一种培育高抗tylcv番茄的方法
【专利摘要】本发明公开了一种培育高抗TYLCV番茄的方法，具体是选择TYLCV基因组中AV1基因、AC1基因和AC3基因的片段嵌合得到多基因嵌合体AV1-AC1-AC3，并构建回文序列的干扰载体RNAi；通过农杆菌介导在番茄子叶中瞬时表达dsRNA，得到转化多基因嵌合体AV1-AC1-AC3的转基因番茄；转基因番茄经过TYLCV的系统侵染后表现为对TYLCV抗性，未观察到明显的发病症状，具有高抗TYLCV性能，从而筛选出高抗TYLCV番茄。本发明可在2个月内快速筛选和培育出高抗TYLCV番茄株系，大大缩短了培育周期，为防治TYLCV提供了技术支持。
【专利说明】-种培育高抗TYLCV番茄的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种培育高抗TYLCV番茄的方法。
【背景技术】
[0002] 番爺黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)属于双生病毒科 (Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus)，是植物病毒中唯--类具有孪生 颗粒形态的单链环状DNA(single stranded DNA，ssDNA)病毒。TYLCV基因组编码六个ORF : 在病毒链上的AVl和AV2,在互补链上的AC1、AC2、AC3和AC4。AVl编码的是病毒的外壳蛋 白（coat protein，CP)，与病毒的包壳、介体传播及与寄主互作相关；AV2编码是移动蛋白 (move protein, MP)相关的蛋白，主要起到协助移动蛋白的功能；ACl编码病毒复制相关蛋 白（replication-associated protein, Rep)，参与病毒基因组DNA的复制起始；AC2编码的 蛋白是一个转录激活子（transcriptional activator, TrA)，该蛋白能激活DNA-A和DNA-B 病毒链上的基因转录；AC3编码一个复制增强蛋白（replication enhancer protein, REn)， 但对病毒侵染力不起决定作用）；AC4编码的蛋白参与病毒的复制或转录调控。
[0003] TYLCV病发病症状主要表现为：顶端叶片边缘黄化且上卷，叶脉间叶肉发黄，植株 上部叶片变小，整个叶片萎缩，褶皱，植株生长变缓或停滞，节间缩短，明显矮化，致使产量 和质量降低。1991年，我国首次在广西南宁发现该病毒。从2006年起，该病毒在北京、山 西、江苏、上海、广东、广西、云南等地相继发现，并对当地的番茄生产造成了巨大的损失。
[0004] 预防为主、防治结合是防治番茄黄化曲叶病毒病的主要原则，目前主要通过调整 栽培结构、防治烟粉虱、加强田间管理以及选用抗病品种等措施对该病进行综合防治。但这 些方法成本高、效果不够理想，有时甚至会给环境带来负面影响，而进行抗病品种选育是最 有效的途径之一。在TYLCV的抗病性育种方面，国外研究的比较早，目前国外一些国家的科 研人员已经以野生抗病番茄品系为材料，通过杂交选育和基因工程得到了一些抗病或耐病 的商业品种。
[0005] 但传统的杂交育种艰苦费时，从而大大限制了育种工作的进展。与之相比，基因工 程育种具有明显的优越性：1)育种周期短；2)适用范围广，尤其适用于传统育种因缺乏抗 原而难以进行的抗CMV育种；3)在育种过程中不会引入其它不良农艺性状的基因等。因此， 基因工程在番茄抗病毒病育种中的应用日益受到人们的重视。当前，番茄抗病毒病基因工 程主要采用转病毒外壳蛋白（CP)基因的方法，获得了转烟草花叶病毒外壳蛋白基因番茄， 培育出了能稳定遗传的抗病毒植株。除病毒的外壳蛋白基因外，目前在番茄上主要采用卫 星RNA、反义RNA以及RNAi等方法获得不同程度的抗病毒番茄。
[0006] 目前，转基因的大部分的注意力都集中于单个的ACl蛋白、AVl蛋白或干扰TYLCV 在番茄内的复制、转移的其它蛋白基因。这种转基因的方法获得的高抗转基因植物的几率 较小，且该策略还存在异源重组等生态安全性的问题。RNA沉默机制的发现和应用，为抗病 毒基因工程提供了新的途径，该方面的研究在国际、国内已经广泛深入进行。但是，所有抗 TYLCV的商业杂交种均为单个抗性基因导入，当TYLCV大规模发生时，它们的抗病能力有限 甚至下降，仍会造成严重的经济损失。为保障我国番茄产业可持续发展，促进菜农增产增 收，进行更高抗TYLCV的番茄新品种的研究选育工作刻不容缓。
