专利名称：：一种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法
技术领域：
：本发明涉及ー种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法，专用于农作物(番茄)遗传转化和转基因新品种的选育，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：番茄黄化曲叶病毒(TomatoYellowLeafCurlVirus，TYLCV)隶属双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)0大多数Begomovirus包含2个闭合环状单链、大小为2.5-3.OKb基因组，即DNA-A和DNA-B组份；少数仅含有一个DNA-A组份，其基因组结构相当于双组份病毒的DNA-A。DNA-A编码6个0RF，分別是位于病毒链上的Vl基因(编码外壳蛋白capsidprotein,CP)、V2基因(编码移动蛋白movementprotein,MP)以及位于互补链上的Cl基因(编码复制起始蛋白implicationinitiatorprotein,Rep)>C2(^^transcriptionalactivatorprotein,TrAP)>C3基因(编码复制增强蛋白implicationenhancerprotein,REn)和C4基因(编码的蛋白參与病毒的系统运动或症状形成)；在基因V2与Cl之间有非编码区(intergenicregion,IR)，该区含有病毒复制和转录所需的调控元件，包括茎环结构域和保守的9碱基TAATATTAC序列等。DNA-B编码的蛋白涉及到病毒的移动，其中病毒链编码的BVl是ー个核穿梭蛋白(Nuclearshuttleprotein，NSP)，具有结合DNA的活性，能够促进病毒DNA在细胞核与细胞质之间进行穿梭运动；互补链上的BCl编码MP，參与病毒的胞间移动(CzosnekHandGronenbornB.ihetomatoyellowleafcurlvirusgenomeandfunction01itsproteins.TomatoYellowLeafCurlVirusDisease,2007:67-84).感染TYLCV番茄早期主要表现为植株生长迟缓或停滞，节间变短，明显矮化，叶片变小，变厚，叶质脆硬，有褶自皮，向上卷曲，变形，叶片边缘至叶脉区域黄化，以植株上部叶片症状典型，下部老叶症状不明显；植株感病后期坐果很少，果实变小，膨大速度极慢，成熟期的果实不能正常转色，致使番茄品质下降，基本失去商品价值，产量減少，甚至绝收，给当地番茄生产造成巨大的损失(赵统敏，余文贵，杨玛丽，赵丽萍，季英华，周益军.番茄黄化曲叶病毒病在江苏的暴发与综合防治.江苏农业科学，2008:114-115)。ITLCV通过烟粉虱以长久方式传播。烟粉虱繁殖力强且极易产生抗药性，如片面施用化学农药往往在1-3年后难以防治，而且该虫寄主广泛，几乎涵盖所有常见蔬菜、多种花卉等作物，要将TYLCV限制在ー个地点和阻止其传播与扩散有很大难度。同时ITLCV危害重，又几乎无药可治，因此培育抗ITLCV优良品种，是消除ITLCV威胁的主要策略。目前，抗TYLCV的基因仅在醋栗番茄(LvcopersiconDiiminellifoliim)、播M芳口(Lycopersiconperuvianum)、多毛畨カロ(Lycopersiconnabrochaites)、智利备芳ロ(LycopersiconcAi^ewseノ禾ロ契5^尼播安口{Lycopersiconcheesmanii)ぜ近缘野生禾中中发现，在番茄栽培种中还未发现。番茄栽培种与野生种杂交才可获得抗TYLCV的番茄栽培种质，但这需要大量且长期的选育和鉴定工作(JiY,ScottJ,HansonP,GrahamΕ,MaxwellD.Sourcesofresistance,inheritance,andlocationofgeneticlociconferringresistancetomembersofthetomato—infectingbegomoviruses.iomatoYellowLeafCurlVirusDisease,2007:343-362)。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。RNAi是普遍存在于动物和植物界的一种防御反应，已经发展成为基因治疗、基因功能研究和植物新种质创制的有效的方法。因此，利用RNAi技术特异地对抗番茄黄化曲叶病毒，可以培育抗TYLCV番茄。
