检测egfr基因突变的双脱氧修饰引物、试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子技术和医学领域，具体涉及检测EGFR基因突变位点的引物、试剂 盒及方法。
【背景技术】
[0002] 肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮，故亦 称支气管肺癌。每年全世界大约有138万人死于肺癌。非小细胞型肺癌是肺癌最常见的形 式，患有非小细胞型肺癌的病人在表皮生长因子受体的酪氨酸激酶域隐藏有突变，靶治疗 常用EGFR酪氨酸激酶抑制剂的形式，如吉非替尼（Gefitinib)和厄洛替尼（Erlotinib)。
[0003] 自2004年第一次报道EGFR基因的突变对于EGFR酪氨酸抑制剂有敏感性以来， 第一批吉非替尼（Gefitinib)和厄洛替尼（Erlotinib)在含有EGFR突变的非小细胞型肺 癌的病人体内已经用于一系列的三期试验。研究显示，EGFR突变的肿瘤病人用吉非替尼 (Gefitinib)治疗可获得比钼类/紫杉醇治疗更长的存活时间。对于体内只含有野生型 EGFR的病人，钼类/紫杉醇治疗比吉非替尼（Gefitinib)治疗使得病人存活时间较长。EGFR 突变使得酪氨酸激酶域构象发生改变，增加了该域的活性、改变了与ATP结合的亲和力，进 而促进了与酪氨酸激酶抑制剂的结合，阻止了信号转导途径，使癌细胞增殖和生存受到抑 制。因此，准确鉴定EGFR是否发生突变，对于非小细胞型肺癌有着重要的临床意义。
[0004] EGFR是受体Erb-B家族的一员，由细胞外结合域一个跨膜片段和胞内酪氨酸激酶 域组成。主要作用是调节细胞增殖、入侵、转移、血管生成和抑制细胞的凋亡。EGFR的活化 主要通过两种细胞信号转导通路，一种是MAP激酶路径，它在细胞周期中调节G1期临界点 和调控细胞增殖。EGFR被激活后，MAPK路径通过活化RAS、RAF和MEK基因的形式将信号传 递到核内。RAS原癌基因包括H-ras，K-ras和N-ras，位于胞浆膜层内，并以活化形式（GTP) 或者非活化形式（⑶P)呈现。突变的EGFR结合TKI能力高于野生型EGFR。
[0005] 和EGFR酪氨酸激酶抑制剂敏感性相关的突变主要发生在EGFR酪氨酸激酶域的 18-21外显子处。19外显子处的缺失（E746-A750处）和21外显子点突变L858R占所有 EGFR突变的90%左右。
[0006]目前对于EGFR突变的检测有一系列的检测平台，广泛应用的是直接测序，其他方 法包括实时定量PCR，高分辨率溶解曲线分析、变性高效液相色谱分析技术和免疫组化技术 等。直接测序的主要缺点就是灵敏度较低，耗时，而且在提交PCR产物的过程中污染的可能 性很大。一些商业化实时定量PCR试剂盒检测基因突变灵敏度高，特异性好，但是需要特异 性探针，因此检测成本高,操作相对复杂，此外对所检样品的DNA质量也有较高的要求。免 疫组化有较高的特异性，但是灵敏度不高，对样品的处理要求较高，此外，需要大量抗体，不 经济。
[0007] 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR)是80年代中期发展起来 的体外核酸扩增技术，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进 行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。本发明基 于该方法，检测EGFR外显子中常见的位点突变。
[0008] 与普通PCR反应不同的是，该反应体系中除了 PCR反应液中的Taq酶外，加入了高 保真酶，而高保真酶具有3'到5'核酸外切酶的活性，PCR扩增过程中如果产生了错配的碱 基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供检测EGFR基因突变位点的引物、试剂盒及方法。
[0010] 在本发明的第一方面，提供一种检测EGFR基因突变的试剂盒，所述的试剂盒中包 括：
[0011] (8)引物对5￡〇10吣:1和3'端双脱氧修饰的5￡〇10吣:2，或引物对5￡〇10 NO: 1和3'端双脱氧修饰的SEQ ID N0:25;
[0012] (b)弓丨物对SEQ ID NO: 3和3'端双脱氧修饰的SEQ ID NO: 4,或引物对SEQ ID NO:3和3'端双脱氧修饰的SEQ ID NO:26;
[0013] (c)弓丨物对3'端双脱氧修饰的SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6,或引物对3'端双脱 氧修饰的 SEQ ID NO:27 和 SEQ ID NO:6;
[0014] (d)引物对SEQ ID N0:7和3'端双脱氧修饰的SEQ ID N0:8,或引物对SEQ ID NO:7和3'端双脱氧修饰的SEQ ID NO:28;
[0015] (e)弓丨物对3'端双脱氧修饰的SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10,或引物对3'端双 脱氧修饰的 SEQ ID NO:29 和 SEQ ID NO: 10。
[0016] 在一个优选例中，所述的试剂盒中，（a)引物对用于检测EGFR基因外显子18上 G719A 或 G719S 突变；
[0017] (b)引物对用于检测EGFR基因外显子19上E746_A750del突变（即第746-750aa 缺失）或E746_T751del突变（即第746-751aa缺失）或L747_T751del突变（即第 747-751aa 缺失）；
[0018] (c)引物对用于检测EGFR基因外显子20上I790M突变；
[0019] (d)引物对用于检测EGFR基因外显子21上L858R突变；