[0007] 有研究表明，通过聚合不同抗源的基因以提高植物对多种病毒的抗性是提高一个 品种抗病能力的重要策略之一。2005年，白庆荣等在烟草中转入PVX-CP和PVY-CP嵌合基 因并获得了 6株对两种病毒免疫的转基因株系；2008年，朱常香等获得了同时对PVY、TMV 和CMV这3种病毒都有抗性的烟草；2011年，牛颜冰等获得同时对两种病毒（TMV和CMV)免 疫的转基因烟草；至今为止，国内外尚未有关利用基因技术聚合同一抗源的不同基因来提 高植物对特定病毒高抗性的研究报道，因此进行高抗TYLCV番茄新品系的多嵌合基因沉默 技术及相关研究具有重大意义。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种培育高抗TYLCV番茄的方法，针对目前TYLCV对番茄的 产量和质量的严重危害，采用基因瞬时表达来快速筛选并培育对TYLCV具有高抗性的高抗 TYLCV番茄，大大缩短筛选周期。
[0009] 为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
[0010] 一种培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步骤：
[0011] 1)将TYLCV的AVl基因片段、ACl基因片段和AC3基因片段嵌合得到多基因嵌合 体AV1-AC1-AC3,并构建反向重复序列的RNAi载体；其中，AVUACl和AC3基因片段的核苷 酸序列分别如SEQIDNo·l，SEQIDNo·2和SEQIDNo·3所示，多基因嵌合体AVl-ACl-AC3 的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0012] 2)利用农杆菌介导法将RNAi载体在番茄上瞬时表达得到转化多基因嵌合体 AV1-AC1-AC3的转基因番茄。
[0013] 3)转基因番茄经过TYLCV系统性侵染、鉴定抗病性，获取对TYLCV具有抗性的高抗 TYLCV番茄。
[0014] 一种快速筛选并培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步骤：
[0015] 1)以感病番茄中提取的总DNA为模板，利用三对引物AV1F/AV1R，AC1F/AC1R和 AC3F/AC3R分别进行PCR扩增AVl基因片段，ACl基因片段和AC3基因片段，所述AVI、ACl 和AC3基因片段的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示；弓丨 物 AV1F/AV1R，AC1F/AC1R 和 AC3F/AC3R 的序列具体为：
[0016] AVIF ：CGCGGATCCGAGCTCATTCGTCTTAACAC
[0017] AVlR：ATATTTATTAAAATCATAGAAA
[0018] AC3F ：TTTCTATGATTTTAATAAATAT
[0019] AC3R ：TTCAAATTAAAGTATTTAAATA
[0020] AClF ：TATTTAAATACTTTAATTTGAA
[0021] ACIR ： GCTCTAGAGCGGCCGCGATCTGAGTCC
[0022] 2)将如 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2 和 SEQ ID No. 3 所示的 PCR 产物混合，以 引物AVlF和AClR进行PCR扩增，得到多基因嵌合体AV1-AC1-AC3,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。多基因嵌合体AV1-AC1-AC3与载体pGEM-T Easy Vector连接，得到质粒 PGEM-T-AV1-AC1-AC3。
[0023] 3)使用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切质粒pGEM-T-AVl-ACl-AC3和克隆载体 pBluescript II SK(-)-RTMl，将酶切片段和载体进行连接，得到重组质粒pBluescript II SK (-)-AV1-AC1-AC3-RTM1。