发明内容技术问题本发明的目的是针对TYLCV危害番茄生产的现状，提供ー种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法。技术方案ー种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法，包括1)将TYLCV的V2和Cl基因中的保守序列嵌合并构建反向重复序列的RNAi载体；2)利用农杆菌介导转化法转化番茄无菌苗子叶或下胚轴外植体；3)转基因番茄经ITLCV的农杆菌侵染性克隆注射接种和携帯ITLCV的烟粉虱接种鉴定抗病性，获取抗TYLCV番茄。本发明所述的方法，具体步骤如下1)分別利用下列两对引物F1/R1和F2/R2进行PCR扩增，从有ITLCV典型症状的番茄植株病叶样品DNA中扩增V2基因和Cl基因，所述V2基因和Cl基因的序列分别为SEQIDNO.1和SEQIDN0.2所示；FlCAGAAGCTTTCAACCAATCAAATTGCATCCTRlAACGAGGCATGGGCTTCGATACATTCTGTATATTCTGGF2GTATCGAAGCCCATGCCTCGTTTATTTAAAATATATGCR2GTCAAGCTTCTACACGCTTACGCCTTATTG2)将SEQIDNO.1和SEQIDNO.2PCR产物混合，以引物Fl和R2进行PCR扩增，得到V2和Cl的嵌合基因，嵌合基因序列为SEQIDN0.3所示，SEQIDNO.3PCR产物与pGEM-Τ载体连接，得到T-V2C1；3)以T-V2C1为模板，利用下列F3/R3引物进行PCR扩增，将PCR产物和植物表达载体载体iHp用BamHI和HindIII酶切，酶切片段进行连接，得到iHp-T_V2Cl；F3CTAGGATCCATGAGGCGATATAATCATTTCCAR3TGCAAGCTTAACCGTTGGTTCTTACATTG4)以T-V2C1为模板，利用下列F4/R4引物进行PCR扩增，将PCR产物和iHp-T_V2Cl以B10I和McI酶切，酶切片段进行连接，得到iHp-V2Cl；F4GATCTCGAGAACCGTTGGTTCTTACATTGR4GTTGAGCTCAGGCGATATAATCATTTCCA5)用BamHI和McI酶切植物表达载体pBI121和iHp_V2Cl，回收酶切的目的片段，用T4-DNA连接酶连接，构建RNAi载体pB1121-V2C1。6)农杆菌介导法将RNAi载体pBI121-V2Cl转化番茄无菌苗的子叶或下胚轴外植体，通过硫酸卡那霉素筛选，抗性再生苗生根、移栽，PCR鉴定获取转基因番茄。7)将含有TYLCV的农杆菌侵染性克隆采用农杆菌注射法对4-6叶期苗龄转基因番茄进行注射接种，筛选抗TYLCV转基因番茄或者将转基因番茄植株置于防虫温室，通过携帯TYLCV的烟粉虱进行捕食和传毒，筛选抗TYLCV转基因番茄。有益效果本发明方法利用RNAi技术可以培育具有优良抗TYLCV的转基因番茄，转基因番茄经TYLCV的农杆菌侵染性克隆注射接种和携帯TYLCV的烟粉虱传毒接种后，未表现TYLCV感染症状，而非转基因番茄植株的顶端新叶则产生卷曲皱縮、耳突，植株表现矮化等典型TYLCV感染症状。图1pBI121-V2C1载体转基因番茄PCR检测CK:非转基因番茄；M:IkbDNA分子量标准；1-15:pBI121_V2Cl转化番茄再生植株。除了6和14号再生植株，其他13株番茄再生植株能扩增出400bp大小的片段，而非转基因植株没有扩增到特异条带，证明RNAi框架已经整合至番茄基因組。图2PCR检测pBI121-V2Cl转基因番茄植株体内病毒CK:非转基因番茄；1-5，7-13，15:pBI121-V2Cl转基因番茄。对照植株能扩增明亮的病毒特异条帯，部分转基因植株(2、3、4、5、7、9、11、15号植株)也能检测到该特异条带，但条带亮度比对照植株暗，而1、8、10、12和13号转基因植株没有检测到病毒特异条帯，初歩表明该几个转基因株系对TYLCV有抗性。图3烟粉虱传毒ー个月后番茄植株表现A非转基因植株上半部分的新叶明显卷曲皱縮；B转基因植株上半部分的叶片无卷曲皱缩现象；C非转基因植株整体表现植株矮化；D转基因植株整株表现正常，无感染ITLCV症状。