检测rs632793位点的方法及冠心病左心室收缩功能不全相关基因的检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地，涉及人心房钠肽/脑钠肽（NPPA/ NPPB gene)的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP)位点 rs632793 及 其与左心室收缩功能相关性的检测。本发明还涉及检测这个SNP位点的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 心力衰竭是危害全球人类健康的主要疾病之一，具有高死亡率，高发病率，高住院 率和高住院费用的特点。左心室收缩功能不全(左心室射血分数< 45%)是充血性心力衰竭 发生的早期阶段，对左心室收缩功能不全的风险预测和评估有助于延缓心力衰竭的进程， 改善心力衰竭病人的生活质量和预后。冠心病是造成左心室收缩功能不全最主要的病因之 一。在冠心病病人中，左心室收缩不全的临床表现尤为严重，可迅速进展为心力衰竭，预后 极差。目前迫切需要发现冠心病病人发生左心室收缩功能不全的风险预测指标和预后评估 革巴点。
[0003] 随着分子医学的发展，左心室收缩功能不全认为是遗传因子和环境共同作用的结 果。对于环境因素的控制虽然在一定程度上可延缓左心室收缩不全的发病和预后，但对于 固有的遗传因素的认识不足极大地妨碍了对左心室收缩功能不全的研究和判断。
[0004]目前研究表明左心室收缩功能不全及其随后心力衰竭的发生是由一系列神 经-体液因素参与。其中，利钠肽家族扮演重要角色。利钠肽家族是一组由心肌细胞分泌 的激素，具有相似的化学结构和生理学效应，主要包括调节血压，抗心肌肥厚，抗心力衰竭 等作用。De Bold等通过电子显微镜首次发现心房肌细胞分泌的颗粒中包含心房利钠肽 (ANP) [de Bold AJ, Borenstein HB, Veress AT, et al. A rapid and potent natriuretic response to intravenous injection of atrial myocardial extract in rats. Life Sci，1981，28(1) :89-94.]。随后另一利钠肽家族成员-脑钠肽（BNP)在猪脑中发现。ANP和 BNP的作用相似，基因位置毗邻，形成NPPA-NPPB基因座。NPPA基因（GeneID4878)缺失小 鼠血压显著升高，心肌肥厚增加。NPPB基因（GeneID4879)缺失小鼠心肌广泛纤维化。BNP 与其终末端结构（NT-proBNP)升高被公认为左心室功能障碍和心力衰竭的预测指标。
[0005] 尽管如此，对于利钠肽家族是否对冠心病病人发生左心室收缩功能不全的风险评 估目前尚无定论，这正是当前研究左心室收缩功能不全的主要方向之一。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种NPPA/NPPB基因座启动子的单核苷酸多态性基因型的 方法。
[0007] 本发明的另一个目的是提供一种NPPA/NPPB基因座启动子的单核苷酸多态性基 因型的检测试剂盒。
[0008] 本发明的再一个目的是提供一种NPPA/NPPB基因座启动子的单核苷酸多态性基 因型的检测试剂盒的应用。根据NPPA/NPPB基因座启动子的单核苷酸多态性基因型的分型 结果，可以用于辅助预测或者判断冠心病患者的左心室收缩功能不全的易感性。
[0009] 本发明提供了一种检测NPPA/NPPB基因座启动子的单核苷酸多态性基因型的方 法，该方法包括步骤：
[0010] 用NPPA/NPPB基因座启动子的特异性引物扩增样品的基因组DNA，得到扩增产物；
[0011] 和
[0012] 检测（a)所得的扩增产物中单核苷酸多态性位点rs632793的基因。
[0013] 所述的单核苷酸多态性的位点是rs632793。
[0014] rs632793位于NPPA/NPPB基因座启动子中，片段重叠群contig :NT_021937. 18位 置 6448044A/G。
[0015] 其中，脱氧核糖核酸（DNA)序列编号：rs632793位置基于SEQ ID N0 :1/6 ;扩增产 物基于 SEQ ID N0 :6/6。
[0016] 所述的NPPA/NPPB基因座启动子的特异性引物的序列如SEQ ID N02和SEQ ID N03 所示。
[0017] 在本发明的一个实施例中，扩增反应时，退火/延伸的温度为60°C。更好的，在扩 增反应的标准反应中，退火和延伸的步骤均为：60°C，30秒。
[0018] 所述的扩增产物的序列如SEQ IDN06所示。
