一种紫花苜蓿抗寒基因MsF-box及其编码蛋白和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，具体设及一种紫花首猜抗寒基因MsF-box及 其编码蛋白和应用。
【背景技术】
[0002] 紫花首猜（MedicagosativaL.)蛋白质含量高，营养价值全面，利用年限长，是世 界上种植面积最大、应用最广的多年生豆科牧草。紫花首猜成株能在阿勒泰和塔城地区顺 利过冬。在我国北方高缔度、高海拔地区，首猜普遍存在越冬率低，容易发生冻害和死亡现 象。越冬问题逐渐成为制约我国北方首猜草地成功建植的关键问题。因此，研究首猜抗寒 性具有重要的理论和实践意义。黑龙江省肇东市是首猜的故乡。黑龙江省冬季的平均气溫 在-2(TC左右，肇东首猜作为当地品种仍能顺利越冬，因此肇东首猜可作为抗寒性研究的重 要材料。肇东首猜的抗寒性是对零度W下低溫适应的一种遗传特性，随着秋冬季气溫逐渐 下降，首猜逐渐适应寒冷并增强其抵抗寒冷的能力。秋冬季的自然降溫对植物的抗寒性形 成极为重要，能够预防因冰冻引起的细胞脱水的危害，提升了其在冰冻情况下的存活能力。 在非冻结的低溫环境下，植物调节自身代谢并获得抗冻性的过程称为低溫驯化。在低溫驯 化过程中有大量基因上调或下调表达，运些基因的产物在抗冻性获得中起重要作用。 阳003] F-box是一类含有F-box基序（motif)且在泛素介导的蛋白质水解过程中具有底 物识别特性的蛋白质。F-box蛋白在逆境胁迫应答中发挥重要作用。目前，已经从各种物种 中鉴定出了大量的F-box蛋白，但只有少数与逆境相关的F-box蛋白被报道，尤其是与低溫 胁迫有关的蛋白。已有研究表明F-box蛋白基因在植物低溫胁迫应答中起作用，然而，在植 物中，抗寒基因F-box的研究主要集中在水稻和辣椒。鉴于不同物种的高度同源性基因可 能具有不同的功能特点，W及首猜具有逐渐适应寒冷并抵抗寒冷的能力，因此从首猜中分 离和研究抗寒基因F-box有利于首猜种质资源的发展。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种紫花首猜抗寒基因MsF-box及其编码蛋白和应用。 阳0化]本发明是通过W下技术方案来实现：
[0006] 本发明公开的一种紫花首猜抗寒基因MsF-box，该抗寒基因MsF-box的核巧酸序 列如沈化ID.NO. 1所示。
[0007] 本发明还公开了由上述紫花首猜抗寒基因MsF-box编码的蛋白，该蛋白的氨基酸 序列如SEQ.ID.NO. 2所示。该蛋白有一个F-box结构域，W及6个LRR重复。
[0008] 本发明公开了含有权利要求1所述的紫花首猜抗寒基因MsF-box的表达载体，该 表达载体为植物表达载体pCBM-MsF-box。
[0009] 本发明还公开了上述紫花首猜抗寒基因MsF-box在提高紫花首猜对环境抗寒性 能中的应用。
[0010] 构建上述紫花首猜抗寒基因MsF-box的植物表达载体，再将所构建的植物表达载 体转化到对冷敏感的植物中，筛选获得抗寒性增强的植物。
[0011] 优选地，所述对冷敏感的植物为双子叶植物烟草。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有W下有益的技术效果：
[0013] 本发明首次公开了一种紫花首猜抗寒基因MsF-box，并获得了该基因编码的蛋白 氨基酸序列，同时运用分子生物学及基因工程技术证实了紫花首猜抗寒基因MsF-box可W 提高植物抗寒性。紫花首猜的地方品种-肇东首猜可作为研究抗寒性的重要材料，肇东首 猜低溫胁迫的转录组数据表明，F-box基因表达上调，因此本发明构建植物该基因重组的表 达载体，转化双子叶模式植物烟草，提高植物耐寒性。开展紫花首猜抗寒基因MsF-box的研 究，目的是丰富紫花首猜抗寒基因资源，为今后首猜的遗传改良奠定基础。
【附图说明】
[0014] 图1为MsF-box的琼脂糖凝胶电泳图；
[0015] 图2为本发明利用ClustalX2和MEGA4软件构建MsF-box基因预测蛋白序列与同 源蛋白序列的进化树；
[0016] 图3为植物表达载体pCBM-MsF-box构建电泳图：
[0017] 其中，（a)为pMD18T-MsF-box的酶切鉴定图；化）为pCBM-MsF-box的酶切鉴定图； (C)为重组农杆菌菌落PCR鉴定图；(d)为重组农杆菌的酶切鉴定图； 阳01引 图4为植物表达载体pCBM-MsF-box构建流程图；
[0019] 图5为转基因烟草的PCR鉴定图；
[0020] 图6为转基因烟草的表型鉴定图；
[0021] 图7为转基因烟草在冷处理下叶绿素含量变化；
[0022] 图8为转基因烟草在冷处理下相对电导率变化。
【具体实施方式】
[0023] 本发明公开的一种新的抗寒基因MsF-box，该基因是从紫花首猜中克隆得到的，是 植物在低溫驯化下产生的高表达蛋白。
