一种无磷脂纳米盘的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种无憐脂纳米盘的制备方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 膜蛋白是指能够结合或整合到细胞膜或细胞器膜上的蛋白质的总称。在所有已知 蛋白中，膜蛋白差不多占据了 40%。包括受体，通道蛋白，信号分子，是细胞通信所必需的， 其在细胞中含量丰富，膜蛋白是生物膜功能的主要执行者，在物质转运，细胞信息识别等方 面行使重要功能；如果膜蛋白功能失效，则会导致很多疾病。目前已知的药物祀点蛋白中， 60%为膜蛋白[WallinE,VonHeijneG.Genome-wideanalysisofintegralmembrane proteinsfromeubacterial，archaean，andeukaryoticorganisms.ProteinSci.1998 ; 7:1029 - 1038;CzerskiL，SandersC.R.Anal.Biochem. 2000 :284:327. ;Hu,Y.，Y.Li,X. Zhang,X.Guo,B.Xia,andC.Jin. 2006.Solutionstructuresandbackbonedynamicsof aflavodoxinMioCfromEscherichiacoliinbothapo-andholo-forms.J.Biol. Chem. 281:35454 - 35466.]。
[0003] 在体外，膜蛋白需要维持脂双层膜或类脂环境才可W保持其活性状态，运对于膜 蛋白的结构和功能研究，药物的开发和筛选都是及其重要的。但在体外很难模拟运种环境。
[0004] 憐脂纳米盘（NanodiSC)是由高密度脂蛋白发展而来的用于膜蛋白研究的新型类 膜结构，该体系采用双亲性蛋白在水相中稳定憐脂分子，从而形成憐脂双层膜的类细胞膜 结构，整合进入其中的膜蛋白可W在近似天然膜环境中保持生物活性，从而为进一步研究 提供了平台。组装憐脂纳米盘（Nanodisc)时，首先将膜蛋白骨架蛋白（MembraneScafTold Protein,MS巧按照比例与预先溶解在去污剂（通常是胆酸钢）中的憐脂混合。经一定时 间解育，利用透析或疏水吸附剂，如Bio-BeadsSM-2度io-Rad，Hercules,CA)去除去污剂， 自组装形成憐脂纳米盘（Nanodisc)阳athA.,AtkinsW.M.,SligarS.G.Applicationsof phospholipidbilayernanodiscsinthestudyofmembranesandmembraneproteins. Biochemistry. 2007 :46:2059 - 2069. ]D组装包含膜蛋白的5葬脂纳米盘（Nanodisc)只需在 体系中再加入适量膜蛋白。离子通道蛋白，GPCRs，转运蛋白和细胞色素P450等膜蛋白已 成功的与憐脂纳米盘（Nanodisc)组装起来该体系还具有可溶，稳定和尺寸可控等优点。因 此，憐脂纳米盘（Nanodisc)体系将会成为膜蛋白研究的重要载体。 阳〇化]然而传统的制备方法组装步骤比较繁琐，并且会造成蛋白质的损失。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种无憐脂纳米盘的制备方法，W解决上述问题。
[0007] 本发明采用了如下技术方案：
[0008] 一种无憐脂纳米盘的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0009] 步骤一、在膜蛋白纯化阶段加入类憐脂去污剂；
[0010] 步骤二、在完成膜蛋白纯化后，加入膜蛋白骨架蛋白，用混匀器混匀，恒溫解育预 定时间；
[0011] 步骤=、经分子筛和亲和层析纯化后浓缩，收集所得产物。
[0012] 进一步，本发明的无憐脂纳米盘的制备方法，还可W具有运样的特征：其中，所述 膜蛋白骨架蛋白为ApolipoproteinA-1，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示，其编码基因序 列如沈QIDNO. 2所示。