具体实施例方式1、TYLCV的V2和Cl基因RNAi载体的构建1.1植物总DNA提取利用CTAB法提取有TYLCV典型症状(顶端新叶出现卷曲、产生耳突)的番茄植株病叶样品DNA，具体步骤如下取Ig新鲜叶片，液氮研磨成粉末，转入1.5ml离心管，加入600μ1预热CTAB裂解液(表1)，涡旋混勻，65°C水浴lh，加入600μ1氯仿-异戊醇(24:1)，颠倒50次混勻，IOOOOrpm离心15min，取上清于新1.5ml离心管，加入等体积的预冷异丙醇，充分混勻，-20°C放置30min，12000rpm离心15min，弃上清，加入Iml75%酒精洗涤DNA沉淀，弃酒精，风干，加ΙΟΟμΙTE溶解DNA，4°C储存备用。表1CTAB裂解液組成成分用量1.4MNaCl40.908g0.IMTris-HCl50mll.OMTris-HCl(pH8.0)20mMEDTA20ml0.5MEDTA(pH8.0)2%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)IOg2%聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)IOg1%(V/V)β-巯基乙醇5ml去离子水425ml总体积500ml1.2PCR分别扩增V2和Cl基因片段V2基因片段PCR引物为FlCAGAAGCTTTCAACCAATCAAATTGCATCCT和RlAACGAGGCATGGGCTTCGATACATTCTGTATATTCTGG，Cl基因片段PCR引物为F2GTATCGAAGCCCATGCCTCGTTTATTTAAAATATATGC和R2GTCAAGCTTCTACACGCTTACGCCTTATTG。PCR反应条件94°C预变性3min，(94°C变性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸40sec)35个循环，72°C继续延伸lOmin。PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA凝胶回收试剂盒(Axygen公司)分别回收纯化V2基因453bp(SEQIDNO.1)和Cl基因1103bp(SEQIDNO.2)的目的片段。1.3PCR扩增V2禾ロCl的嵌合基因将步骤1.2的目的片段(SEQIDNO.1，SEQIDNO.2)混合做模板，以上述引物Fl和R2进行PCR扩增。PCR反应条件94°C预变性:3min，(94°C变性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸40sec)35个循环，72°C继续延伸lOmin。PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA凝胶回收试剂盒(Axygen公司)回收纯化嵌合基因392bp(SEQIDNO.3)。1.4载体T-V2C1构建和质粒提取将步骤1.3的嵌合基因与pGEM-T载体(Promega公司)连接，反应体系如下2XBuffer5.0μ1、ρ6ΕΜ_Τ载体0.7μ1、PCR产物3.3μ1、T4DNA连接酶Ι.ΟμΙ，上述成分混勻后16°C连接过夜。连接产物转化大肠杆菌JM109(Takara公司)，步骤如下取一管_70°C保存的感受态細胞，冰盒上融化，加入10μ1连接产物，轻摇混勻，冰浴30min；42°C热激90sec后迅速置冰浴anin，加入400μ1液体LB，37°CIOOrpm振荡培养Ih；取200μ1培养液均勻涂布于涂有4μ1IPTGQOOmg/ml)和40μ1X-GAL(20mg/ml)的氨苄青霉素(50mg/1)平板上，37°C静置培养12h。挑取平板上长出的单克隆，在含有氨苄青霉素(50mg/1)的LB液体培养基中37°C、220rpm培养16h，经引物Fl和R2进行PCR鉴定为阳性克隆，测序验证含有V2和Cl的嵌合基因序列(SEQIDN0.3)，命名为T-V2C1，用质粒DNA提取试剂盒(Axygen公司)提取T-V2C1质粒DNA。1.5载体iHp-T_V2Cl构建和质粒提取以T-V2C1DNA为模板，利用引物F3CTAGGATCCATGAGGCGATATAATCATTTCCA和R3TGCAAGCTTAACCGTTGGTTCTTACATTG进行PCR扩增，PCR反应条件94°C预变性3min，(94°C变性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸40sec，)35个循环，72°C继续延伸IOmin。PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA凝胶回收试剂盒(Axygen公司)回收纯化目的片段6(413bp)。将目的片段和植物表达载体iHp(PeterA.Stoutjesdijk,SurinderP.Singh,QingLiu,etal.hpRNA—mediatedtargetingoftheArabidopsisFAD2genegiveshighlyefficientandstablesilencing.Plantphysiology,2002,129:1723-1731.)用BamHI和HindIII酶切，酶切产物用T4-DNA酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109(Takara公司)。挑取平板上长出的单克隆，在含有50mg/l卡那霉素的LB液体培养基中370C、220rpm培养16h，经引物F3和R3进行PCR鉴定为阳性克隆后，命名为iHp-T_V2Cl，用质粒DNA提取试剂盒(Axygen公司)提取iHp-T_V2Cl质粒DNA。1.6载体iHp_V2Cl构建和质粒提取以T-V2C1DNA为模板，利用弓丨物F4GATCTCGAGAACCGTTGGTTCTTACATTG和R4GTTGAGCTCAGGCGATATAATCATTTCCA进行PCR扩增，PCR反应条件94°C预变性3min，(94°C变性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸40sec，)35个循环，72°C继续延伸IOmin。PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA凝胶回收试剂盒(Axygen公司)回收纯化目的片段(410bp)。将目的片段和iHp-T-V2Cl以XhoI和SacI酶切，酶切产物用T4-DNA酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109(Takara公司)。挑取平板上长出的单克隆，在含有50mg/l卡那霉素的LB液体培养基中37°C、220rpm培养16h，经引物F4和R4进行PCR鉴定为阳性克隆后，命名为iHp-V2Cl，用质粒DNA提取试剂盒(Axygen公司)提取iHp_V2Cl质粒DNA。1.7载体pBI121_V2Cl构建用BamHI和SacI酶切植物表达载体pBI121(Clontech公司)和iHp_V2Cl，酶切产物在0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA凝胶回收试剂盒(Axygen公司)回收纯化酶切片段，用T4-DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌JM109(Takara公司)。挑取平板上长出的单克隆，在含有卡那霉素的LB液体培养基中37°C、220rpm培养16h，用质粒DNA提取试剂盒(Axygen公司)提取质粒DNA，经BamHI/SacI双酶切验证后，命名为pBI121_V2Cl。2、农杆菌介导转化番茄2.1农杆菌感受态细胞的制备取_70°C保存农杆菌EHA105(北京Biovector公司)划线于LB(含有20mg/l利福平)平板，观で培养2d。挑单菌落培养于50ml液体LB(含20mg/l利福平)，140rpm,观で培养至OD600=0.5；农杆菌菌液转入无菌50ml离心管，4000rpm离心％iin，弃上清液，加入5ml预冷0.15MNaCl悬浮細胞，4000rpm离心4min，去上清液；再用0.15MNaCl悬浮細胞，4000rpm离心％iin，去上清液；加入3ml预冷20mMCaCl2溶液，轻轻悬浮細胞，冰上放置30min，加入终浓度为15%甘油，混勻后每管分装100μ1，立即冻存于-70°C。2.2RNAi载体pBI121_V2Cl转化农杆菌取IPg左右的PBI121-V2C1质粒DNA加入到100μ1农杆菌感受态细胞中，混勻后，冰浴30min；液氮冷冻lmin，取出后37°C水浴2min，冰浴^iiin；加入Iml液体LB，28°C、140rpm摇培2-；离心，100μ1液体LB重悬后涂在含50mg/l卡那霉素LB平板上，观で培养到形成单菌落；单菌落培养于含有50mg/1卡那霉素的液体LB，280C、140rpm摇培16h，取2μ1菌液进行PCR验证，阳性克隆保存备用。