[0024] 4)使用限制性内切酶SacI和NotI双酶切质粒pBluescript II SK㈠ -AV1-AC1-AC3-RTM1和质粒PGEM-T-AV1-AC1-AC3,将酶切片段和载体进行连接，得到 重组质粒 pBluescript II SK(-)-AVl-ACl-AC3(i/r)。
[0025] 5)将构建的干扰片段AV1-AC1-AC3从重组质粒pBluescript II SK㈠ -AV1-AC1-AC3 (i/r)上使用限制性内切酶SacI和BamHI双酶切切下，并连接到植物表 达载体 PBIN19 上，构建 RNAi 载体 pBIN19-AVl-ACl-AC3 (i/r)。
[0026] 6)通过农杆菌介导法将RNAi载体pBIN19-AVl-ACl-AC3 (i/r)注射到2-3叶期苗 龄的番茄幼苗，注射20d后，用含有TYLCV侵染质粒的农杆菌侵染番茄植株，将TYLCV基因 组导入番茄植株内；通过提取番茄DNA、斑点杂交检测TYLCV含量来筛选对TYLCV具有抗性 的高抗TYLCV番茄。
[0027] 本发明所述培育高抗TYLCV番茄的方法在提高番茄抗TYLCV中的应用。
[0028] 本发明转化了多基因嵌合体AV1-AC1-AC3的转基因番茄经含有TYLCV侵染质粒 的农杆菌接种到番茄植株进行传毒，接种5周后其叶片生长正常，没有感染TYLCV的症状， 在其叶片中也没有检测到TYLCV，说明转化了多基因嵌合体AV1-AC1-AC3的转基因番茄对 TYLCV具有高抗性，从而筛选并培育出对TYLCV具有高抗性的高抗TYLCV的转基因番茄。
[0029] 本发明的有益效果：
[0030] 本发明利用TYLCV基因组中AVI、ACl和AC3基因片段扩增出如SEQ ID NO. 4所 示的多基因嵌合体AV1-AC1-AC3,并构建了专用于番茄的瞬时表达RNAi载体，将其在番茄 上瞬时表达得到转化多基因嵌合体AV1-AC1-AC3的转基因番茄，转基因番茄再经过TYLCV 系统性侵染、鉴定抗病性，获取高抗TYLCV番茄，可以在2个月内筛选并培育具有优良高抗 TYLCV的转基因番茄，大大缩短番茄的育种周期，为防治TYLCV提供了技术支持。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1为本发明多基因嵌合的RNAi载体T-DNA区域的构建流程图；
[0032] 图2为本发明嵌合基因瞬转番茄的PCR检测结果，其中，M :DNA marker ; 1-8 :嵌合 基因瞬转番茄；
[0033] 图3为本发明TYLCV侵染没有转化的番茄的叶片照片；
[0034] 图4为本发明TYLCV侵染转化空载的番茄的叶片照片；
[0035] 图5为本发明TYLCV侵染转化多基因嵌合体的番茄的叶片照片；
[0036] 图6为本发明转基因番茄体内TYLCV的检测结果，其中，1 :接种TYLCV的没有转化 的番茄；2 :转化嵌合基因的番茄；3 :没有接种TYLCV的没有转化的番茄。
【具体实施方式】
[0037] 以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案 而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理 解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范 围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
[0038] 本发明所用的试剂和材料若未经说明，均购自西格玛一奥德里奇（Sigma - Aldrich)公司。
[0039] 本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书（J.萨 姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994,科学出版社。）
[0040] 实施例ITYLCV的AVI，ACl和AC3基因片段的RNAi载体构建
[0041] 三基因片段嵌合基因的RNAi载体的构建流程如图1所示，主要步骤如下：
[0042] I. 1感病番茄的基因组DNA提取
