专利名称：一种利用水产品来制备混合型磷脂标准品的方法及其一种展开剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种磷脂的提取方法，更具体的说，涉及一种利用贝类水产品来制备混合型磷脂标准品的方法及其一种展开剂。
背景技术：
磷脂是极性脂肪的一类，其中磷脂包括磷脂酰胆碱(Wiosphatidylcholine，PC)、 磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine, PE)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol, PI)、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserin^PS)以及各种溶血磷脂等。研究发现磷脂类物质对于心脑血管疾病的预防有着积极的作用，例如DHA-PS能够促进婴幼儿的大脑发育以及缓解阿尔茨默病，因此吸引了众多科研工作者们对磷脂的提取、鉴定及纯化进行研究，但研究过程中往往需要大量资金来购买各种磷脂单一标准品进行定性或定量分析，目前国内外同时含有几种磷脂的混合标准品产品尚没有出现。另外目前各种磷脂单一标准品基本上是采用酶合成的方法进行制备，造成成本偏高。因此，发明一种成本低、方法简单且能够同时含有几种磷脂物质的混合标准品意义非常大，不仅仅降低了标准品的生产成本，同时也方便科学研究工作的开展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一在于针对现有磷脂单一标准品所存在的问题而提供一种利用水产品来制备混合型磷脂标准品的方法，该方法所制备的混合型磷脂标准品包括磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺，适合于对磷脂的定性研究工作。本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种用于混合型磷脂标准品薄层色谱分析的展开剂。为实现本发明的目的，本发明所采用的技术方案是一种利用贝类水产品来制备混合型磷脂标准品的方法，该方法包括以下步骤(a)将采购的贝类去壳、清洗，然后将贝肉水分浙干或者进行简单吸水处理；(b)将贝肉进行破碎勻浆处理，勻浆尽量充分；(c)将贝肉勻浆加入到其重量5 20倍的氯仿-甲醇混合溶液中，在0°C 30°C 下，充分搅拌5 4 得贝肉浆液，(d)将搅拌好的贝肉浆液经滤膜抽滤，然后将滤液旋转蒸干；(e)将蒸干后的物质采用体积比为2 2 1.8的氯仿-甲醇-水进行再次提取， 静置分层后，收集氯仿层或将氯仿层蒸干，即为含有磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺的溶液状或固体状混合型磷脂标准品。所述贝类水产品为海水贝或淡水贝。所述海水贝优选为小文蛤、大文蛤、牡蛎或蛤蜊。
所述淡水贝优选为螺蛳、河蛘或中华圆田螺。在所述步骤(C)中，所述氯仿-甲醇混合溶液中，氯仿与甲醇的体积比为2 1。在所述步骤(d)中，所述滤膜规格为0. 2 μ m或0. 45 μ m。在本发明的优选实施例中，步骤(d)中，旋转蒸干过程中旋转蒸发仪的水浴温度不超过50°C。本发明的混合型磷脂标准品可以用目前比较常规的薄层色谱分析展开剂将所要分析的磷脂有效分离，如体积比为20 30 20 30 20 30 7-13 6 12的氯仿-乙酸乙酯-正丙醇-甲醇-水的展开剂。但是本发明优选的展开剂为体积比为20 30 20 30 20 30 7-13 6 12的氯仿-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水的展开剂，更优选为体积比为25 25 25 10 9的氯仿-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水的展开剂。本发明的混合型磷脂标准品的制备方法，以海水贝和淡水贝为原料，方法简单，原料丰富，成本较低，经济效益较大。该混合型磷脂标准品含有磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺，适合科研人员对磷脂成分的定性分析。
