大豆事件127和与其相关的方法
【专利说明】大豆事件127和与其相关的方法
[0001] 本申请为分案申请，原申请的申请日为2010年01月06日，申请号为 201080011786. 7 (PCT/US2010/020252)，发明名称为"大豆事件127和与其相关的方法"。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求保护2009年1月7日提交的美国专利临时申请号61/143, 049的权益， 所述申请的全部内容在此引作参考。
[0004] 经由EFS-WEB提呈的序列表的引用
[0005] 本申请经由EFS-Web电子提交，包括以文本文档格式电子提交的序列表。该文本 文档文件含有在2010年1月5日创建的标题为" 1378358. txt"的序列表，为47, 052个字 节大小。该文本文档文件中含有的序列表是本说明书的部分，在此以其整体引作参考。
[0006] 领域
[0007] 本发明一般涉及分子生物学，涉及用于提高植物对抑制乙酰羟酸合成酶的除草剂 的耐受性的组合物及方法和用于杂草控制的组合物及方法。
[0008] 背景
[0009] 大豆（Glycine max)在世界上很多地区是重要作物。已将生物技术方法应用于大 豆以改进农学性状和产物质量。在大豆生产中重要的一种这类农学性状是对除草剂的耐受 性，尤其是对草甘膦除草剂的耐受性。随着草甘膦耐受性大豆使用的扩展，耐受草甘膦的杂 草也出现了。因此，为了控制杂草，需要耐受除草甘膦外的除草剂的大豆植物。
[0010] 植物例如大中转基因（例如提供除草剂耐受性的转基因）的表型表达，受到基 因本身结构及其在植物基因组中的整合位置二者的影响。同时，基因组中不同位置的转基 因（在外来DNA中）的存在，将以不同方式影响植物的总体表型。通过基因操作在农艺方 面或工业方面成功地将商业上感兴趣的性状引入植物中，可能是取决于不同因素的漫长过 程。遗传转化的植物实际上的转化和再生仅是一系列选择步骤的开始，所述一系列选择步 骤包括大量遗传表征、育种和田间试验评估，最终通向选择优良事件（event)。
[0011] 因为在作物改良中增加了遗传修饰的使用以改进转基因向商业品种的基因渗入， 所以明确地检测和/或鉴定特定转基因事件的能力越来越重要，以便分开GM0和非GM0产 品及鉴定专有物质。仍然需要开发既快速又简单不需大量实验室设备的方法，用于检测特 定转基因事件。另外，用于检测特定事件的方法在以下方面将有益：遵从规则，所述规则要 求对源自重组作物植物的食品进行预先市场批准和标记；或用于环境监测、野外作物性状 监测或来自作物收获物的产品的监测；以及用于确保受监管条款或合同条款管辖的各方遵 守。
[0012] 简述
[0013] 在一个实施方案中，本发明提供用于在栽培区控制杂草的方法，所述方法包括：将 有效量的非选择性除草剂施用于具有包含事件127核酸分子的大豆植物的栽培区。
[0014] 在另一实施方案中，本发明提供用于控制作物田（crop field)中耐受草甘膦的杂 草的方法，所述方法包括：将有效量的抑制AHAS的除草剂施用于具有包含事件127核酸分 子的大豆植物的作物田。
[0015] 在又一实施方案中，本发明提供具有SEQ ID NO :1的1312-6069位核酸序列的分 尚的核酸分子。
[0016] 在另一实施方案中，本发明亦提供具有异源核酸分子的转基因大豆植物，所述异 源核酸分子具有SEQ ID N0 :1的核苷酸1302-6079的核酸序列。
[0017] 本发明亦提供分离的核酸引物对，所述核酸引物对包含能够扩增事件127核酸分 子的第一和第二分离的核酸分子。
[0018] 在另一实施方案中，本发明提供用于鉴定生物学样品中的事件127核酸分子的试 剂盒，所述试剂盒包括第一和第二核酸引物，其中第一和第二核酸引物能够扩增事件127 核酸分子。
[0019] 本发明亦提供用于鉴定事件127大豆植物的方法，所述方法包括：(a)形成混合 物，所述混合物包含含有大豆DNA的生物学样品和能够扩增事件127特异性核酸分子的第 一和第二核酸引物；(b)在允许第一和第二核酸引物扩增事件127特异性核酸分子的条件 下，让混合物反应；和（c)检测扩增的片段核酸分子的存在情况，其中存在大豆事件127特 异性核酸分子，表明大豆植物为事件127大豆植物。
[0020] 在再一实施方案中，本发明提供用于鉴定具有事件127核酸分子的大豆植物的方 法，所述方法包括：（a)形成混合物，所述混合物包含含有大豆DNA的生物学样品和能够与 事件127特异性核酸分子杂交的核酸分子探针；(b)在允许核酸分子探针与事件127特异 性核酸分子杂交的条件下，让混合物反应；和（c)检测所述探针与DNA的杂交情况，其中存 在核酸分子探针与大豆DNA的杂交表明存在事件127核酸分子。
