修复酮古龙酸菌辅因子代谢缺陷提高2-酮基-l-古龙酸生产能力的方法
【专利摘要】本发明公开了一种在维生素C二步混菌发酵过程中，通过添加辅因子—泛醌（CoQ10）、甲基萘醌（VK2）（氧化型及还原型）及它们前体，包括对羟基苯甲酸、分支酸、异分支酸，从而改善小菌呼吸链电子传递水平，增加菌体代谢效率的方法。通过对小菌呼吸功能的增强，一方面可以提高小菌的基础代谢率，显著增加菌体数量；另一方面由于小菌产2-酮基-L-古龙酸（2-KGA）过程与呼吸链电子传递过程相偶联，故可提高小菌产2-KGA速率，在5L发酵罐中最高可降低发酵周期15.38%。该发明生产工艺先进，原料成本低，适于大规模工业化生产，是对我国将近四十年生物发酵法制备维生素C工艺的改造和提升。而且生产过程中无有害物质的排放，对周围环境无污染、无公害、符合环保要求。
【专利说明】修复酮古龙酸菌辅因子代谢缺陷提高2-酮基-L-古龙酸生 产能力的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于微生物发酵领域，涉及一种通过对微生物生长因子的选择与优化，使 酮古龙酸菌产2-KGA(2-酮基-L-古龙酸）能力提高的方法，以及改造维生素C发酵工艺。
【背景技术】：
[0002] 维生素C(VC)是人体必需的一种维生素，在抗氧化和维持新陈代谢平衡等方面具 有广泛的生理作用，在医药工业、食品工业、饲料行业以及化妆品行业上均有重要用途。其 应用范围广阔，市场规模巨大。
[0003] 目前，全球90%以上的VC生产，均利用我国发明的"二步发酵法"。其第一步发酵 是在氧化葡萄糖酸杆菌作用下将D-山梨醇氧化为L-山梨糖。第二步是在一种混合菌系的 作用下将L-山梨糖进一步氧化成VC的重要中间体2-酮基-L-古龙酸（2-KGA)。最后经过 化学转化使2-KGA生成VC。
[0004] "二步发酵法"的主要特点是在第二步发酵过程中，由于芽孢杆菌Bacillus sp.(俗称大菌）的伴生作用，酮古龙酸菌Ketogulonigeniumsp.(俗称小菌）的生长和 2-KGA的产率得到很大提高，但大菌没有任何产生2-KGA的能力，其主要作用是辅助小菌生 长。故小菌作为2-KGA产生菌，对其代谢能力的增强一直是学者们的研究热点。
[0005] 本发明前期分别完成了维生素C二步发酵工业菌株大菌与小菌的基因组测序及 其代谢网络的构建工作，进一步通过对大小菌代谢网络进行交互分析发现，小菌的泛醌 (CoQltl)及甲基萘醌（VK2)合成途径存在代谢缺陷，而大菌体内存在小菌缺陷的功能基因， 故认为大菌在形成芽孢释放胞内内容物的过程中，可以通过为小菌提供CoQltl前体对羟基 苯甲酸、VK2及VK2前体分支酸和异分支酸等物质促进小菌生长代谢。
[0006] 虽然大部分革兰氏阴性菌中泛醌（CoQ)存在形式为CoQ8，但是亦有部分以辅酶吡 咯喹啉醌（PQQ)存在为代表的革兰氏阴性菌，如副球菌属（Paracoccussp.)、葡糖杆菌属 (Gluconobactersp.)及红杆菌属（Rhodobactersp.)等，其泛醌形式以CoQltl的形式存 在，并且该泛醌的结构与人体内存在的CoQltl相同。由于小菌体内存在PQQ，亦属于红杆菌 科（Rhodobacteraceae)，并且泛醌代谢途径相关酶基因均与红杆菌对应酶基因具有较高的 同源性，故认为小菌体内泛醌形式亦为CoQ1(l。
[0007] 基于小菌代谢网络分析及大小菌代谢交互分析发现，小菌CoQltl的前体来源于对 氨基苯甲酸与聚丙烯二磷酸（Polyprenyldiphosphate),但是由于小菌不能独立合成对氨 基苯甲酸，故认为大菌可通过为小菌提供对氨基苯甲酸，满足小菌自身CoQltl的合成。