[0024] 本发明通过RT-PCR的方法从紫花首猜中克隆得到了MsF-box基因的全长cDNA，该 基因的核巧酸序列如序列表SEQIDNO: 1所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2 所示。 阳0巧]本发明提供的MsF-box基因结构特性为，MsF-box基因的全长为1422bp，该基因 编码473个氨基酸。该蛋白有一个F-box结构域，W及6个LRR重复。将其氨基酸序列在 NCBI中Blast分析，发现与MtF-box(裝襲首猜，
[0026] XP_003626345)相比，氨基酸同源性为96%。
[0027] 上述紫花首猜MsF-box基因在提高植物抗寒中的应用：该应用包括MsF-box基因 构建的表达载体；用构建的表达载体转化植物组织：转化的植物组织培育成转基因植株。
[0028] 所述的用本发明的MsF-box基因构建植物表达载体，可用现有的植物表达载体 pCBM构建含有所述基因的重组表达载体pCBM-MsF-box。所述的植物表达载体包含花挪菜 花叶病毒（CaMV) 35S启动子和草甘麟筛选标记基因PPT。
[0029] 本发明的表达载体通过农杆菌介导的遗传转化方法导入植物细胞或组织，并将转 化组织培育成植株。被转化的植物宿主为双子叶植物烟草（Nicotianat油acumcv.SR-1)。
[0030] 所述MsF-box基因的克隆和植物表达载体的制备方法，包括W下步骤： 阳0川 1)引物设计
[0032] MsF-boxF:5'TGGGTTAGGTTAGGATTA3'
[0033] MsF-boxR:5'TTTCTAGCCTTCTTACAGT3'
[0034] 2)MsF-box基因的克隆
[00对紫花首猜（MedicagosativaL.)的cDNA为模板，使用上述引物扩增MsF-box基 因，并连接进入PMD18T载体中，构建获得pMD18T-MsF-box载体。
[0036] 1)植物表达载体pCBM-MsF-box的构建
[0037] 对重组质粒pMD18T-MsF-box和pCBM表达载体质粒分别用BamHI和PstI进行双 酶切，进行连接构建获得植物表达载体pCBM-MsF-box。
[0038] 所述的转基因烟草的获得，包括W下的步骤：
[0039] 1)用农杆菌介导遗传转化方法将pCBM-MsF-box导入根瘤农杆菌EHA105中，获得 含表达载体pCBM-MsF-box农杆菌阳性菌落； W40]。将表达载体pCBM-MsF-box的农杆菌EHA105浸染烟草，经抗生素筛选，获得转基 因烟草。
[0041] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而 不是限定。
[0042] 1、MsF-box基因的克隆
[0043] 肇东首猜低溫胁迫的转录组数据中得到表达上调F-box基因的核巧酸序列。利用 该序列进行ORFFinder分析，找到开放读码框，设计引物，引物序列如下：
[0044] MsF-boxF:5'TGGGTTAGGTTAGGATTA3'
[0045] MsF-boxR:5'TTTCTAGCCTTCTTACAGT3'
[0046] W合成的紫花首猜的cDNA为模板，进行PCR反应，反应程序：94°C预变性5min，然 后 94°C解链 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸lmin36sec，反应 30 个循环，72°C延伸lOmin。 将反应液进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，得到约1422bp的片段，参见图1，其中，泳 道M是化2000DNAMarker的DNA分子量标准；泳道1是PCR扩增产物，用凝胶回收试剂盒 狂OMANB10)回收纯化。
[0047] 回收的PCR产物片段经T4DNA连接酶灯aKaRa)连接到pMD18-TSimp1e载体 (TaKaRa)〇
[0048] 重组质粒转化大肠杆菌TOPlO感受态细胞，序列测定为SEQIDNO: 1 ; W例连接反应体系：在IOyl反应体系中，SolutionI5^1，PCR回收产物4^1，PMD18-T1y1。混匀后16°C反应1地。重组载体的转化：参考《分子克隆实验指南》；
[0050] 测序得到MsF-box基因ORF的全长序列，MsF-box基因的全长为1422bp，该基因编 码473个氨基酸。该蛋白有一个F-box结构域，化及6个LRR重复。将其氨基酸序列在NCBI 中Blast分析，发现与化F-box(裝襲首猜，XP_003626345)相比，氨基酸同源性为96%。
[0051] 从NCBI获取裝襲首猜（Medicagot;runca1:ula)、鹰嘴豆（Cicerarietinum)和野 草替（Rragariavescasubsp.Vesca)等其他物种F-