[0020] (e)弓丨物对用于检测EGFR基因外显子21上L861Q突变。
[0021] 在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：
[0022] 适配子，其序列如SEQ ID N0:24 ;
[0023] PCR扩增试剂（包括但不限于：反应缓冲液，dNTP，Taq酶，高保真酶，ddH 20);
[0024] 核酸提取试剂；
[0025] 核酸电泳试剂（如琼脂糖凝胶）；和/或
[0026] 使用说明书。
[0027] 在另一优选例中，所述的PCR扩增试剂中，包括Taq DNA聚合酶和具有3'到5'核 酸外切酶活性的高保真酶。
[0028] 在另一优选例中，所述的3'到5'核酸外切酶活性的高保真酶是PrimeSTARHS DNA 聚合酶。
[0029] 在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒的用途，用于检测（较佳地，为非诊断性 的检测）EGFR基因突变的方法。
[0030] 在本发明的另一方面，提供一种检测EGFR基因突变的方法（较佳地，所述的方法 为非诊断方法），所述的方法包括：
[0031] (1)以核酸样品为模板，利用选自所述的试剂盒的引物对进行PCR扩增，获得扩增 产物；
[0032] (2)将（1)的扩增产物进行电泳鉴定，通过是否存在目的条带来确定是否存在 EGFR基因突变；较佳地，利用一对引物对进行扩增后，产生目的条带鉴定为突变型，没有目 的条带鉴定为野生型。
[0033] 在另一优选例中，在进行PCR扩增时，对应于20 ill体系，PCR反应体系如下：
【主权项】
1. 一种检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括： (3)引物对569 10^:1和3'端双脱氧修饰的569 10^:2，或引物对569 10^:1 和3'端双脱氧修饰的SEQIDNO:25 ; 化）引物对SEQIDNO: 3和3'端双脱氧修饰的SEQIDNO: 4,或引物对SEQIDNO: 3 和3'端双脱氧修饰的SEQIDNO:26 ; (c) 引物对3'端双脱氧修饰的SEQIDNO: 5和SEQIDN0:6,或引物对3'端双脱氧修 饰的SEQIDNO:27 和SEQIDNO:6; (d) 引物对SEQIDNO: 7和3'端双脱氧修饰的SEQIDNO: 8,或引物对SEQIDNO: 7 和3'端双脱氧修饰的SEQIDNO:28 ; (e) 引物对3'端双脱氧修饰的SEQIDN0:9和SEQIDNO: 10,或引物对3'端双脱氧 修饰的SEQIDNO:29 和SEQIDNO: 10。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于， (a)引物对用于检测EGFR基因外显子18上G719A或G719S突变； 化）引物对用于检测EGFR基因外显子19上E746_A750del突变或E746_T751del突变 或L747_T751del突变； (C)引物对用于检测EGFR基因外显子20上T790M突变； (d) 引物对用于检测EGFR基因外显子21上L858R突变； (e) 引物对用于检测EGFR基因外显子21上L861Q突变。
3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有： 适配子，其序列如SEQIDN0:24; PCR扩增试剂； 核酸提取试剂； 核酸电泳试剂；和/或 使用说明书。
4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增试剂中，包括化qDNA聚 合酶和具有3'到5'核酸外切酶活性的高保真酶。
5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的3'到5'核酸外切酶活性的高保真 酶是PrimeSTAR服DNA聚合酶。
6. 权利要求1-5任一所述的试剂盒的用途，用于检测EGFR基因突变的方法。
7. -种检测EGFR基因突变的方法，其特征在于，所述的方法包括： (1) W核酸样品为模板，利用选自权利要求1的试剂盒的引物对进行PCR扩增，获得扩 增产物； (2) 将（1)的扩增产物进行电泳鉴定，通过是否存在目的条带来确定是否存在EGFR基 因突变；较佳地，利用一对引物对进行扩增后，产生目的条带鉴定为突变型，没有目的条带 鉴定为野生型。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，在进行PCR扩增时，对应于20y1体系，PCR 反应体系如下：
9. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，在进行PCR扩增时，PCR反应条件如下：
10. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，分5个平行体系，每一体系对应权利要求1 的试剂盒中（a)-(e)的一对引物对进行检测，最终获得EGFR基因外显子的突变情况。
【专利摘要】本发明涉及一种检测EGFR基因突变的试剂盒、方法及其应用。本发明以人类EGFR基因18-21号外显子突变为检测对象，针对突变位点分别设计特异性检测引物对，通过PCR反应，然后对PCR产物进行电泳分离，根据扩增目的产物条带的有无来判断EGFR基因是否存在突变。本发明的方法操作简便，成本低、灵敏度高。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104789643
【申请号】CN201410026976
【发明人】张驰宇, 姚瑾, 崔盟, 樊路娟, 蓝柯
【申请人】中国科学院上海巴斯德研究所
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2014年1月21日