0RF) 由1740个核巧酸组成。其中，基因的起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。将该基因命名 为Pamy。
[0037]连施例3: a-淀粉酶基因Pamy编码的产物Pamy的氨基酸序列分析
[0038]a-淀粉酶基因Pamy编码一个含579个氨基酸的蛋白质，用DNAStar软件预测该 蛋白质的理论分子量大小为63690. 86道尔顿。 |；0〇39]用简单组件结构研究工具（SimpleModularA;rchitec1:ureResearch Tool,SMART,http://smart,embl-heide化erg.de)分析a-淀粉酶Pamy的组件结构，结果 是有一个淀粉酶功能域和一个未知功能的功能域。
[0040] 用信号肤分析软件Si即alP4. 1化ttp: //www.cbs.cltu.dk/services/Si畑alP) 分析a-淀粉酶Pamy是否含有信号肤，结果显示无信号肤序列。
[0041]连施例4: a-淀粉酶基因Pamy的克隆和表达
[0042]使用上游引物5，-ACACCATGGATCACCATCATCATCATCATATGAAGCGAAGAGCGCAAAC-3，和 下游引物5'-CCGGAATTCTTACTGCAAAATAACGGTGG-3'，通过聚合酶链式反应（PCR)扩增a-淀 粉酶基因Pamy,用限制性内切酶化OI和EcoR I酶切a-淀粉酶基因Pamy后，与经化〇1 和EcoR I酶切的表达载体PSE380进行连接。再将连接产物转化到大肠杆菌化21中（转 化方法为化Cl2法），涂布到含氨节青霉素（100yg/mL)的LA平板上。挑取转化得到的单 菌落到含有氨节青霉素（100yg/mL)、可溶性淀粉和锥虫蓝的LA培养基平板上，将平板置 于37°C恒溫箱培养化，IPTG诱导表达6小时然后进行氯仿熏蒸破胞，把平板置于37°C恒溫 箱使表达的Pamy酶与可溶性淀粉反应2-化。观察选择平板。
[0043] 然后进一步提取能形成白色圈的克隆子的质粒DNA，并将其命名为P沈-Pamy,用 限制性内切酶化Ol和EcoRI酶切pSE-Pamy后，进行0.7%琼脂糖凝胶电泳分析，结果 pSE-Pamy除有一个4. 3化的DNA片段外，还有一条大小约为1. 7化的DNA片段。
[0044] 将含有质粒P沈-Pamy重组大肠杆菌化21 〇)E3)菌株接种到SOOmL含氨节青霉素 (100yg/血）的LB培养基中，37 °C振荡培养，待ODe。。为0. 4时，加入IPTG使其终浓度为 0. 5mmol/L，20°C诱导 1 她。8000巧m离屯、lOmin，收集菌体，用SmL抑7. 0、100mmol/L的憐 酸缓冲液重悬菌体，超声波破胞15min。12000巧m离屯、20min，取上清进行后面的蛋白质纯 化。按每4mL上清液加入1血50%的儀亲和层析胶体，在4°C用200转/min摇60min，把 混合物灌注到柱子，收集流出物。加ImL冲洗缓冲液巧Ommol/LNaH2P04,300mmol/L化Cl, 20mmol/L咪挫，抑8.0)至啦子里，缓慢揽拌，收集流出物。重复冲洗步骤4次。加入洗脱 缓冲液（50mmol/L化H2P04,300mmol/LNaCl，250mmol/L咪挫，pH8. 0)洗脱蛋白质。收集 洗脱的蛋白质溶液，用变性的聚丙締酷胺凝胶电泳（SDS-PAG巧验证，发现没有目的大小的 蛋白质条带。推测组氨酸标签在蛋白折叠后包裹于蛋白内部而无法挂儀柱进行纯化。
[0045] 构建表达载体祀T-22b-pamy并将该载体转化至大肠杆菌化21 0E3)(转化方法为 化Clz法）。将含有质粒祀T-22b-pamy的重组大肠杆菌化21 〇)E3)接种到500血含氨节青 霉素（100yg/mL)的LB培养基中，37°C振荡培养，待ODe。。为0. 4时，加入IPTG使其终浓度 为0. 5mmol/L，30°C诱导12h。800化pm离屯、lOmin，收集上清。硫酸锭沉淀胞外目的蛋白 (经多次实验1. 5M的硫酸锭浓度可使目的蛋白完全沉淀下来），1200化pm离屯、30min，去上 清。pH7. 0憐酸缓冲液溶解蛋白后使用脱盐柱进行脱盐，再经过分子筛分离获得目的蛋白。 对获得的目的蛋白进行SDS-PACiE凝胶电泳试验。
[0046] 结果如图1所示，在63Kda处有明显的单一条带，即a-淀粉酶pamy纯化物的分 子量为63kDa。