2.3农杆菌转化番茄子叶或下胚轴感病自交系番茄品种Ε_6(彭宏，余文贵，赵统敏，张保龙，倪万潮，吴丹，杨玛丽，赵丽萍.基因抗番茄黄化曲叶病毒(ITLCV)的研究，江苏农业学报，2011，27(2)371-377)种子用70%乙醇浸泡30sec，然后用10%次氯酸钠消毒15min，期间不断摇动，随后用无菌水冲洗3遍，接种于1/2MS培养基上培养IOd；取番茄无菌苗的子叶或下胚轴为外植体，用0D600=0.3左右的农杆菌菌液浸泡感染外植体5min。取出外植体，置于无菌干燥滤纸上吸干残留菌液，转入MS+IAA0.5mg/L+6-BA2.Omg/L培养基上黑暗处共培养48h，然后转入MS+IAA0.5mg/L+6-BA2.Omg/L+头孢霉素500mg/L+卡那霉素50mg/L筛选培养基上，25°C、18/光照周期进行培养。每三周换一次培养基。约40d左右分化出緑色芽点；待再生芽长到34Cm时切下并转入1/2MS+IBA1.Omg/L+头孢霉素400mg/L生根培养基中培养；根系发达后移栽至土壌。2.4转基因番茄的DNA提取利用CTAB法提取再生番茄植株叶片DNA，具体步骤如下取0.1-0.5g新鲜叶片，液氮研磨成粉末，转入1.5ml离心管，加入600μ1预热CTAB裂解液(表1)，涡旋混勻，65°C水浴lh，加入600μ1氯仿-异戊醇(24:1)，颠倒50次混勻，IOOOOrpm离心15min，取上清于新1.5ml离心管，加入等体积的预冷异丙醇，充分混勻，-20°C放置30min，12000rpm离心15min，弃上清，加入Iml75%酒精洗涤DNA沉淀，弃酒精，风干，加ΙΟΟμΙTE溶解DNA，4°C储存备用。2.5转基因番茄的PCR检测用特异引物V2C1-93FTCCAAGGCACAAACAAGCGACGA和FAD_intron96R:TATCGTGAGCGGAGAAATTCACAG进行PCR检测RNAi载体的V2C1嵌合基因序列和内含子部分序列，目的片段大小为400bp左右，非转基因番茄为对照。PCR扩增程序如下95°C预变性5min;94°C变性30sec，56°C退火30sec，72°C延伸50sec，30个循环；72°C延伸5min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，电泳检测结果显示有13株番茄再生植株能扩增出400bp大小的片段，而非转基因植株没有扩增到特异条带(图1)，证明RNAi框架已经整合至番茄基因組。3、转基因番茄的TYLCV抗性鉴定3.1农杆菌注射接种采用农杆菌注射法将含有TYLCV的农杆菌侵染性克隆(叶剑，青玲，周雪平.与中国番茄黄化曲叶病毒伴随的DNAii分子βCl缺失突变体介导的交叉保护作用初歩研究.浙江大学学报(农业与生命科学版)，2006，32:479-482.)对4-6叶期苗龄的非转基因和转基因番茄进行注射接种，具体操作如下Iml—次性注射器吸取含有TYLCV的农杆菌侵染性克隆，在距离根部l-2cm处取三点进行韧皮部注射，或者在植株叶柄处取三点进行韧皮部注射，或者在上部嫩叶背部用带有菌液的针头划伤，接种植株置于防虫温室，在25°C、16/光照周期下培养。3.2农杆菌注射接种转基因番茄植株体内病毒的PCR检测和抗病鉴定提取农杆菌注射接种15d的番茄叶片DNA，用病毒特异引物TYLCV-V1F:CGCCCGTCTCGAAGGTTC和TYLCV-V1R:GCCATATACAATAACAAGGC进行PCR检测，PCR扩增程序如下95°C预变性5min;94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸50s，30个循环；72°C延伸5min。结果发现对照植株能扩增明亮的病毒特异条帯，部分转基因植株(2、3、4、5、7、9、11、15号植株)也能检测到该特异条带，但条带亮度比对照植株暗，而1、8、10、12和13号转基因植株没有检测到病毒特异条帯，初歩表明该几个转基因株系对TYLCV有抗性。病症表现方面，非转基因番茄植株的顶端新叶出现卷曲、产生耳突，严重者叶片向上卷曲皱縮，植株表现矮化，而1、8、10、12和13号转基因植株未表现发病症状(图2)。3.3畑粉虱传毒实验将转基因番茄植株和非转基因对照置于防虫温室，25°C、16/光照周期进行培养，通过携带TYLCV的烟粉虱(纠敏，周雪平，刘树生.畑粉虱传播双生病毒研究进展.昆虫学报，2006，49:513-520;吴丹，张保龙，杨郁文，倪万潮，赵统敏，张云华，王荣富.