[0043] 本实施例采取改良的CTAB法提取番茄叶片基因组DNA。具体实验步骤如下：称取 2g感病的番茄叶片放入_20°C预冷的研钵中，加入适量液氮，而后迅速将叶片研成粉末。研 磨完后将粉末装入I. 5mL的EP管中；在EP管中加入600 μ L 2% CTAB溶液（60°C预热）， 振荡混勻，60°C水浴15min ;加入300μ L氯仿，轻微振荡，放入4°C离心机中13, OOOrpm,离 心5min。将上清转移至另一新I. 5mLEP管中；加入等体积的25:24:1的苯酚/氯仿/异戊 醇，轻微振荡，放入4<€离心机中13,000印111，离心51]1；[11。将上清转移至另一新1.51]11^?管 中；加等体积（600 μ L)异丙醇，轻微摇匀，在-20°C冰箱沉淀不少于30min;将沉淀后的EP 管13, OOOrpm离心lOmin。弃上清后，用75%的乙醇将沉淀出的DNA洗涤2次；待乙醇蒸发 干后，向EP管中加入50 μ L TE缓冲液溶解DNA ;加入2 μ L的RNase，混匀后放入37°C水浴 lh，放-20°C冰箱备用。
[0044] I. 2PCR分别扩增AVI，ACl和AC3基因片段
[0045] 引物如下所示：
[0046] AVIF ：CGCGGATCCGAGCTCATTCGTCTTAACAC
[0047] AVlR ：ATATTTATTAAAATCATAGAAA
[0048] AC3F ：TTTCTATGATTTTAATAAATAT
[0049] AC3R ：TTCAAATTAAAGTATTTAAATA
[0050] AClF ：TATTTAAATACTTTAATTTGAA
[0051] ACIR ： GCTCTAGAGCGGCCGCGATCTGAGTCC
[0052] 以感病番茄中提取的基因组DNA为模板，分别以引物AV1F/AV1R，AC1F/AC1R和 AC3F/AC3R分别扩增3个目的片段AVI，ACl和AC3。所述目的片段AVI，ACl和AC3的核苷 酸序列分别如 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2 和 SEQ ID No. 3 所示。
[0053] PCR 反应条件为：94°C预变性 5min，（94°C变性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 lmin) 30个循环，72°C继续延伸5min。I. 0 %琼脂糖凝胶电泳分离并使用DNA凝胶回收试剂 盒（Axygen公司）回收目的片段AVI，ACl和AC3。
[0054] I. 3PCR 扩增嵌合基因 AV1-AC1-AC3
[0055] 将1. 2扩增的目的片段AVI，ACl和AC3混合做模板，以AVlF和AClR作为引物进 行PCR扩增。PCR反应条件为：94°C预变性5min，（95°C变性60sec，55°C退火IOsec) 7个循 环，72°C继续延伸 2min，（94°C变性 30sec，58°C退火 30sec，72°C延伸 lmin) 30 个循环，72°C 继续延伸lOmin。I. 0%琼脂糖凝胶电泳分离并使用DNA凝胶回收试剂盒（Axygen公司）回 收嵌合基因片段AV1-AC1-AC3，其核苷酸序列如SEQIDN0.4所示。回收的AV1-AC1-AC3片 段，连接到pGEM-T vector中。连接产物转化大肠杆菌DH5 α，涂板。次日挑取大肠杆菌菌 落，培养过夜后抽取质粒，命名为PGEM-T-AV1-AC1-AC3。
[0056] L 4 克隆载体 pBluescript II SK(-)-RTMl 的构建
[0057] 引物如下所示：
[0058] Fl：GCTCTAGATAGGACCTGTAGGGAAGC
[0059] Rl：GCGCGGCCGCACGCCATGAGATAGAAAA
[0060] 按照I. 1的方法提取拟南芥的基因组DNA，按照I. 2的方法，使用引物Fl和Rl 扩增120bp的RTMl基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，按照1. 3的方法获取 pGEM-T-RTMl。以pBluescript II SK(-)为出发克隆载体，将含有克隆载体pBluescript II SK(-)的大肠杆菌菌液以及含有质粒pGEM-T-RTMl的大肠杆菌菌液接种到1.6mL LB液 体培养基（含有氨卞霉素）中，37°C，220rpm振荡培养过夜，次日提取质粒。限制性内切酶 XbaI和NotI双酶切质粒pBluescript II SK (-)和质粒pGEM-T-RTMl，琼脂糖凝胶电泳回 收目的片段RTMl和载体片段pBluescript II SK (_)。将载体片段pBluescript II SK (-) 和目的片段1^￥1，41：连接过夜，产物转化到大肠杆菌0册〇感受态细胞中，加入80(^1^ SOC液体培养基震荡培养2h后，涂在加入氨卞霉素的LB固体平板上，37°C培养过夜。挑取 平板上的单菌落接种到LB液体培养基中（含有氨卞霉素），37°C震荡培养过夜，次日提取 质粒进行XbaI和NotI双酶切鉴定。酶切结果正确表明目的片段RTMl已正确连接到载体 pBluescript II SK(-)上，重组质粒命名为 pBluescript II SK(-)-RTMl。
