一种磷脂型dha的发酵制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种磷脂型DHA的发酵制备方法，它包括以下步骤：(1)以产DHA的菌株为出发菌株，在液体培养基中进行高密度发酵，获得富含甘油脂型DHA的菌体细胞；(2)向步骤(1)高密度发酵结束后的发酵液中添加碳源、氮源、磷源、氨基酸，继续发酵获得富含磷脂型DHA的菌体细胞；(3)收集步骤(2)得到的富含磷脂型DHA的菌体细胞，经破碎、萃取获得富含磷脂型DHA的油脂。本发明最终得到15-40％的极性油脂，其中主要成分为磷脂，极性油脂中DHA含量达到48.16％。本发明将富含甘油酯型DHA的油脂转化为富含磷脂型DHA的油脂，并有效提高了油脂中磷脂型DHA的含量。
【专利说明】一种磷脂型DHA的发酵制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种磷脂型DNA的发酵制备方法。
【背景技术】
[0002] 二十二碳六烯酸（DHA)是一种重要的omega-3长链多不饱和脂肪酸，是大脑和视 网膜组织中细胞膜的组成成分，具有增强视力、促进脑细胞发育及预防高血压、动脉硬化、 心血管疾病等生理功效。由于人体很难通过自身合成来满足机体对DHA的需求，因此必须 依靠从外界食物中获取。
[0003] 目前，DHA的主要来源是鱼油，且主要以甘油三酯的形式被人体摄入。DHA的另一 种存在形式为磷脂型DHA(DHA-c〇ntaining PL)。磷脂是生物膜的主要成分，研究表明它具 有降血脂，抗动脉粥样硬化等作用。DHA的存在形式不同，在人体内的吸收方式和吸收效率 也不同。甘油酯型DHA在人体内主要以被动扩散的方式被吸收，吸收率为50%左右。而磷 脂型DHA在人体内主要以主动吸收的方式被吸收，吸收率接近100%。Kafrawy等人研究发 现，与其他磷脂型脂肪酸相比，磷脂型DHA对小鼠白血病细胞具有更大的毒性。研究还发 现，磷脂型DHA能够有效降低小鼠血浆和肝脏中的总胆固醇和甘油三酯含量，改善正常小 鼠的血脂水平。Gisbert等人研究发现，磷脂型DHA较甘油酯型DHA而言，对仔鱼的生长有 更好的促进作用。Schaefer等人研究发现，血浆中磷脂型DHA水平的增加可以有效减少痴 呆的发病率。
[0004] 磷脂型DHA只存在于蛋黄中，且含量极低。目前，国内磷脂型DHA的研究主要集中 在以下几个方面：（1)磷脂型DHA的应用；（2)磷脂型DHA的提取；（4)磷脂型DHA的生理作 用研究。其中，并未发现利用生物发酵法制备磷脂型DHA的相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种磷脂型DHA的发酵制备方法以填补国内 空白。
[0006] 为解决以上技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0007] -种磷脂型DHA的发酵制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
[0008] (1)以产DHA的菌株为出发菌株，在液体培养基中进行高密度发酵，获得富含甘油 脂型DHA的菌体细胞；
[0009] (2)向步骤（1)高密度发酵结束后的发酵液中添加营养物质，继续发酵获得富含 磷脂型DHA的菌体细胞；
[0010] (3)收集步骤（2)得到的富含磷脂型DHA的菌体细胞，经破碎、萃取获得富含磷脂 型DHA的油脂；
[0011] 其中，所述的营养物质为碳源、氮源、磷源、氨基酸中的任意一种或几种的组合。
[0012] 其中，所述的产DHA的菌株为裂殖壶菌属、破囊壶菌属、吾肯氏壶藻属，优选为裂 殖壶菌属，最优选为CCTCC No :M209059菌株（该菌株已经公开在申请号为200910033869. 5 的中国专利中）。
[0013] 上述步骤（1)中的高密度发酵包括如下步骤：
[0014] (Ia)将保存在甘油管中的菌株接入装有IOOml种子培养基的500ml摇瓶中，在 20?30°C的摇床中，以150?200rpm的转速，培养24?48h，获得一级种子液；