不同启动子在转基因烟草中抗番茄黄化曲叶病毒的研究.江苏农业学报，2010,26(1):55-60)进行捕食和传毒，30d内观察植株症状。结果发现非转基因植株严重感病，植株上半部分的新叶明显卷曲皱縮，植株矮化，生长期后期开花不畅；而10和13号转基因植株未观察到明显的发病症状(图3)，表明转基因植株对TYLCV有良好抗病性。SEQIDNO.1V2基因片段cagaagctttcaaccaatcaaattgcatcctcaaacgttagataagtgttcatttgtctttatatacttggtccccaagtagtttgtcttgcactatgtgggatccacttctaaatgaatttcctgaatctgttcacggatttcgttgtatgttagctattaaatatttgcagtccgttgaggaaacttacgagcccaatacattgggccacgatttaattagggatcttatatctgttgtaagggcccgtgactatgtcgaagcgaccaggcgatataatcatttccacgcccgtctcgaaggttcgccgaaggctgaacttcgacagcccatacagcagccgtgetgetgtccccattgtccaaggcacaaacaagcgacgatcatggacgtacaggcccatgtaccggaagcccagaatatacagaatgtatcgaagcccatgcctcgttSEQIDNO.2Cl基因片段gtatcgaagcccatgcctcgtttatttaaaatatatgccaaaaattatttcctaacatatcccaattgttctctctctaaagaggaagcactttcccaattgaaaaacctagaaaccccaacaaataaaaaatacatcaaagtttgcagagaactccacgagaatggggaaccacatctccatgtgcttatccaattcgaaggcaaataccaatgtaagaaccaacggttcttcgacctggtatccccaaacaggtcagcacatttccatccgaacattcaggcagctaagagctcaacagatgtcaagacctacgtggaaaaagacggagacttcattgattttggagttttccaaatcgatggcagatcagctagaggaggtcagcaatctgccaacgacgcatatgccgaggcactcaattcaggcagtaaatccgaggccctcaatatattaaaagagaaggccccaaaggactatattttacaatttcataatttaagttcaaatttagataggatttttagtcctcctttagaagtttatgtttctccatttctttcttcttcttttaatcaagttccagatgaacttgaagagtgggtcgccgagaacgtcgtatcttccgctgcgcggccatggagacccataagtattgtcgttgagggtgatagcagaacaggcaaaacaatgtgggccaggtctctaggcccacataattatttatgtggacatttagacctaagcccaaaggtgtacagtaatgatgcgtggtacaacgtcattgatgacgtagacccgcattatttaaagcacttcaaggaattcatgggggcccagagggactggcaaagcaacacaaagtacgggaagcccattcaaattaaagggggaattcccactatcttcctctgcaatccaggacctacctcctcatatagggaatatctagacgaagaaaaaaacatatccttgaaaaattgggctctcaagaatgcaaccttcgtcaccctctacgagccactgttcgcaagtatcaatcaaggtccaacacaagatagccaagaagaaaccaataaggcgtaagcgtgtagaagcttgacSEQIDNO.3V2C1嵌合基因片段aggcgatataatcatttccacgcccgtctcgaaggttcgccgaaggctgaacttcgacagcccatacagcagccgtgctgcxgtccccattgtccaaggcacaaacaagcgacgatcatggacgtacaggcccatgtaccggaagcccagaatatacagaatgtatcgaagcccatgcctcgtttatttaaaatatatgccaaaaattatttcctaacatatcccaattgttctctctctaaagaggaagcactttcccaattgaaaaacctagaaaccccaacaaataaaaaatacatcaaagtttgcagagaactccacgagaatggggaaccacatctccatgtgcttatccaattcgaaggcaaataccaatgtaagaaccaacggtt权利要求1.