[0061] 1. 5嵌合基因正向片段的构建
[0062] 使用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切质粒pBluescript II SK(_)-RTMl和质粒 PGEM-T-AV1-AC1-AC3,连接，转化，及重组质粒的鉴定。方法同1.4。酶切结果正确表明AC3 正向片段已正确连接到载体pBluescript II SK(-)-RTMl上，重组质粒命名为pBluescript II SK(-)-AVl-ACl-AC3-RTMl。
[0063] 1.6嵌合基因反向片段的构建
[0064] 使用限制性内切酶SacI和NotI双酶切质粒pBluescript II SK㈠ -AV1-AC1-AC3-RTM1和质粒PGEM-T-AV1-AC1-AC3,连接，转化，及重组质粒的鉴定。方 法同1.4。酶切结果正确表明AV-AC1-AC3反向片段已正确连接到载体pBluescript II SK (-)-AVl-ACl-AC3-RTMl 上，重组质粒命名为 pBluescript II SK (-)-AVl-ACl-AC3 (i/r)。
[0065] I. 7RNAi植物表达载体的构建
[0066] 将构建的干扰片段AV1-AC1-AC3从克隆载体pBluescript II SK㈠ -AV1-AC1-AC3 (i/r)上使用限制性内切酶SacI和BamHI双酶切切下，并连接到植物表 达载体PBIN19,转化，及重组质粒的鉴定。方法同1.4。酶切结果正确表明AV1-AC1-AC3反 向重复片段已正确连接到载体PBIN19上，重组质粒命名为pBIN19-AVl-ACl-AC3 (i/r)。
[0067] 实施例2农杆菌介导法瞬转番茄
[0068] 2. 1农杆菌EHA105感受态细胞的制备
[0069] 挑取农杆菌EHA105在含有25 μ g/mL利福平的YEP固体平板划线，28 °C培养 36-48h ;挑取单菌落接种于2mLYEP培养基中，28°C，200rpm培养过夜；2mL菌液接种到 50mLYEP 培养基中继续培养 6-8h，至 0D600 = 0. 5,冰浴 IOmin ;4°C，7, OOOrpm 离心 5min，弃 上清，将菌体重悬于5mL 20mM CaC12溶液中；4°C，7,000rpm离心Imin,弃上清，菌体用ImL 20mM预冷的CaC12轻轻悬浮，每管100 μ L分装，液氮速冻，-80°C保存备用。
[0070] 注：实验中所有接触空气的步骤均在超净台操作，NaCl和CaC12配制完成后121°C 灭菌20min备用。
[0071] 2. 2RNAi载体转化农杆菌
[0072] 将5 μ L重组质粒pBIN19-AVl-ACl-AC3 (i/r)加入到100 μ L农杆菌感受态细 胞中，轻轻吹吸混匀；将转化的感受态放入液氮中冷冻lmin，取出后水浴锅中37°C水浴 15min ;离心管中加入800 μ L无抗性YEP液体培养基，28°C，200rpm培养3h ;8, OOOrpm离心 lmin，弃掉大部分上清，剩余100 μ L重悬菌体，涂布在加入100mg/L卡那霉素和25mg/L利 福平的YEP固体平板上，28 °C培养36h ;待平板上长出单菌落后，挑取单菌落接种到2mL加 入卡那霉素和利福平的YEP液体培养基中继续培养过夜；使用菌液PCR对农杆菌进行鉴定。 使用引物Fl和Rl扩增，当目的片段长度为120bp时，则检测结果正确。结果正确的用于农 杆菌介导的瞬时表达实验。
[0073] 2. 3农杆菌瞬转番茄