[0015] (Ib)将步骤（Ia)得到的一级种子液按照2?10% v/v接种量接入装有IOOml种 子培养基的500ml摇瓶中，在20?30°C的摇床中，以150?200rpm的转速，培养24?48h， 获得二级种子液；
[0016] (Ic)将步骤（Ib)得到的二级种子液按照2?10% v/v接种量接入装有IOOml种 子培养基的500ml摇瓶中，在20?30°C的摇床中，以150?200rpm的转速，培养24?48h， 获得三级种子液；
[0017] (Id)将步骤（Ic)中得到的三级种子液按照2?10% v/v接种量接入装有发酵培 养基的发酵罐中，然后向发酵罐中加入消泡剂，进行发酵，使菌株发酵产富含甘油酯型DHA 的油脂。
[0018] 上述步骤（Id)中发酵条件的通气量为0· 2?Ivvm,优选为0· 6vvm。
[0019] 上述步骤（Id)中发酵条件的搅拌速度为100?200rpm，优选为200rpm。
[0020] 上述步骤（Id)中发酵条件的罐温为20?30°C，优选为30°C。
[0021] 上述步骤（Id)中发酵条件的培养时间为90?150h，优选为120h。
[0022] 上述步骤（Id)中采用的发酵方法为间歇式发酵或补料式发酵方法。
[0023] 上述高密度发酵中的种子培养基的碳含量为10?30g/L，优选为15?25g/L，最 优选为20g/L。
[0024] 上述高密度发酵中的发酵培养基碳含量为20?60g/L，优选为30?40g/L，最优 选为40g/L ;氮含量为2. 1?2. 5g/L，优选为1. 8?2g/L，最优选为2g/L ;硫含量为2?3g/ L，优选为2. 5?3g/L，最优选为3g/L ;磷含量为0. 4?I. 5g/L优选为1. 2?I. 5g/L，最优 选为 I. 5g/L。
[0025] 所述的种子培养基和发酵培养基中，碳源为葡萄糖、果糖或甘油，优选葡萄糖；氮 源为酵母膏、玉米浆、牛肉膏、蛋白胨、硝酸铵或硫酸铵，优选酵母膏；磷源为磷酸二氢钾或 磷酸氢二钾，优选磷酸二氢钾；硫源为硫酸镁或硫酸铵，优选硫酸铵。
[0026] 上述步骤（Id)所述的消泡剂为silicone SE-2,添加量为0. 3g/L。
[0027] 上述步骤（Id)中采用的发酵方法为间歇式发酵或补料式发酵方法。
[0028] 其中，营养物质中，
[0029] 所述的碳源为乙醇、乙酸钠中的任意一种或几种的混合物；碳源的添加量为2? 4g/L，优选为 4g/L。
[0030] 所述的氮源为酵母膏、硫酸铵、谷氨酸钠中的任意一种或几种的混合物，氮源的添 加量为5?20g/L，优选为15?20g/L，最优选为20g/L。
[0031] 所述的磷源为磷酸二氢钾中，磷源的添加量为2?4g/L，优选为3?4g/L，最优选 为 4g/L。
[0032] 所述的氨基酸为脯氨酸、赖氨酸，添加量为0. 1?0. 5g/L，优选为0. 2?0. 3g/L， 最优选为〇. 3g/L。
[0033] 所述的营养物质优选谷氨酸钠、硫酸铵、乙醇单独添加，硫酸铵和乙醇双添加，硫 酸铵和脯氨酸双添加，最优选硫酸铵单独添加，硫酸铵和脯氨酸双添加。
[0034] 其中，步骤（2)中，所述的继续发酵条件的通气量为0· 5?lvvm，优选为0· 6vvm。
[0035] 其中，步骤⑵中，所述的继续发酵条件的搅拌速度100?200rpm，优选为 170rpm〇
[0036] 其中，步骤（2)中，所述的继续发酵条件的罐温20?30°C，优选为30°C。
[0037] 其中，步骤（2)中，所述的继续发酵条件的培养时间为48?72h，优选为72h。
[0038] 步骤（3)具体过程为：收集菌体细胞，采用破壁酶破碎细胞，再用有机溶剂萃提 4?8h，得到富含磷脂型DHA的油脂。
[0039] 其中，所述的有机溶剂为正己烷、石油醚、乙醇和乙醚中的任意一种或几种的混合 物，按照有机溶剂与破碎细胞液体积比1:0. 5?2的量添加。
[0040] 其中，所述的破壁酶为蛋白酶，添加量为2?8g/L。
[0041] 萃取得到油脂后，利用柱层析方法分离油脂组分，分别获得极性脂质和中性脂质， 所述的柱层析方法如下：