图1为几种商业化磷脂的单一标准品和采用牡蛎为原料按本发明方法制备的一种混合型磷脂之薄层色谱图。PI为磷脂酰肌醇，购于美国Sigma公司，PC、PE和PS分别为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸，均购于瑞典Larodan公司；牡蛎来自于广东。展开剂为体积比为25 25 25 10 9的氯仿-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水，显色剂为单质碘。图2为采用海水贝类为原料按本发明方法制备的几种混合型磷脂之薄层色谱图。 小文蛤来自江苏、大文蛤分别来自辽宁和山东、蛤蜊来自江苏和山东。展开剂为体积比为 25 25 25 10 9的氯仿-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水，显色剂为10%的磷钼酸乙醇溶液，显色温度为110°C。图3为采用淡水贝类为原料按本发明方法制备出的几种混合型磷脂标准品之薄层色谱图。螺蛳、河蛘、中华圆田螺分别来自于上海。展开剂为体积比为 25 25 25 10 9的氯仿-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水，显色剂为15%的磷钼酸乙醇溶液，显色温度为120°C。
具体实施例方式下面结合实施例进一步说明本发明。所述牡蛎来自广东，所述大文蛤分别来自辽宁和山东，所述小文蛤来自江苏，所述蛤蜊分别来自江苏和山东，所述螺蛳、河蛘与中华圆田螺均来自上海。实施例1将牡蛎去壳、清洗，并将肉进行浙干处理，称取25g贝肉，采用高速勻浆机将其进行破碎处理并放于锥形瓶中，加入250ml的2 1氯仿-甲醇溶液搅拌他后经0.2 μ m滤膜抽滤，将滤液进行旋转蒸发，水浴温度为35°C，将蒸干后的物质采用体积比为2 2 1.8 的氯仿-甲醇-水进行再次提取，静置分层后，收集氯仿层。然后将其进行薄层色谱分析，展开剂为25 25 25 10 9的氯仿-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水，显色剂为单质碘。结果如图1所示，标准板进行比对，发现牡蛎混合磷脂含有磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、 磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺，而且各个条带清晰可见。实施例2将大文蛤(从左到右分别来自辽宁和山东)去壳、清洗，并将肉进行浙干处理，称取30g贝肉，采用高速勻浆机将其进行破碎并放于锥形瓶中，加入250ml的2 1氯仿-甲醇溶液搅拌IOh后经0. 2 μ m滤膜抽滤，将滤液进行旋转蒸发，水浴温度为35°C，将蒸干后的物质采用体积比为2 2 1.8的氯仿-甲醇-水进行再次提取，静置分层后，收集氯仿层。 然后将其进行薄层色谱分析，展开剂为25 25 25 10 9的氯仿-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水，显色剂为10%的磷钼酸乙醇溶液，显色温度为110°C。结果如图2所示，与标准板进行比对，发现大文蛤混合磷脂含有磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺，而且各个条带清晰可见。实施例3将蛤蜊(从左到右分别来自江苏和山东)去壳、清洗，并将肉进行浙干处理，称取 25g贝肉，采用高速勻浆机将其进行破碎并放于锥形瓶中，加入300ml的2 1氯仿-甲醇溶液搅拌1 后经0. 45 μ m滤膜进行抽滤，将滤液进行旋转蒸发，水浴温度为45°C，将蒸干后的物质采用体积比为2 2 1.8的氯仿-甲醇-水进行再次提取，静置分层后，收集氯仿层。然后将其进行薄层色谱分析，展开剂为25 25 25 10 9的氯仿-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水，显色剂为10%的磷钼酸乙醇溶液，显色温度为110°C。结果如图2 所示，标准板进行比对，发现蛤蜊混合磷脂含有磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺，而且各个条带清晰可见。实施例4将小文蛤去壳、清洗，并将肉进行浙干处理，称取25g贝肉，采用高速勻浆机将其进行破碎并放于锥形瓶中，加入375ml的2 1氯仿-甲醇溶液搅拌IMi后经0. 45 μ m 滤膜进行抽滤，将滤液进行旋转蒸发，水浴温度为35°C，将蒸干后的物质采用体积比为 2:2: 1.8的氯仿-甲醇-水进行再次提取，静置分层后，收集氯仿层。然后将其进行薄层色谱分析，展开剂为25 25 25 10 9的氯仿-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水，显色剂为10%的磷钼酸乙醇溶液，显色温度为110°C。结果如图2所示，与标准板进行比对， 发现小文蛤混合磷脂含有磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺，而且各个条带清晰可见。