[0008] 另一方面，小菌体内缺乏VK2合成的部分酶系统，但大菌可以将分支酸转化为异分 支酸进而完整的合成VK2，故认为在混菌发酵体系中，通过补充分支酸（异分支酸）可以提 高大菌VK2的积累，进一步满足小菌的代谢需求。
[0009] 由于CoQltl在小菌体内作为呼吸链中NADH氧化酶与琥珀酸脱氢酶的电子受体参与 电子传递；VK2亦作为小菌细胞膜中的重要组成成份，参与多种电子传递过程，例如作为琥 珀酸脱氢酶的电子传递体，故通过对上述物质的补充，将对提高小菌的基础代谢水平，提高 菌体数量起到关键的作用。同时，小菌在利用以PQQ为辅酶的山梨糖脱氢酶（SDH)将底物 L-山梨糖转化为2-KGA的过程中，L-山梨糖脱氢释放的电子亦经过呼吸链与氧气结合，故 上述物质的补充，在增强小菌呼吸链呼吸功能的同时，亦可促进其产2-KGA的速率。
[0010] 本发明基于大、小菌的生理代谢基础研究，发现并验证了上述物质在产2-KGA发 酵过程中，可以增强小菌菌体数量并明显降低发酵周期。同时本发明公开前，未见有将上述 物质应用于维生素C二步发酵产2-KGA过程中的报道。
【发明内容】
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[0011]本发明的目的在于利用微量的小菌代谢缺陷物，添加到常规的产2-KGA种液及发 酵培养基中，用以增强小菌代谢能力，降低发酵周期，从而提高酮古龙酸菌产2-KGA能力。
[0012] 实际上，本发明涉及一种通过对小菌代谢缺陷途径的修复，使酮古龙酸菌产2-KGA 能力提高的方法。
[0013] 进一步说，对小菌代谢缺陷途径的修复，既为在产2-KGA种液及发酵培养基中添 加小菌不能直接合成的物质，包括：C〇Q1(l、VK2 (包括氧化型及还原型）、对羟基苯甲酸及分 支酸、异分支酸中的一种或几种。
[0014] 本发明还提供了用于制备种液的培养基及用于发酵的培养基，该培养基包括制备 种液及发酵液的常规培养基，其特征在于：培养基中包括所述小菌代谢缺陷物质的至少一 种物质，所述的小菌代谢缺陷物质在培养基中出现的方式包括直接加入也包括以其它混合 物形式间接加入。
[0015] 上述培养基中，所述小菌代谢缺陷物质加入量分别为：20 μ g/L-500 μ g/L CoQltl, 10μg/L-35μg/L VK2, 5μg/L-30μg/L 对轻基苯甲酸，5μg/L-50μg/L 分支酸及异分支 酸。当添加量低于下限对代谢促进作用不明显，当添加量高于上限时，对产2-KGA出现抑 制，亦造成原料的浪费。确定的加入常规种液培养基中的最佳缺陷代谢物组合为：50yg/L CoQ ltl, 10μg/L VK2, 5μg/L对轻基苯甲酸及10μg/L分支酸；确定的加入常规发酵液中的 最佳缺陷代谢物组合为：10 μ g/L VK2, 25 μ g/L对羟基苯甲酸及10 μ g/L分支酸。
[0016] 上述常规种液及发酵培养基一般来讲，既为目前VC二步发酵工业生产中使用的 培养基，具体由下列成份组成：
[0017] 1.常规种液培养基：1-3%L-山梨糖，0.3-1 %玉米浆，0.1-0. 5 %葡萄糖， 0· 05-0. 3%尿素，0· 1-0. 3%碳酸钙，pH6. 7-7. 0,121°C灭菌 20min。
[0018] 2.常规发酵培养基：8-12%L-山梨糖、0.3-3 %玉米浆、0.05-0. 2 %磷酸二氢 钾，0· 05-0. 5%尿素，0· 005-0. 02%硫酸镁，0· 1-0. 5%碳酸钙，ρΗ6· 7-7. 0,其中碳源（L-山 梨糖）和氮源分开灭菌，灭菌条件为12rC，20min。