[0042] 取100?200目层析专用硅胶粉于120°C烘箱内烘24h，使其含水量在5%左右，待 用。先将30ml石油醚加入层析柱中，拍打除去砂芯中的气泡；取一定量硅胶粉至烧杯中，力口 入一定量石油醚，搅拌至无气泡，再缓缓倒入层析柱中，使其均匀沉降，用中性洗脱剂（石 油醚/乙醚，9:1，v/v)冲洗柱子2h，使柱子紧实。称取2. Og左右油脂，用中性洗脱剂溶解。 将样品沿柱壁缓缓加入层析柱内，先用500ml中性洗脱剂洗脱获得中性脂，再用极性洗脱 剂（甲醇）洗脱至硅胶柱发白，分别旋转蒸发得各分离组分。
[0043] 利用气相色谱分别检测总油脂、中性脂质和极性脂质中的脂肪酸分布情况，所述 的气相色谱分析方法采用如下方法：
[0044] 甲酯化方法：取0. 5g左右油脂，用正己烧定容至IOml ;用移液管移取Iml至IOml 容量瓶，加入3ml 0. 5mol/L的KOH-甲醇溶液，于65°C水浴15?20min，冷却；再加入2ml 8卩3-乙醚-甲醇溶液出?3-乙醚：甲醇=3:7，￥八），水浴651：，5?1〇1^11，冷却；再加饱和 NaCl溶液、正己烷各2ml，振荡后静置、分层，取上层至另一个容量瓶中，用正己烷萃取2-3 次后定容至IOml,取100 μ 1萃取液并加入100 μ 1十九烷酸甲酯（浓度已知）溶液混匀,可 用作DHA分析。
[0045] 气相分析条件：色谱柱：DB-23 (60m*0. 25mm*0. 25 μ m);检测器：FID ;载气：氮气； 分流比：30/1 ;进样口温度：250°C ;检测器温度：280°C ;进样量：1 μ I ;升温程序：初始柱温 为100°C，先以25°C /min的速度升至196°C，再以2°C /min的速度升至220°C，保持12min。 柱流速：3. Oml/min ;尾吹流速：30ml/min ;氢气流速：40ml/min ;空气流速：400ml/min。
[0046] 有益效果：本发明提供了一种磷脂型DHA的制备方法，在海洋真菌发酵产DHA的 基础上，采用双阶段发酵的方法，制备富含磷脂型DHA的油脂。得到的油脂中，极性脂占总 油脂百分含量为15% -40%，极性脂中DHA含量最高可达到48. 16%，其中大部分为磷脂型 DHA。而目前利用微生物发酵制备DHA油脂的研究主要是富集胞内的甘油酯，对磷脂的研究 很少，本专利提供的磷脂制备方法工艺简单，生产成本较低，且海洋真菌生长较快，更易于 扩大生产规模。因此，该方法的提出，有利于我们进一步研究磷脂型DHA的生理作用，有效 提高了 DHA产品的应用效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0047] 图1裂殖壶菌DHA单细胞油脂TLC分析：图I-A表明裂殖壶菌单细胞油脂中中性 脂主要由甘油三酯（TAG)、甘油二酯（DAG)和甘油单酯（MG)构成；将裂殖壶菌单细胞油脂 在极性展层剂中进行薄层分析，图I-B表明极性脂中以卵磷脂为主。
【具体实施方式】
[0048] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0049] 以下实施例中使用的产DHA的菌株为保藏号为CCTCC No :M209059的裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)〇
[0050] 实施例1 :第一阶段发酵制备富含甘油酯型DHA油脂。
[0051] 将保存在甘油管中的DHA菌种接入装有IOOml种子培养基的500ml摇瓶中，在摇 床上进行种子的活化，温度30°C，转速170rpm，培养24h，获得活力较高的种子液。按照同样 的方法活化三代后，将种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中，接种量10% (v/v)，通气量 0. 6vvm，搅拌转速200rpm，罐温30°C，加入消泡剂silicone SE-2,添加量为0. 3g/L，发酵培 养120h，得到富含甘油酯DHA油脂。发酵结果见表1。
[0052] 表1第一阶段发酵结果
[0053]
【权利要求】
