专利名称：一种中药淫羊藿总黄酮磷酸化分子修饰方法
技术领域：
本发明涉及一种中药淫羊藿总黄酮磷酸化分子修饰方法，属于中兽药制备技术领域。
背景技术：
淫羊藿是一味最常用的壮阳药，具有补肾壮阳，强筋健骨，祛风除湿等功效，在肾功能不足、风湿痹痛、阳虚性高血压及骨质疏松等等多种疾病防治中起到重要作用。黄酮是淫羊藿最主要的有效成分，主要从茎叶中提取而得。已有大量现代研究表明淫羊藿黄酮具有良好的增强免疫、抗病毒、抗炎、抗氧化、降血压、镇咳、增加机体耐缺氧能力等多种药理作用，对许多疫病都有一定的防治作用。但由于淫羊藿黄酮很难溶于水，许多制剂类型使用均很不便，而且口服时在胃内几乎不吸收，也很容易受到胃内强酸环境影响而被破坏，使其生物利用度明显低。而由于集约化养殖的发展，兽医临床用药基本都以拌料或饮水添加为主。因此，这就极大地限制了淫羊藿黄酮在兽医临床上的开发利用。所以，研究提高淫羊藿黄酮水溶性方法，提高其生物利用度非常必要。中药化合物结构修饰是提高其水溶性和生物活性的主要手段之一。近年来，许多学者发现，中药多糖成分、皂苷等成分硫酸化或磷酸化修饰后，使其成酯化物，其水溶性普遍增加，免疫药理作用明显增强；大豆异黄酮经过硫酸化修饰后，其生物活性也有所提高。淫羊藿黄酮结构中含有酚羟基团，能够被磷酸化或硫酸化，从而增加其水溶性，并提高其生物活性。本发明首次将淫羊藿总黄酮磷酸化分子修饰，建立了淫羊藿总黄酮磷酸化分子修饰方法，优化了修饰条件，发现磷酸化分子修饰能显著增加淫羊藿总黄酮的水溶性，降低了其细胞毒性作用，提高其生物利用度，并获得较高的产物得率。
发明内容
技术问题本发明针对淫羊藿总黄酮水溶性低、胃内几乎不吸收，容易被胃酸破坏，降低其生物利用度等问题，提供一种淫羊藿总黄酮磷酸化分子修饰方法，达到显著提高淫羊藿总黄酮水溶性和安全性，便于制剂和提高生物利用度的目的，以最终应用于畜禽疾病临床防治。技术方案用正交试验法优化淫羊藿总黄酮磷酸化分子修饰方法。经优化后淫羊藿总黄酮磷酸化分子修饰方法为:精密称取2.5000g三聚磷酸钠和1.0000g三偏磷酸钠(5: 2)，溶于50ml蒸馏水中；精密称取500mg淫羊藿总黄酮(总黄酮含量62.22% )加入100ml蒸馏水中，充分混匀后加入配好的三聚磷酸钠-三偏磷酸钠混合液50ml，调节pH = 9，置恒温水浴锅内，反应温度70°C、反应时间6h，反应结束后，将反应物先用自来水透析48h，再用蒸馏水透析24h，冷冻干燥后得磷酸化淫羊藿总黄酮，经Nicolet FT-1R200型傅立叶变换红外光谱仪分析为淫羊藿总黄酮磷酸酯。按此方法制备的淫羊藿总黄酮磷酸酯，其总黄酮含量达36.41%，磷酸根含量可达34.85%，产物得率达124.18 %，且入水即溶，对体外培养的鸭胚肝细胞的毒性显著降低。有益效果病毒性疾病已经成为目前人类和动物健康的最大威胁之一，并造成了巨大的社会经济损失。近年来肆虐人类的禽流感、甲流、艾滋病、非典、流感、肠道病毒EV71型等等，肆虐动物的禽流感、新城疫、蓝耳病、圆环病毒2型、伪狂犬病、细小病毒病、鸭病毒性肝炎等等，都使人类和动物生命健康遭受了严重的威胁。病毒性疾病肆虐人畜的一个重要原因是人类对于这些烈性病毒目前尚没有临床特效的药物。曾今的抗流感病毒特效药“达菲”现在对H5N1、H7N9却不再那么有效。虽然三氮唑核苷、盐酸金刚乙胺、无环鸟苷等抗病毒药对病毒病也有一定的临床疗效，但是其引起的恶心、精神紊乱、腹泻、肝肾功能损伤、眩晕等等不良反应和药物残留，这些医源性、药源性疾病的不断增加使得人们开始拒绝这些抗病毒西药，转而选择毒副作用小的中草药，目前已有40%以上的消费者选择了中药或中西结合治疗。而在养殖业中，病毒性疾病仍然是目前养禽业危害最大的疫病之一，随着金刚烷胺、利巴韦林等抗病毒西药的全面被禁用，动物药品市场上治疗动物病毒病的西药出现了空档。动物疫病尤其是病毒性疾病主要依靠疫苗来预防，但是很多疫苗存在免疫原性较弱等缺点，需要免疫增强剂辅助才能产生强大的免疫应答。现今临床常用的免疫增强剂如油佐剂、铝胶佐剂等常存在局部刺激性强、有残留等缺点。中药成分由于安全、高效而逐渐成为免疫增强剂研发的热点。淫羊藿总黄酮是淫羊藿的主要药效成分，具有良好的增强免疫和抗病毒、抗炎、抗氧化等作用，实验室研究发现其对许多动物疫病都具有良好的防治作用。但由于淫羊藿总黄酮难溶于水，许多制剂类型使用均很不便，而且口服时在胃内几乎不吸收，也很容易受到胃内强酸环境影响而被破坏，使其生物利用度明显低。而由于集约化养殖的发展，兽医临床用药基本都以拌料或饮水添加为主。因此，这就极大地限制了淫羊藿总黄酮在兽医临床上的开发利用。所以，研究提高淫羊藿总黄酮水溶性的方法，提高其生物利用度非常必要。