[0019] 在常规种液培养基及发酵培养基中加入上述至少一种小菌代谢缺陷物质是本发 明的重点。这些物质既可以在培养基配制的时候添加，也可以在发酵开始后以补料方式加 入。
[0020] 小菌代谢缺陷物质的加入方法如下：
[0021]I.CoQltl :以丙酮为溶剂，制成5%溶液，过滤除菌后加入灭菌后的培养基；
[0022] 2.VK2 :以无水乙醇为溶剂，制成1 %溶液，直接加入灭菌后的培养基；
[0023] 3.对羟基苯甲酸：方法同VK2;
[0024] 4.分支酸：与培养基中其它组分同时加入，灭菌备用。
[0025] 5.异分支酸：与培养基中其它组分同时加入，灭菌备用。
[0026] 本发明的技术方案如下：
[0027] 方案1.常规种液培养基中添加小菌代谢缺陷物质，提高发酵过程中2-KGA产率
[0028] 将常规方法制备的大小菌混合培养的斜面（混菌斜面），接种于添加了不同小菌 代谢缺陷物质的常规种液培养基中，28-341：培养16-2811制成种液，5-15%接种于常规发 酵培养基中，28-34 °C培养至底物L-山梨糖小于lmg/L。
[0029] 方案2.发酵液中添加小菌代谢缺陷物质，提高发酵过程中2-KGA产率
[0030] 混菌斜面接种于常规种液培养基中，28-34°C培养16-28h制成种液，5-15%接种 于添加了不同小菌代谢缺陷物质的基础常规发酵培养基中，28-34°C培养至底物L-山梨糖 小于lmg/L。
[0031] 方案3.在种液及发酵液中均添加小菌代谢缺陷物质提高发酵过程中2-KGA产率
[0032] 参见方案1与方案2。
[0033] 在种液中添加小菌代谢缺陷物质能明显提高种液中小菌的数量，并在进一步的发 酵过程中降低发酵周期，但转化率较对照组相比提升不大。
[0034] 在发酵液中添加小菌代谢缺陷物质亦可提高小菌数量，且发酵周期与方案1相比 进一步降低，但转化率相较对照组提升不大。
[0035] 在种液及发酵液中均添加小菌代谢缺陷物质，与方案2相比周期进一步缩短，且 转化率与对照组持平。
[0036] 本发明揭示了在添加小菌代谢缺陷物质后，可以增强菌体的代谢效率，明显提高 菌体生长及产2-KGA速率，该发明将对工业水平上进一步提高产率，降低生产成本起到积 极的作用。通过修复酮古龙酸菌（小菌）辅因子代谢缺陷，改善呼吸链电子传递效率，提高 菌体代谢水平，增加维生素C二步发酵中2-KGA产量。
【专利附图】
【附图说明】
[0037] 下面结合图1及【具体实施方式】对本发明做进一步详细说明：
[0038] 图1是基于大小菌代谢交互分析构建的大小菌泛醌及萜类醌生合成代谢网络交 互图。其中实线框里的物质代表本发明涉及到的小菌缺陷代谢物，虚线框里的物质代表小 菌上游存在的代谢途径，实线细箭头代表小菌存在的代谢反应，实线粗箭头代表小菌缺陷 而大菌存在的代谢反应，虚线细箭头代表省略的小菌体内存在的代谢步骤，虚线粗箭头代 表省略的大菌存在而小菌缺陷的代谢步骤，箭头上的数字代表该反应酶的EC编号。
【具体实施方式】：
[0039] 为了更好的阐明通过对小菌代谢缺陷功能的修复提高产2-KGA效率的应用，下面 将描述本发明的四个实施例，但本发明的内容包括但不局限于此。
[0040] 实施实例1 :单因素条件下考察种液中添加小菌代谢缺陷物质对产2-KGA能力的 影响
[0041] 常规种子培养基为：2% L-山梨糖，0.5%玉米浆，0.2%葡萄糖，0. 1%尿素0.2% 碳酸钙，PH6.7-7.0。
