀粉质原料，因此，发展淀粉质原料的深加 工产业对我国农业发展具有重大的意义。淀粉质原料的深加工是一个庞大的体系，酶制剂 的不断开发更新是淀粉质原料的深加工的条件和基础，同时也对新酶工艺的发展、提高工 业效率、降低工业能耗具有重要的作用。发现和获得新的淀粉酶基因或者利用现代分子生 物学技术对已有的淀粉酶基因进行分子改造在淀粉质原料深加工产业领域具有巨大的应 用潜力。目前，在工业应用的a-淀粉酶主要来源于枯草芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌、解淀粉 芽抱杆菌、黑曲霉和米曲霉。运些a-淀粉酶具为中溫或者耐高溫淀粉酶，广泛应用于淀粉 加工工业。近年来，低溫a-淀粉酶越来越受到研究者们的广泛关注。洗涂剂中添加淀粉酶 等酶制剂W提高洗涂剂的洗涂效率已经成为洗涂剂的发展方向，而传统的洗涂方式要求添 加的酶制剂在低溫的条件下仍能发挥其酶活，低溫淀粉酶在洗涂剂中具有广泛应用前景。
[0004] Wa-淀粉酶为关键词查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现224项发明 专利。其中只有4项发明专利是描述编码低溫a-淀粉酶的基因及其应用，而其他项是耐 高溫、中溫、酸性a-淀粉酶的描述及其在各种领域上的相关应用。在运4项与编码低溫 a-淀粉酶的基因及其应用相关的发明专利中的低溫a-淀粉酶基因有3个是来自海洋耐 冷微生物，1个来自真菌。
[0005] 本发明获得的低溫a-淀粉酶是来自筛选到的克氏类芽抱杆菌 GX-4(PaenibacilluscookiiGX-4)，与基因数据库中公开的a-淀粉酶的氨基酸的同源性 较低，是一个新的a-淀粉酶。
[0006] 公开于该【背景技术】部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应 当被视为承认或W任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种编码低溫a-淀粉酶基因，该基因 所编码的a-淀粉酶具有水解淀粉的用途。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用W下技术方案：
[0009] 本发明提供一种编码低溫a-淀粉酶的基因，其具有如SEQIDNO. 1所示的序列； 其是从克氏类芽抱杆菌的基因组中克隆得到，由1740个碱基组成，含有完整的a-淀粉酶 基因Pamy的开放阅读框的penReading化ame, 0RF) ,Pamy基因的起始密码为ATG，终止密 码子为TAA。
[0010] 本发明还提供了一种表达载体，其含有所述的编码低溫a-淀粉酶的基因。
[0011] 本发明还提供一种宿主细胞，其含有所述的表达载体转化的原核细胞或真核细 胞。
[0012] 本发明还提供了所述的编码低溫a-淀粉酶的基因编码的蛋白质，其具有如SEQ ID N0.2所示的序列；所述的蛋白质由579个氨基酸组成，和Pamy催化功能域同源性较 高的是F*aenibacillus sp. F化贴-808(类芽胞杆菌属FSL R5-808)的al地a amylase catal^ic subunit(a -淀粉酶催化亚基），两者的一致性为61%，相似性为76% ;其次 与化enibacillus sp.HGF5(类芽胞杆菌属HGF5)的a-淀粉酶的一致性为60%，相似性为 75%。
[0013] 本发明还提供了所述的蛋白质在水解淀粉中的应用。
[0014] 本发明从广西南宁筛选到的克氏类芽抱杆菌GX-4 (PaenibacillusCOOkiiGX-4) 的基因组中克隆到一个编码低溫a-淀粉酶基因，在大肠杆菌宿主细胞中表达该基因生产 a -淀粉酶，其最适抑值为7. 0,最适反应溫度为40°C，20°C时保持50%W上的酶活，并且 其可W可溶性淀粉为原料降解成葡萄糖，麦芽糖及少量的麦芽=糖。 阳015] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0016] 1.本发明的低溫a-淀粉酶是来自克氏类芽抱杆菌GX-4(Paenibacilluscookii GX-4)，其与基因数据库中公开的a-淀粉酶的氨基酸的同源性较低，是一个新的a-淀粉 酶。
[0017] 2.本发明提供的a -淀粉酶基因编码的低溫a -淀粉酶Pamy具有水解淀粉的作 用，在洗涂行业及饲料行业具有广阔的应用前景。
【附图说明】 阳01引 图1为日-淀粉酶Pamy纯化物的SDS-PAGE图；
[0019]其中：M为Marker;1为a-淀粉酶Pamy。
[0020] 图2为a-淀粉酶Pamy的最适反应溫度图。
[0021] 图3为口 -淀粉酶Pamy的最适反应抑图。
[0022] 图4为葡萄糖标样的HPLC图。
[0023] 图5为麦芽糖标样的HPLC图。
[0024] 图6为a-淀粉酶Pamy水解可溶性淀粉的HPLC图。
【具体实施方式】
[00巧]下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不 局限于实施例表示的范围。运些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此 夕F，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可W对本发明作各种修改，运些等价变化同 样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
[00%] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所 使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 阳027] 在本发明的实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌巧scherichiacoli)株系 JM109和化-21 〇)E3)、载体PMD19-T(购自大连TaKaRa公司）；表达载体PSE380和祀T-22b购自Stratagene公司，购自TaKaRa、MBI的限制性内切酶、修饰酶等试剂。
[0028]室施魁JjPaenibaciIlus cookii GX-4基因组DNA的提取
[0029]P.COOkiiGX-4的基因组DNA是按照BioFlux公司的细菌基因组DNA提取试剂盒 BiospinBacteriaGenomicDNAExtractionKit(目录号BSC12S1)的使用说明来提取的。
[0030]连施例2: a-淀粉酶基因Pamy序列的测定
[0031] 通过对GenBank数据库中类芽抱杆菌属的a-淀粉酶进行比对分析，设计引物Pl 和P2扩增a-淀粉酶基因的保守区。
[0032] Pl:5' -TATGAAATTTTCGTCCGTTCTTTC-3' ；
[0033]P2 :5 ' -CATCCCGATCTCTTCGCCGTAATA-3 '。
[0034] 将扩增得到的保守区片段连接T载体PMD19-T转化大肠杆菌感受态JM109进行蓝 白筛选阳性克隆子送测序。
[0035] 根据测序得到的保守区碱基序列采用Genomewalking技术扩增保守区两端的未 知序列连接载体PMD19-T转化大肠杆菌感受态JM109进行蓝白筛选阳性克隆子送测序。
[0036] 将测序结果拼接后获得一段长2249bp的DNA片段，用NCBI(化tionalCenter forBiotechnologyInformation,http://www.ncbi.nlm.nih.邑ov)上的软件，女曰ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html),Blast(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST)对DNA序列进行分析。发现基因开放阅读框（OpenReadingRrame,