[0047]实施例5:a -淀粉酶Pamy的最适溫度的测定 W48] a-淀粉酶W可溶性淀粉为底物进行最适溫度测定反应：取10yL稀释10倍的 纯酶液加入190yL的抑为7. 0含1 %可溶性淀粉的憐酸氨二钢-巧樣酸缓冲液溶液在 5-60°C反应lOmin，反应时间到后用400yLDNS试剂终止反应。在540皿波长中检测生成 物的量。 W例结果如图2所示，a-淀粉酶Pamy的最适溫度为40°C。
[0050]实施例6:a -淀粉酶Pamy的最适抑的测定
[0051]a-淀粉酶W可溶性淀粉为底物进行最适抑测定反应：取10yL稀释10倍的纯 酶液加入190yL含1 %可溶性淀粉的缓冲液溶液（pH4. 5-8. 0:憐酸氨二钢-巧樣酸缓冲 液）37°C作用lOmin，反应时间到后用400yLDNS试剂终止反应。在540nm波长中检测生 成物的量。
[0052] 结果如图3所示，a-淀粉酶Pamy的最适抑为7. 0。
[0053]连施例7:a -淀粉酶Pamy水解可溶性淀粉的测定
[0054] a-淀粉酶PamyW可溶性淀粉为底物时Pamy的酶活是91. 4U/mg。a-淀粉酶Pamy W可溶性淀粉为底物、在pH7.0的憐酸氨二钢-巧樣酸缓冲液和37°C下过夜。反应结束 后后，在100°C加热IOmin终止反应。Pamy的产物用高效液相色谱法她LC)进行检测。 阳05引 HPLC条件为：仪器：watersl525色谱仪；色谱柱：氨基柱；流动相：乙腊：水（70 : 30);流速：1. 0血/min;检测器：waters2414折光检测器。
[0056] 图4和图5分别是葡萄糖和麦芽糖的标样的HPLC图；图6是a-淀粉酶Pamy水 解可溶性淀粉的HPLC图。
[0057] HPLC检测的结果显示：a -淀粉酶Pamy能够将可溶性淀粉水解成葡萄糖、麦芽糖 及少量的麦芽=糖。
[0058] 综上所述，本发明的低溫a-淀粉酶与基因数据库中公开的a-淀粉酶的氨基酸 的同源性较低，是一个新的a-淀粉酶；其编码的a-淀粉酶Pamy具有水解淀粉的作用，在 洗涂行业及饲料行业具有广阔的应用前景。
[0059] 前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。运些描述 并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可W进行很多改变 和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应 用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案W及 各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
[0060]
【主权项】
1. 一种编码低温a-淀粉酶的基因，其特征在于，其具有如SEQIDNO. 1所示的序列。2. -种表达载体，其特征在于，其含有权利要求1所述的基因。3. -种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求2所述的表达载体转化的原核细胞或 真核细胞。4. 根据权利要求1所述的基因编码的蛋白质，其具有如SEQIDNO. 2所示的序列。5. 根据权利要求4所述的蛋白质在水解淀粉中的应用。
【专利摘要】本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种编码低温α-淀粉酶的基因及其编码的蛋白在水解淀粉中的应用。一种编码低温α-淀粉酶的基因，其特征在于，其具有如SEQ？ID？NO.1所示的序列；所述的编码低温α-淀粉酶的基因在大肠杆菌宿主细胞中表达该基因产生α-淀粉酶，所述的α-淀粉酶可以可溶性淀粉为原料降解成葡萄糖，麦芽糖及少量的麦芽三糖。该α-淀粉酶在洗涤行业及饲料行业具有广阔的应用前景。
【IPC分类】C12N15/57, C12N9/28, C12N15/63, C12N1/21, C12P19/14
【公开号】CN105219793
【申请号】CN201510653698
【发明人】汤宏赤, 张志凯, 林丽华, 郭媛, 杜丽琴, 庞浩
【申请人】广西科学院
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月10日