[0042] 常规发酵培养基为：8% L-山梨糖，I. 5 %玉米浆，0. I %磷酸二氢钾，0. I %尿素， 0.01%硫酸镁，0.5%碳酸钙，？册.7-7.0。
[0043] 培养条件：混菌培养的斜面接种于常规种液培养基中，30°C220转/分，摇瓶培 养20h制成种液，10%接种于分别添加了不同小菌代谢缺陷物质的常规发酵培养基中， 30°C220转/分，摇瓶培养至底物L-山梨糖小于lmg/L发酵结束。
[0044] 在常规种液培养基中分别添加的小菌代谢缺陷物质的浓度及发酵结果见表1.
[0045]表1.单因素条件下种液中添加小菌代谢缺陷物质对发酵的影响.
[0046]
【权利要求】
1. 修复酮古龙酸菌辅因子代谢缺陷提高2-酮基-L-古龙酸生产能力的方法，其特征 在于，在产2-酮基-L-古龙酸种液培养基和/或发酵培养基中添加小菌不能直接合成的物 质。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的小菌不能直接合成的物质为C〇Q1(l、 VK2、对轻基苯甲酸、分支酸、异分支酸中的一种或几种。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的种液培养基为：1-3% L-山 梨糖，0? 3-1% 玉米浆，0? 1-0. 5% 葡萄糖，0? 05-0. 3% 尿素，0? 1-0. 3% 碳酸钙，pH 6. 7-7. 0， 121°C灭菌 20 min。
4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基为：8-12% L-山 梨糖、0.3-3%玉米浆、0.05-0. 2%磷酸二氢钾，0.05-0. 5%尿素，0.005-0. 02%硫酸镁， 0. 1-0. 5%碳酸钙，pH6. 7-7. 0,其中碳源（L-山梨糖）和氮源分开灭菌，灭菌条件为121°C， 20min〇
5. 根据权利要求1-4任何一项所述的方法，其特征在于，所述的小菌不能直接合成的 物质的加入量为〇? 5 y g/L-5mg/L。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的小菌不能直接合成的物质为C〇Q1(l时，其加入量为：20 y g/L -500 y g/L，为VK2时，加入量为10 y g/L -35 y g/L，为对羟基苯 甲酸时，加入量为5 ii g/L -30 ii g/L,为分支酸或异分支酸时，加入量为5 ii g/L -50 ii g/L。
7. 根据权利要求1-6任何一项所述的方法，其特征在于，所述的小菌不能直接合成的 物质在培养基配制的时候添加，或在发酵开始后以补料方式加入。
8. 根据权利要求1-7任何一项所述的方法，其特征在于，所述的小菌不能直接合成的 物质为C〇Q1(l或VK2。
9. 根据权利要求1-8任何一项所述的方法，其特征在于，种液培养基中的小菌不能合 成的 物质组合物为：50y g/L C〇Q1Q，10ii g/L VK2,5 y g/L对羟基苯甲酸及10 y g/L分支 酸。
10. 根据权利要求1-8任何一项所述的方法，其特征在于，发酵液中的小菌不能合成的 组合物为：l〇U g/L VK2,25 y g/L对羟基苯甲酸及10 y g/L分支酸。
【文档编号】C12R1/01GK104357530SQ201410546538
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月15日 优先权日:2014年10月15日
【发明者】张怡轩, 付阳, 于哲, 张盛, 李野, 韩立涛, 张海宏 申请人:沈阳药科大学