[0021] 本发明进一步提供用于提高包含事件127核酸分子的大豆植物的产量的方法，所 述方法包括：将有效量的抑制AHAS的除草剂施用于一种或多种包含事件127核酸分子的大 豆植物和周围区域，其中所述抑制AHAS的除草剂减少周围区域的杂草生长；和从所述一种 或多种大S?植物收获种子。
[0022] 在另一实施方案中，本发明提供用于对耐受抑制AHAS的除草剂的大豆植物进行 育种的方法，所述方法包括：(a)让包含事件127核酸分子的大豆植物与第二种大豆植物杂 交；(b)从步骤（a)的杂种获得种子；（c)从所述种子获得DNA样品；和（d)检测样品中事 件127核酸分子的存在情况，其中存在事件127核酸分子表明所述种子能够产生耐受抑制 AHAS的除草剂的大豆植物。
[0023] 本发明亦提供包含事件127核酸分子的大豆植物的种子。
[0024] 在又一实施方案中，本发明提供用于检测生物学样品中事件127核酸分子的存在 情况的方法，所述方法包括：（a)形成混合物，所述混合物包含含有DNA的生物学样品和能 够扩增事件127特异性核酸分子的第一和第二核酸引物；(b)在允许第一和第二核酸引物 扩增包含事件127特异性核酸分子的核酸分子的条件下，让混合物反应；和（c)检测扩增的 核酸分子的存在情况，其中存在事件127特异性核酸分子表明样品含有事件127核酸分子。
[0025] 在另一实施方案中，本发明提供用于检测生物学样品中的事件127核酸分子的方 法，所述方法包括：(a)形成混合物，所述混合物包含含有DNA的生物学样品和能够与事件 127特异性核酸分子杂交的核酸探针；(b)在允许探针与事件127特异性核酸分子杂交的条 件下，让混合物反应；和（c)检测杂交的核酸分子的存在情况，其中存在事件127特异性核 酸分子表明样品含有事件127核酸分子。
[0026] 本发明亦提供用于检测生物学样品中事件127插入核酸分子的存在情况的方法， 所述方法包括：(a)形成混合物，所述混合物包含含有DNA的生物学样品和能够扩增事件 127插入核酸分子的第一和第二引物；(b)在允许第一和第二核酸引物扩增包含事件127插 入核酸分子的核酸分子的条件下，让混合物反应；和（c)检测扩增的核酸分子的存在情况， 其中存在事件127插入核酸分子表明样品含有事件127插入DNA。
[0027] 在再一实施方案中，本发明提供用于检测生物学样品中事件127插入核酸分子的 存在情况的方法，所述方法包括：(a)形成混合物，所述混合物包含含有DNA的生物学样品 和能够与事件127插入核酸分子区退火的第一引物和能够与宿主细胞基因组中的侧翼核 酸分子退火的第二引物；(b)在允许第一和第二核酸引物产生包含事件127插入核酸分子 片段的扩增核酸分子的条件下，让混合物反应；和（c)检测扩增的核酸分子的存在情况，其 中存在事件127插入核酸分子片段表明样品含有事件127插入DNA。
[0028] 在另一实施方案中，本发明提供用于栽培大豆植物的方法，所述方法包括：(a)提 供包含事件127核酸分子的大豆种子；(b)在允许种子发芽以产生生长中的包含事件127 核酸分子的大豆植物的条件下，将大豆种子种植在生长培养基中；和（c)让生长培养基、种 子或植物与包含至少一种选自以下的组分的除草剂组合物接触：咪唑啉酮除草剂、磺酰脲 除草剂、其彼此的组合及其与至少一种其它活性成分的组合。
[0029] 在又一实施方案中，本发明提供用于检测样品中的事件127多肽的方法，所述方 法包括：从大豆植物获得生物学样品；和对样品进行至少一种免疫学测定，其中所述测定 能够检测事件127多肽。
[0030] 本发明亦提供用于检测生物分子的装置，所述装置包括：具有表面的固相支持体； 和至少一种与固相支持体表面连接的事件127诊断分子。
[0031] 附图简述
[0032] 图1A提供质粒pAC321的示意图。图1B提供用于转化的含有AHASL 5'UTR、csrl-2 编码序列和AHASL 3'UTR的pAC321的PvuII片段的示意图。标明了用于拷贝数、缺乏主链 和两代间的稳定性的DNA印迹分析的限制性酶位点（Ncol、Xbal、Spel)。
[0033] 图2提供大豆事件127植物的一个实例的育种历史的示意图。
[0034] 图3提供pAC321PvuII转化片段与大豆事件127插入物的比对的示意图。
[0035] 图4A-4C提供实施例3中所述的大豆事件127植物的一个实例中插入物拷贝数的 DNA印迹杂交结果。图4D提供用于杂交实验的探针的相对位置的示意图。
[0036] 图5提供显示在实施例3中所述的大豆事件127植物的一个实例中缺乏载体主链 序列的DNA印迹杂交结果。图5A提供用探针VP1的结果，图5B提供用探针VP2的结果。图 5C提供127事件序列上的杂交