[0013] 进一步，本发明的无憐脂纳米盘的制备方法，还可W具有运样的特征：其中，所述 类憐脂去污剂为FOS-CHOLI肥，其C链含有8-16个C。
[0014] 进一步，本发明的无憐脂纳米盘的制备方法，还可W具有运样的特征：其中，所述 膜蛋白和所述膜蛋白骨架蛋白的摩尔比为1:2-1:20。
[0015] 进一步，本发明的无憐脂纳米盘的制备方法，还可W具有运样的特征：其中，所述 恒溫解育的溫度为0-37°C。
[0016] 较佳的，本发明的无憐脂纳米盘的制备方法，还可W具有运样的特征：其中，所述 恒溫解育的溫度为4-20°C。
[0017] 进一步，本发明的无憐脂纳米盘的制备方法，还可W具有运样的特征：其中，所述 预定时间为1-化。
[0018] 发明的有益效果
[0019] 根据本发明的无憐脂纳米盘的制备方法，由于直接采用类憐脂去污剂提纯膜蛋 白，然后在膜蛋白纯化后加入膜蛋白骨架蛋白，因此免去了憐脂纳米盘（NanodiSC)制 备过程中预先将憐脂溶解在去污剂（通常是胆酸钢）中，将膜蛋白骨架蛋白（Membrane ScafToldProtein,MS巧按照比例与预先溶解在去污剂（通常是胆酸钢）中的憐脂混合W 及利用透析或疏水吸附剂，如Bio-BeadsSM-2度io-Rad，Hercules,CA)去除去污剂运S个 步骤。使得无憐脂纳米盘的制备步骤大大简化，同时还避免了膜蛋白的损失。
【附图说明】
[0020] 图1是实施例S得到的无憐脂纳米盘的电镜照片。
【具体实施方式】
[0021] 为了本领域的技术人员能够更好地理解本发明所提供的技术方案，下面结合具体 实施例进行阐述。W下各实施例所用的试剂，如无特别说明，则均可通过公开的商业渠道购 买而获取。W下各实施例所使用的实验方法如无特别说明，则均按照生物学常用的实验方 法进行。 W22] 实施例一
[0023] 在膜蛋白纯化阶段加入类憐脂去污剂化S-化01ine-8，在完成膜蛋白纯化后，加入 膜蛋白骨架蛋白MembraneScafToldProtein(MSP)。反应溶液中膜蛋白和膜蛋白骨架蛋 白的摩尔比为1 :2,用混匀器混匀，4°C恒溫解育比，经分子筛和亲和层析纯化后浓缩，收集 所得产物，通过透射电镜观察所得产物呈现圆盘状结构，直径5-10皿。化S-化oline-8的 碳链含有8个C。膜蛋白纯化所述使用的细胞有两类，分别是：昆虫细胞：如S巧或者化曲 Five;或者哺乳动物细胞：如293F。运几种细胞均可通商业渠道购买得到。当然，也可W使 用本领域常用的其它种类的细胞作为膜蛋白的来源。化S-化oline-14的碳链含有14个C。 W24] 实施例二
[00巧]在膜蛋白纯化阶段加入类憐脂去污剂化S-化oline-10,在完成膜蛋白纯化后， 加入膜蛋白骨架蛋白。摩尔比为1 :6,用混匀器混匀，8°C恒溫解育化，经分子筛和亲和层 析纯化后浓缩，收集所得产物，通过透射电镜观察所得产物呈现圆盘状结构，直径5-10皿。 化S-Choline-IO的碳链含有10个C。 阳0%] 实施例S
[0027] 在膜蛋白纯化阶段加入类憐脂去污剂化S-化oline-14,在完成膜蛋白纯化后，加 入膜蛋白骨架蛋白。膜蛋白和膜蛋白骨架蛋白的摩尔比为1 :8,用混匀器混匀，4°C恒溫解 育化，经分子筛和亲和层析纯化后浓缩，收集所得产物。通过透射电镜观察所得产物呈现圆 盘状结构，直径5-lOnm。如图1所示，图中箭头A所指处即为使用本实施方式制备得到的纳 米盘之一。 阳0測实施例四
[0029] 在膜蛋白纯化阶段加入类憐脂去污剂化S-化oline-12,在完成膜蛋白纯化后，加 入膜蛋白骨架蛋白。摩尔比为1 :1〇,用混匀器混匀，10°c恒溫解育化，经分子筛和亲和层 析纯化后浓缩，收集所得产物，通过透射电镜观察所得产物呈现圆盘状结构，直径5-lOnm。 化s-Choline-12的碳链含有12个Co W30] 实施例五