[0074] 将结果正确的农杆菌菌液接种到含2mL加入100mg/L卡那霉素和25mg/L利福平 的YEP液体培养基的试管中，28°C，200rpm震荡培养约20h，使菌液0D600 = 0. 6左右；将 摇培的菌液转入含50mL加入100mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEP液体培养基的锥形 瓶中扩大培养4-7h，检测菌液浓度0D600 = 0. 6左右；离心摇培的菌液，收集菌体，使用农 杆菌侵润缓冲液将菌体稀释至0D600 = 2. 0左右，室温放置2h，即可用于侵染番茄植株；使 用无菌注射器的针头在番茄植株已完全展开的第二片或第三片叶子上划出伤口，伤口不宜 过大，不要扎透叶片，只需稍微划破上表皮即可，注射器针筒吸取准备好的农杆菌侵染液， 以手指垫住番茄叶片伤口的背面，针筒对准伤口靠压力将侵染液注入到叶片两个分叶脉之 间。含不同转化载体的农杆菌需用不同的注射器，同时对部分植株注射含空载体的菌液，作 为阴性对照。
[0075] 2. 4瞬转番茄的PCR检测
[0076] 携带抗病毒载体的农杆菌侵染番爺植株一周后，随机挑选其中8株番爺，按照I. 1 的方法提取注射叶片的总DNA，按照1. 2的方法进行转化片段的PCR检测，使用的引物为 AV1AC1AC3F和AV1AC1AC3R。检测结果如图2所示，泳道M为DNA标记，泳道1-8为随机 所选的8株番茄。所选的番茄泳道中都能扩增到200bp的目的片段，表明多基因嵌合体 AV1-AC1-AC3已经成功转到番茄中。
[0077] 引物的序列如下所示：
[0078] AV1AC1AC3F ：TCTATCTCATGGCGTGTA
[0079] AV1AC1AC3R ：AGGTAATGCGGATCTACG
[0080] 实施例3转基因番茄的TYLCV抗性鉴定
[0081] 3.1农杆菌注射接种
[0082] 接种RNAi载体3周后，将含有TYLCV侵染质粒的农杆菌接种到转基因番茄植株 的新叶上，对番茄进行传毒，以未转化但传毒的番茄植株为阳性对照，同时留下部分番茄植 株转化空载做为阴性对照，方法同2. 3。接种5周后，观察番茄叶片症状，结果如图3、4、5 所示。由图3可知，A是未转化但传毒的番茄植株，从叶片症状可以发现该番茄已经严重 感染TYLCV ;由图4可知，B是转化空载的番茄植株，其叶片症状与A相似，说明该番茄也感 染TYLCV ;由图5可知，C是转化嵌合基因的番茄植株，其叶片生长正常，没有发现任何感染 TYLCV的症状，说明转化嵌合基因的番茄没有感染TYLCV。
[0083] 3. 2转基因番茄内病毒的检测
[0084] TYLCV接种5周后使用斑点杂交的方法来检测番茄叶片中TYLCV的DNA含量。具 体操作步骤如下：
[0085] 剪膜：剪裁两块所需大小的尼龙膜（Hybond N+，Amersham Pharmacia, Germany), 用钝头铅笔划出〇. 5cmX0. 5cm方格图；点样：取0. Ig番茄叶片，使用0. 5mL 0. 4M NaOH处 理，取10 μ L处理液点在尼龙膜上，自然晾干；烤膜：将尼龙膜点有样品的一面朝上，置于分 子杂交炉中于80°C条件下烘烤1?2h ;预杂交：将烤好的尼龙膜放入杂交袋中，加入已经 预热至42°C的预杂交液于摇床上温和摇动30min ;探针准备：以提取的TYCLV的cDNA为模 板，体外合成以32P为标签的病毒探针，取适当体积已标记的探针在沸水中变性5min，迅速 置于冰上冷却5min，加到已预热至42°C的杂交液中，温和充分混匀，避免产生气泡；换杂交 液：倾去预杂交液，将尼龙膜放入杂交管中，装入含探针的杂交液；杂交：置于分子杂交炉 中于42°C条件下温和摇动，保温过夜；洗膜：将尼龙膜拿出，用洗膜液I洗两次，每次5min， 于摇床上温和摇动。用预热至65°C的洗膜液II在分子杂交炉中于65°C洗膜两次，每次 15min，温和摇动；漂洗：洗膜后用Washing溶液将膜漂洗1?5min，于摇床上温和摇动；封 闭：将洗后的尼龙膜转移至杂交袋中，用IXBlocking溶液封闭，于摇床上温和摇动30min。
[0086] 抗体作用：将封闭后的尼龙膜转移至杂交袋中，用抗体溶液与膜相互作用，于摇床 上温和摇动30min ;平衡：用适量检测溶液将膜平衡5min，于摇床上温和摇动；显色：将封 闭后的尼龙膜转移至新的杂交袋中，加5mL新配显色液，置于暗处5?IOmin (不可摇动）， 几分钟后有色素颗粒开始形成，一般16h后完成显色反应；拍照：显色结束后以TE终止，用 扫描仪获取图像，保存结果。分析结果如图6所示。
[0087] 由图6可知，1是没有转化但接种TYLCV的番茄，检测结果表明该番茄体内含有大 量TYLCV ;3是没有转化也没有接种TYLCV的番茄，该番茄中也没有检测到TYLCV ;2是转化 嵌合基因的番茄，该番茄中没有检测到TYLCV，说明转化了多基因嵌合体AV1-AC1-AC3的转 基因番茄对TYLCV具有高抗性，从而筛选出高抗TYLCV番茄。