实施例5将螺蛳、中华圆田螺与河蛘去壳、清洗，并将肉进行浙干处理，称取20g贝肉，采用高速勻浆机将其进行破碎并放于锥形瓶中，加入250ml的2 1氯仿-甲醇溶液搅拌20h 后经0. 45 μ m滤膜进行抽滤，将滤液进行旋转蒸发，水浴温度为45°C，将蒸干后的物质采用体积比为2 2 1.8的氯仿-甲醇-水进行再次提取，静置分层后，收集氯仿层。然后将其进行薄层色谱分析，展开剂为25 25 25 10 9的氯仿-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水，显色剂为15%的磷钼酸乙醇溶液，显色温度为120°C。结果如图3所示，与标准板进行比对，发现所挑选每一种淡水贝的混合磷脂均含有磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺，而且各个条带清晰可见。
权利要求
1.一种利用贝类水产品来制备混合型磷脂标准品的方法，其特征在于，包括以下步骤(a)将采购的贝类水产品去壳、清洗，然后将贝肉水分浙干或者进行简单吸水处理；(b)将贝肉进行破碎并进行勻浆处理，勻浆尽量充分；(c)将勻浆处理的贝肉加入到其重量5 20倍的氯仿-甲醇混合溶液中，在0°C 30°C 下，充分搅拌5 4 得贝肉浆液；(d)将搅拌好的贝肉浆液经滤膜抽滤，然后将滤液旋转蒸干；(e)将蒸干后的物质采用体积比为2 2 1.8的氯仿-甲醇-水进行再次提取，静置分层后，收集氯仿层或将氯仿层蒸干，即为含有磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺的溶液状或固体状混合型磷脂标准品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述贝类水产品为海水贝或淡水贝。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述海水贝优选为小文蛤、大文蛤、牡蛎或蛤蜊。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述淡水贝优选为螺蛳、河蛘或中华圆田螺。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(c)中，所述氯仿-甲醇混合溶液中，氯仿与甲醇的体积比为2 1。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(d)中，所述滤膜规格为0.2μπι 或 0. 45 μ m0
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)中，旋转蒸干过程中旋转蒸发仪的水浴温度不超过50°C。
8.一种用于权利要求1所述的混合型磷脂标准品薄层色谱分析的展开剂，其特征在于，所述展开剂为体积比为20 30 20 30 20 30 7-13 6 12的氯仿-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水的混合物。
9.根据权利要求8所述的展开剂，其特征在于，所述展开剂为体积比为 25 25 25 10 9的氯仿-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水的混合物。
全文摘要
本发明公开的一种利用贝类来制备混合型磷脂标准品的方法，包括以下步骤(a)将贝类去壳、清洗，然后将贝肉水分沥干或者进行简单吸水处理；(b)将贝肉进行破碎处理；(c)将捣碎的贝肉加入到其重量5～20倍的氯仿-甲醇混合溶液中，在0℃～30℃下，充分搅拌5～48h；(d)将搅拌好的贝肉浆液经滤膜抽滤，然后将滤液旋转蒸干；(e)将蒸干后的物质采用体积比为2∶2∶1.8的氯仿-甲醇-水进行再次提取，静置分层后，收集氯仿层或将氯仿层蒸干，即为含有磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺的溶液状或固体状混合型磷脂标准品。本发明以海水贝和淡水贝为原料，方法简单，原料丰富，成本较低，经济效益较大。该混合型磷脂标准品含有磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺，适合科研人员对磷脂成分的定性分析。
文档编号G01N30/94GK102564825SQ20121000175
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者刘承初, 李家乐, 李阅兵 申请人:上海海洋大学