本发明采用三聚磷酸钠-三偏磷酸钠法磷酸化分子修饰淫羊藿总黄酮，所形成的淫羊藿总黄酮磷酸酯不仅磷酸根和总黄酮含量高，产物得率亦很高，而且水溶性良好，安全，制剂使用更为方便。与现有技术相比，本发明优点如下:1.淫羊藿总黄酮磷酸化分子修饰的方法国内外未见报道，本发明提供了一种淫羊藿总黄酮磷酸酯的制备方法及其优化的条件，填补了国内外研究的空白。2.通过本发明实施所获得的淫羊藿总黄酮磷酸酯，不仅总黄酮和磷酸根含量高，产物得率高，而且具有良好的水溶性，入水即溶，制剂使用方便。3.通过本发明实施所获得的淫羊藿总黄酮磷酸酯对体外培养的鸭胚肝细胞的毒性较淫羊藿总黄酮显著降低。
具体实施例方式1.淫羊藿总黄酮的磷酸化分子修饰及条件优化采用三聚磷酸钠-三偏磷酸钠法磷酸化分子修饰淫羊藿总黄酮。精密称取
2.5000g三聚磷酸钠和1.0OOOg三偏磷酸钠(5:2)，溶于50ml蒸馏水中；精密称取500mg淫羊藿总黄酮(总黄酮含量62.22% )加入IOOml蒸馏水中，充分混匀后加入配好的三聚磷酸钠-三偏磷酸钠混合液50ml。根据单因素预试验结果，采用正交试验设计方法，选择对产物中总黄酮含量、磷酸根含量、产物得率等指标影响最大的反应体系PH(A)、反应温度(B)、反应时间(C)三个因素分别设定三个水平，按照正交表L9 (34)(表I)设计进行正交试验。反应结束后，将反应物先用自来水透析48h，再用蒸馏水透析24h，冷冻干燥后得磷酸化淫羊藿总黄酮。试验结果见表2。表I正交试验因素和水平设计
权利要求
1.一种淫羊藿总黄酮的磷酸化分子修饰方法，采用三聚磷酸钠-三偏磷酸钠法磷酸化分子修饰淫羊藿总黄酮。
(1)按三聚磷酸钠:三偏磷酸钠=5: 2的比例精确称取2.5000g三聚磷酸钠和1.0OOOg三偏磷酸钠，溶于50ml蒸馏水中；精密称取500mg淫羊藿总黄酮(总黄酮含量62.22% )加入IOOml蒸馏水中，充分混匀后加入配好的三聚磷酸钠-三偏磷酸钠混合液50ml，调节pH = 8 10，置恒温水浴锅内，反应温度70°C 90°C、反应时间4 8h，反应结束后，将反应物先用自来水透析48h，再用蒸馏水透析24h，冷冻干燥后得磷酸化淫羊藿总黄酮。
(2)上述方法磷酸化分子修饰淫羊藿总黄酮的条件为:反应pH= 8 10、反应温度70°C 90°C、反应时间4 8h。
(3)按照上述方法磷酸化分子修饰淫羊藿总黄酮的最佳条件为:反应PH= 9、反应温度70°C、反应时间6h。
(4)在最佳条件下磷酸化分子修饰淫羊藿总黄酮，其产物中总黄酮含量达36.41%，磷酸根含量可达34.85%，产物得率达124.18%。
(5)在最佳条件下磷酸化分子修饰淫羊藿总黄酮，其产物的红外光谱图基本形状与修饰前一致，未发生根本性改变，均具有黄酮特征吸收峰，除黄酮母体特征峰得到保留之外，在1160.61CHT1出现了一个磷酸酯的特征吸收峰，在918.ΙδαιΓ1处出现的亚磷酸酯特征吸收峰明显比修饰前的峰变大，表明本法中磷酸化分子修饰淫羊藿总黄酮产物为淫羊藿总黄酮磷酸酯。
(6)在最佳条件下制备的淫羊藿总 黄酮磷酸酯具有良好的水溶性，入水即溶。
(7)在最佳条件下制备的淫羊藿总黄酮磷酸酯对体外培养的鸭胚肝细胞的毒性较淫羊藿总黄酮显著降低。
2.权利要求1所述方法获得的淫羊藿总黄酮磷酸酯能够明显提高淫羊藿总黄酮的水溶性,安全性好,并具有较高回收率。
全文摘要
本发明涉及一种中药淫羊藿总黄酮磷酸化分子修饰方法，属于中兽药制备技术领域。采用三聚磷酸钠-三偏磷酸钠法磷酸化分子修饰淫羊藿总黄酮，以产物中总黄酮含量和磷酸根含量为指标，采用正交设计法研究了pH、反应温度、反应时间三个因素水平并对其进行优选，确定最佳修饰条件为反应温度70℃、反应时间6h、反应pH＝9的条件下制备磷酸化淫羊藿总黄酮，所得淫羊藿总黄酮磷酸化物经红外光谱分析为淫羊藿总黄酮磷酸酯，其中磷酸根和总黄酮含量高，产物得率高，而且入水即溶，对体外培养肝细胞的安全浓度显著增大。本发明所获得淫羊藿总黄酮磷酸酯具有良好的水溶性和较高的得率，安全性好。
文档编号A61P29/00GK103222997SQ20131014790
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月26日 优先权日2013年4月26日
发明者刘家国, 熊文, 陈云, 曾玲, 武毅, 王德云, 胡元亮, 马秀丽, 黄兵, 兰邹然 申请人:南京农业大学