[0019] 所述的方法包括利用与位点rs632793结合的探针检测NPPA/NPPB基因座启动子 的单核苷酸多态性基因型。
[0020] 第二方面，本发明还提供了一种针对冠心病病人左心室收缩功能不全易感基因的 检测试剂盒，它包括特异性扩增NPPA/NPPB基因座启动子的引物。
[0021] 所述的NPPA/NPPB基因座启动子的特异性引物的序列如SEQ ID N02和SEQ ID N03 所示。
[0022] 所述的检测试剂盒还含有常规的检测基因型的试剂。例如，含有与位点rs632793 结合的探针。
[0023] 在本发明的一个优选例中，所述的与位点rs632793结合的探针的序列如SEQ ID N04或者SEQ IDN05所示。
[0024] 本发明的检测试剂盒和检测方法可以用于检测NPPA/NPPB基因座启动子的单核 苷酸多态性基因型。具体而言，是对rs632793进行基因分型。
[0025] 所述的NPPA/NPPB基因座启动子的单核苷酸多态性基因型为A和/或G。
[0026] 利用对个体的左心室收缩功能不全易感性相关基因的基因型进行判断的方法，即 检测该个体的NPPA/NPPB基因rs632793位点的基因型，可以辅助判断该个体患左心室收缩 功能不全的发病风险。rs632793带有G等位基因的病人患左心室收缩功能不全的发病风险 显著高于对照组。
[0027] 本发明检测试剂盒和检测方法可以用于预测左心室收缩功能不全易感性，也可以 在冠心病患者基因治疗后判断或者辅助判断患者的康复前景。
[0028] 此外，本发明的检测试剂盒和检测方法还可以筛选治疗冠心病患者左心室收缩功 能不全的药物，甚至用于作为相关药剂的靶标。
[0029] 本发明公开了一种检测NPPA/NPPB基因座启动子中rs632793位点的方法，它包括 检测个体的心房钠肽（NPPA)/脑钠肽（NPPB) rs632793位点的基因型。本发明还公开了相 应的检测试剂盒。本发明的检测方法简便易行，成本低廉，高效快速，结果明了。可以大大 减轻患者的负担，为左心室收缩功能不全患者的用药方案提供了参考。
【附图说明】
[0030] 图1显示了第96号样本基因组DNA抽提的检测结果
[0031] 图2显示了NPPA/NPPB rs632793位于NPPA/NPPB基因座启动子中（片段重叠群 contig :NT_021937. 18位置6448044A/G)的一种SNP基因型的测序结果。
【具体实施方式】
[0032] 本发明人经过多年研究，发现利钠肽家族是当下寻找的左心室收缩功能不全的一 个重要的候选基因座及靶点。以此为目标，开发检测左心室收缩功能不全相关易感基因的 方法、试剂盒，以及治疗药物对揭示左心室收缩功能不全的病理生理途径有重要作用，有助 于进一步发现遗传因素对心血管疾病的影响，同时为预测预防心力衰竭做出有益的尝试。
[0033] 在冠心病病人中首次证明了NPPA/NPPB基因单核苷酸多态性位点rs632793(位 于NPPA/NPPB基因座启动子中，片段重叠群contig :NT_021937. 18位置6448044A/G)与 左心室收缩功能不全密切相关，而且发现了它的新功能：NPPA/NPPB基因单核苷酸多态性 位点rs632793位于NPPA/NPPB基因座启动子中（片段重叠群contig :NT_021937. 18位置 6448044A/G)基因型的改变将导致左心室收缩功能不全的发病风险升高，其中关联研究结 果显示，在冠心病病人中，NPPA/NPPB基因rs632793A - G在病例和对照组中的分布存在显 著性差异（P〈〇. 05)，该SNP多态性可参与改变启动子活性。在此基础上完成了本发明。
[0034] NPPA/NPPB基因的详细序列可参见登录号为rs632793的核苷酸序列(可参见网址 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
[0035] 本发明对NPPA/NPPB基因座启动子中（片段重叠群contig :NT_021937. 18位置 6448044)区域进行了测序。
[0036] NPPA/NPPB基因rs632793位点的多态性可直接用于针对冠心病病人的左心室收 缩功能不全的个性化治疗。在利用本发明NPPA/NPPB基因rs632793位点的多态性时，还可 同时使用其他治疗左心室收缩功能不全的药剂。
[0037] 本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效的本发明NPPA/NPPB多肽以及 药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘 油、乙醇、及其组合