ー种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法，包括1)将番茄黄化曲叶病毒TYLCV的V2基因和Cl基因中的保守序列嵌合并构建反向重复序列的RNAi载体；2)利用农杆菌介导转化法转化番茄无菌苗子叶或下胚轴外植体；3)转基因番茄经ITLCV的农杆菌侵染性克隆注射接种或携帯ITLCV的烟粉虱接种鉴定抗病性，获取抗TYLCV番茄。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于1)分別利用下列两对引物F1/R1和F2/R2进行PCR扩增，从有ITLCV典型症状的番茄植株病叶样品DNA中扩增V2基因和Cl基因，所述V2基因和Cl基因的序列分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；FlCAGAAGCTTTCAACCAATCAAATTGCATCCTRlAACGAGGCATGGGCTTCGATACATTCTGTATATTCTGGF2GTATCGAAGCCCATGCCTCGTTTATTTAAAATATATGCR2GTCAAGCTTCTACACGCTTACGCCTTATTG2)将SEQIDNO.1和SEQIDNO.2PCR产物混合，以引物Fl和R2进行PCR扩增，得到V2和Cl的嵌合基因，序列为SEQIDNO.3所示，嵌合基因SEQIDNO.3PCR产物与pGEM-Τ载体连接，得到T-V2C1；3)以T-V2C1为模板，利用下列F3/R3引物进行PCR扩增，将PCR产物和植物表达载体iHp用BamHI和HindIII酶切，将酶切片段进行连接，得到iHp-T_V2Cl；F3CTAGGATCCATGAGGCGATATAATCATTTCCAR3TGCAAGCTTAACCGTTGGTTCTTACATTG4)以T-V2C1为模板，利用下列F4/R4引物进行PCR扩增，将PCR产物和iHp-T_V2Cl以B10I和McI酶切，将酶切片段进行连接，得到iHp-V2Cl；F4GATCTCGAGAACCGTTGGTTCTTACATTGR4GTTGAGCTCAGGCGATATAATCATTTCCA5)用BamHI和McI酶切植物表达载体pBI121和iHp_V2Cl，回收酶切的目的片段，用T4-DNA连接酶连接，构建RNAi载体pBI121_V2Cl；6)农杆菌介导法将RNAi载体pBI121-V2Cl转化番茄无菌苗的子叶或下胚轴外植体，通过硫酸卡那霉素筛选，抗性再生苗生根、移栽，PCR鉴定获取转基因番茄；7)将含有TYLCV的农杆菌侵染性克隆采用农杆菌注射法对4-6叶期苗龄转基因番茄进行注射接种，筛选抗TYLCV转基因番茄；或者将转基因番茄植株置于防虫温室，通过携带TYLCV的烟粉虱进行捕食和传毒，筛选抗TYLCV转基因番茄。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在干所述转基因番茄含有SEQIDIDNO.3所示的部分或全部核苷酸序列。全文摘要本发明涉及一种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法，属于生物
技术领域：
。该方法将TYLCV的V2和C1基因中的保守序列嵌合并构建反向重复序列的RNAi载体，通过农杆菌介导转化法转化番茄无菌苗子叶或下胚轴外植体，转基因番茄经TYLCV的农杆菌侵染性克隆注射接种和携带TYLCV的烟粉虱接种病毒后都表现对TYLCV抗性，未观察到明显的发病症状。本发明利用RNAi技术可以培育抗TYLCV番茄转基因株系，为防治TYLCV提供了技术支持。文档编号A01H5/00GK102533853SQ20121005173公开日2012年7月4日申请日期2012年3月2日优先权日2012年3月2日发明者余文贵,张保龙,朱成松,杨郁文,赵统敏,陈天子申请人:江苏省农业科学院