1. 一种磷脂型DHA的发酵制备方法，其特征在于，它包括以下步骤： (1) 以产DHA的菌株为出发菌株，在液体培养基中进行高密度发酵，获得富含甘油脂型 DHA的菌体细胞； (2) 向步骤（1)高密度发酵结束后的发酵液中添加营养物质，继续发酵获得富含磷脂 型DHA的菌体细胞； (3) 收集步骤（2)得到的富含磷脂型DHA的菌体细胞，经破碎、萃取获得富含磷脂型 DHA的油脂； 其中，所述的营养物质为碳源、氮源、磷源、氨基酸的任意一种或几种的组合。
2. 根据权利要求1所述的磷脂型DHA的发酵制备方法，其特征在于，所述的产DHA的菌 株为破囊壶菌属、裂殖壶菌属、吾肯氏壶藻属。
3. 根据权利要求1所述的磷脂型DHA的发酵制备方法，其特征在于，步骤⑴中，所述 的高密度发酵包括如下步骤： (la) 将保存在甘油管中的菌株接入装有IOOml种子培养基的500ml摇瓶中，在20? 30°C的摇床中，以150?200rpm的转速，培养24?48h，获得一级种子液； (lb) 将步骤（la)得到的一级种子液按照2?10% v/v接种量接入装有IOOml种子培 养基的500ml摇瓶中，在20?30°C的摇床中，以150?200rpm的转速，培养24?48h，获 得二级种子液； (lc) 将步骤（Ib)得到的二级种子液按照2?10% v/v接种量接入装有IOOml种子培 养基的500ml摇瓶中，在20?30°C的摇床中，以150?200rpm的转速，培养24?48h，获 得三级种子液； (ld) 将步骤（Ic)中得到的三级种子液按照2?10% v/v接种量接入装有发酵培养 基的发酵罐中，然后向发酵罐中加入消泡剂，在通气量为0. 2?lvvm、搅拌速度为100? 200rpm、罐温为20?30°C的条件下培养90?150h，使菌株发酵产富含甘油酯型DHA的油 脂。
4. 根据权利要求3所述的磷脂型DHA的发酵制备方法，其特征在于，所述的种子培养基 的碳含量为10?30g/L，所述的发酵培养基碳含量为20?60g/L，氮含量为2. 1?2. 5g/L， 硫含量为2?3g/L，磷含量为0. 4?I. 5g/L ;上述培养基中，碳源为葡萄糖、果糖或甘油；氮 源为酵母膏、玉米浆、牛肉膏、蛋白胨、硝酸铵或硫酸铵；磷源为磷酸二氢钾或磷酸氢二钾， 硫源为硫酸镁或硫酸铵。
5. 根据权利要求3所述的磷脂型DHA的发酵制备方法，其特征在于，步骤（Id)中，所述 的消泡剂为silicone SE-2,添加量为0. 3g/L。
6. 根据权利要求1所述的磷脂型DHA的发酵制备方法，其特征在于，所述的碳源为乙 醇、乙酸钠中的任意一种或几种的混合物，碳源的添加量为2?4g/L ; 所述的氮源为酵母膏、硫酸铵、谷氨酸钠中的任意一种或几种的混合物，氮源的添加量 为 5 ?20g/L ; 所述的磷源为磷酸二氢钾，磷源的添加量为2?4g/L ; 所述的氨基酸为脯氨酸或赖氨酸，添加量为〇. 1?〇. 5g/L。
7. 根据权利要求1所述的磷脂型DHA的发酵制备方法，其特征在于，步骤⑵中，所述 的继续发酵条件为：通气量0. 5?lvvm，搅拌速度100?200rpm，罐温20?30°C，继续培 养48?72h。
8. 根据权利要求1所述的磷脂型DHA的发酵制备方法，其特征在于，步骤⑶具体过 程为：收集菌体细胞，采用破壁酶破碎细胞，再用有机溶剂萃提4?8h，得到富含磷脂型DHA 的油脂。
9. 根据权利要求8所述的磷脂型DHA的发酵制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为 正己烷、石油醚、乙醇和乙醚中的任意一种或几种的混合物，按照有机溶剂与破碎细胞液体 积比1:0. 5?2的量添加。
10. 根据权利要求8所述的磷脂型DHA的发酵制备方法，其特征在于，所述的破壁酶为 蛋白酶，添加量为2?8g/L。
【文档编号】C12R1/645GK104313068SQ201410547056
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月15日 优先权日:2014年9月3日
【发明者】黄和, 任路静, 赵晓艳, 庄小燕, 纪晓俊 申请人:江苏天凯生物科技有限公司