[0031] 在膜蛋白纯化阶段加入类憐脂去污剂化S-化oline-14,在完成膜蛋白纯化后，加 入膜蛋白骨架蛋白（MembraneScafToldProtein,MSP)。摩尔比为1:12,用混匀器混匀， 12°C恒溫解育化，经分子筛和亲和层析纯化后浓缩，收集所得产物，通过透射电镜观察所得 产物呈现圆盘状结构，直径5-10皿。化S-化oline-14的碳链含有14个C。 阳0巧 实施例六
[0033] 在膜蛋白纯化阶段加入类憐脂去污剂化S-化oline-16,在完成膜蛋白纯化后，加 入膜蛋白骨架蛋白（MembraneScafToldProtein,MSP)。摩尔比为1:16,用混匀器混匀， 16°C恒溫解育化，经分子筛和亲和层析纯化后浓缩，收集所得产物，通过透射电镜观察所得 产物呈现圆盘状结构，直径5-10皿。化S-化oline-16的碳链含有16个C。 W34] 实施例屯
[0035] 在膜蛋白纯化阶段加入类憐脂去污剂化S-化oline-14,在完成膜蛋白纯化后，加 入膜蛋白骨架蛋白（MembraneScafToldProtein,MSP)。摩尔比为1:20,用混匀器混匀， 20°C恒溫解育地，经分子筛和亲和层析纯化后浓缩，收集所得产物，通过透射电镜观察所得 产物呈现圆盘状结构，直径5-10皿。化S-化oline-14的碳链含有14个C。
[0036]W上各实施例中，ApolipoproteinA-I是指：载脂蛋白A-I。
[0037] FOS-CHOLI肥是指：F0S-CH0LIN是个商品名，是运一类去污剂的统称。其中，FOS-CHOLI肥-12 :十二烷基憐酸胆碱；FOS-CHOLI肥-8:辛基憐酸胆碱；FOS-CHOLI肥-14: 十四烷基憐酸胆碱；FOS-CHOLI肥-10癸基憐酸胆碱。
[0038]
【主权项】
1. 一种无磷脂纳米盘的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一、在膜蛋白纯化阶段加入类磷脂去污剂； 步骤二、在完成膜蛋白纯化后，加入膜蛋白骨架蛋白，用混匀器混匀，恒温孵育预定时 间； 步骤三、经分子筛和亲和层析纯化后浓缩，收集所得产物。2. 如权利要求1所述的无磷脂纳米盘的制备方法，其特征在于： 其中，所述膜蛋白骨架蛋白为ApolipoproteinA-Ι，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示， 其编码基因序列如SEQIDNO. 2所示。3. 如权利要求1所述的无磷脂纳米盘的制备方法，其特征在于： 其中，所述类磷脂去污剂为F0S-CH0LINE，其C链含有8-16个C。4. 如权利要求1所述的无磷脂纳米盘的制备方法，其特征在于： 其中，所述膜蛋白和所述膜蛋白骨架蛋白的摩尔比为1:2-1:20。5. 如权利要求1所述的无磷脂纳米盘的制备方法，其特征在于： 其中，所述恒温孵育的温度为0-37 °C。6. 如权利要求5所述的无磷脂纳米盘的制备方法，其特征在于： 其中，所述恒温孵育的温度为4-20°C。7. 如权利要求1所述的无磷脂纳米盘的制备方法，其特征在于： 其中，所述预定时间为l-6h。
【专利摘要】本发明提供一种无磷脂纳米盘的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、在膜蛋白纯化阶段加入类磷脂去污剂；步骤二、在完成膜蛋白纯化后，加入膜蛋白骨架蛋白，用混匀器混匀，恒温孵育预定时间；步骤三、经分子筛和亲和层析纯化后浓缩，收集所得产物。本发明的方法省去了传统方法中，将磷脂溶解在去污剂中、将膜蛋白骨架蛋白按照比例与预先溶解在去污剂中的磷脂混合以及利用透析或疏水吸附剂去除去污剂这三个步骤。使得无磷脂纳米盘的制备步骤大大简化，同时还避免了膜蛋白的损失。
【IPC分类】C07K14/705, C07K1/22
【公开号】CN105294855
【申请号】CN201510824261
【发明人】沈坚, 郭政, 李卫华, 金美辰, 苏晓燕, 韩敏, 李子娟, 钱冬明, 蔡建华, 任德林, 毛晨
【申请人】维亚生物科技(上海)有限公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月24日