【权利要求】
1. 一种培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步骤： 1) 将TYLCV的AVl基因片段、ACl基因片段和AC3基因片段嵌合得到多基因嵌合体 AV1-AC1-AC3,并构建反向重复序列的RNAi载体；其中，AVI、ACl和AC3基因片段的核苷酸 序列分别如SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示，多基因嵌合体AV1-AC1-AC3 的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示； 2) 利用农杆菌介导法将RNAi载体在番茄上瞬时表达得到转化多基因嵌合体 AV1-AC1-AC3的转基因番茄； 3) 转基因番茄经过TYLCV系统性侵染、鉴定抗病性，获取对TYLCV具有抗性的高抗 TYLCV番茄。
2. -种培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步骤： 1) 以感病番茄中提取的总DNA为模板，利用三对引物AV1F/AV1R，AC1F/AC1R和AC3F/ AC3R分别进行PCR扩增AVl基因片段，ACl基因片段和AC3基因片段，所述AVUACl和AC3 基因片段的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示；引物AVlF/ AV1R，AC1F/AC1R 和 AC3F/AC3R 的序列具体为： AVIF ：CGCGGATCCGAGCTCATTCGTCTTAACAC AVlR ：ATATTTATTAAAATCATAGAAA AClF ：TATTTAAATACTTTAATTTGAA ACIR ： GCTCTAGAGCGGCCGCGATCTGAGTCC AC3F ：TTTCTATGATTTTAATAAATAT AC3R ：TTCAAATTAAAGTATTTAAATA 2) 将PCR产物混合，以引物AVlF和AClR进行PCR扩增，得到多基因嵌合体 AV1-AC1-AC3,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。多基因嵌合体AV1-AC1-AC3与载体 pGEM-T Easy Vector 连接，得到质粒 pGEM-T-AVl-ACl-AC3; 3) 使用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切质粒pGEM-T-AVl-ACl-AC3和克隆载体 pBluescript II SK(-)-RTMl，将酶切片段和载体进行连接，得到重组质粒pBluescript II SK(-)-AVl-ACl-AC3-RTMl ； 4) 使用限制性内切酶SacI和NotI双酶切质粒pBluescript II SK㈠-AV1-AC1-AC3-RTM1和质粒pGEM-T-AVl-ACl-AC3,将酶切片段和载体进行连接，得到 重组质粒 pBluescript II SK(-)-AVl-ACl-AC3(i/r); 5) 将构建的干扰片段AV1-AC1-AC3从重组质粒pBluescript II SK㈠-AV1-AC1-AC3 (i/r)上使用限制性内切酶SacI和BamHI双酶切切下，并连接到植物表 达载体 PBIN19 上，构建 RNAi 载体 pBIN19-AVl-ACl-AC3 (i/r); 6) 通过农杆菌介导法将RNAi载体pBIN19-AVl-ACl-AC3(i/r)注射到番茄幼苗，再用含 有TYLCV侵染质粒的农杆菌侵染番茄植株，将TYLCV基因组导入番茄植株内；通过提取番茄 DNA、斑点杂交检测TYLCV含量来筛选出对TYLCV具有抗性的高抗TYLCV番茄。
3. 如权利要求1或2所述的培育高抗TYLCV番茄的方法在提高番茄抗TYLCV中的应 用。
【文档编号】C12N15/84GK104313051SQ201410547125
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】孙胜, 邢国明, 邢晓娟, 亢秀萍, 陈志峰, 李兴桃, 许小勇 申请人:山西农业大学