一种杂交鹅掌楸pin1基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种杂交鹅掌楸/YM基因及其应用。
【背景技术】
[0002]杂交鹅掌楸是我国著名林木遗传育种家叶培忠教授利用分布在我国的中国鹳掌楸{Lir1dendron chinensis (Hems1.) Sarg.)和和分布在北美的北美鹳掌楸{Lir1dendron tulipifera Linn.)通过人工杂交获得的种间杂交种，其生长速度快，树姿优美，叶形奇特，抗性强，材质纹理细腻，是重要的园林绿化和工业用材树种。杂交鹅掌楸虽然有许多优越性，但杂交制种受到季节和效率的限制，影响了杂交鹅掌楸的推广应用，由于植物体细胞胚具有数量多，一旦形成体细胞胚就能够快速发育成再生植株的特点，以体细胞胚胎发生技术快速繁殖种子来源困难的杂交鹅掌楸，具有重要的理论意义和应用价值。体胚发生技术由于其两极性、繁殖速度快、效率高等特点，已经成为优良林木资源快速无性繁殖的重要手段，并且它能和生物反应器结合实现大规模商业化生产。到目前为止，已经成功利用杂交种体细胞建立了杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生技术和快速成苗体系，开辟了杂交鹅掌楸产业化开发的新途径。体细胞胚发生的本质是细胞分化的问题，而细胞分化的分子基础则是基因差异表达与调控的结果。所以研究这些相关基因可以使我们更好的了解体细胞发生技术的原理。
[0003]植物生长调节剂的诱导和调节是离体培养条件下体细胞转化成胚性细胞的重要诱导因子。其中，生长素是诱导体细胞胚发生的关键因素。在体细胞胚的发生和发育过程中，生长素的极性运输和组织中心细胞与干细胞的形成起关键作用，它们通过启动胚性特征基因表达，最终决定体细胞原胚的产生，进而继续发育形成成熟体细胞胚。造成这种极性运输的原因是由于在运输生长素的细胞中生长素输出蛋白在质膜上的极性分布所致。生长素在胚性愈伤组织中呈极性分布，体细胞胚能够在高浓度生长素的区域被诱导。在诱导过程中加入生长素极性运输抑制剂NPA，则生长素的极性分布和WUS的表达模式均发生改变，且不能诱导产生体细胞胚；如果在诱导过程中生长素的浓度被改变，则体细胞胚不能被诱导，并且WUS的表达模式也发生改变。
[0004]研究表明，生长素的运输蛋白在植物的胚后发育过程及植物的光形态建成和组织分化方面起着非常重要的作用。生长素在植物组织中的极性分布很大程度上归功于高度调控、极性定位的输出载体PINs蛋白。PINs蛋白是生长素的输出载体，能使生长素从细胞内流出。PIN蛋白是决定生长素流方向的基础，为植物体的各部分和细胞提供了特异的位置信息和方向信息。所以，PIN蛋白和生长素信号转导系统共同调节植物体的生长发育。
[0005]目前，已经从拟南芥中至少克隆出来8个/ΥΛ基因，在水稻、玉米等植物中也得到了数个同源基因。根据这些基因在序列上的高度保守性说明在不同植物中也许在其生长发育过程中具有相同的功能。拟南芥中的PIN1、PIN2、PIN3、PIN4、已经被证实了在植物早期胚胎发育以及根的向地性、植物的伸长生长以及植物的向性反应中都具有一定的影响。
[0006]/YM是第一个被鉴定出的PIN蛋白家族的成员，负责茎芽组织中生长素的向基性及根组织中的向顶性运输。已知编码一个定位在木质部薄壁组织细胞基部的膜蛋白，/5ZM不仅位于质膜，也位于内体和内体产生的再循环小泡中。
[0007]/YM突变体影响IAA在花序轴中向下运输，导致花序轴顶端发育成针状，花序轴中向基性生长素运输明显降低，且维管组织发育缺陷，与用生长素运输抑制剂处理的植物表型类似。如果在突变体花序上局部施加生长素，造成局部生长素浓度差异，则促使侧部器官起始。在顶端分生组织边缘区原基起始位置有所表达，在花器官起始位置能强烈表达，在花原基、维管束中也强烈表达，这种表达模式显示出在侧生器官起始中的重要作用。如果改变在细胞膜上极性定位，根的重力反应也将随之改变，从而证明PIN蛋白在细胞质膜上的极性定位是调节拟南芥分生组织中生长素极性运输的决定性因素。
【发明内容】
[0008]发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杂交鹅掌楸/YM基因。本发明的另一目的是提供杂交鹅掌楸/ΥΛ基因在杂种鹅掌楸育种中的应用。
[0009]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
一种杂交鹅掌楸/5ZM基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。该基因在建立成熟的杂交鹅掌楸体胚发生体系的基础上，同源克隆生长素运输蛋白获得。
[0010]所述的杂交鹅掌楸/YM基因，其编码序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011]所述的杂交鹅掌楸/5ZM基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0012]所述的杂交鹅掌楸/5ZM基因在杂交鹅掌楸育种中的应用。
[0013]所述的杂交鹅掌楸/YM基因的载体。
[0014]所述的杂交鹅掌楸/5ZM基因的宿主细胞。
[0015]有益效应:本发明是在已建立的完善的杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生体系的基础上，通过对杂交鹅掌楸/YM基因的克隆与鉴定，基因的表达分析，基因的遗传转化等手段，分析验证其功能。转基因烟草植株矮化，植株的粗生长有所增加，叶片侧脉数量增加。可见，过表达基因影响植株的生长发育，抑制植株增高，节间距缩短，影响植株的生长发育，可为开展杂交鹅掌楸分子育种提供更好的方法。
【附图说明】
[0016]图1是杂交鹅掌楸总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳图；
图2杂交鹅掌楸/YM基因特异性条带PCR扩增结果图；
图3是/YM基因全长PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图；
图4是目的片段双酶切反应的1%琼脂糖凝胶电泳图；
图5是空表达载体pBI121双酶切反应的1%琼脂糖凝胶电泳图；
图6是构建好的/YM过表达载体PCR及双酶切验证图；图a:构建好的/YM载体PCR ;图b -.PINl^ pMD ?19-T Vector连接载体用BamHI，Sac I双酶切反应；
图7是构建好的/YM过表达载体图； 图8是/YM基因在不同时期的半定量结果图；图中，I为非胚型愈伤组织；2为胚性愈伤组织；3为液体继代培养基中胚胎单细胞；4为在调整培养基中生长两天后胚胎细胞；5为胚胎诱导培养一周的球型胚阶段；6为诱导培养二周的鱼雷胚阶段；7为诱导培养三周的子叶胚阶段；8为成熟的子叶胚。
[0017]图9是/YM基因在不同时期的实时定量结果图；图中，I为非胚型愈伤组织；2为胚性愈伤组织；3为液体继代培养基中胚胎单细胞；4为在调整培养基中生长两天后胚胎细胞；5为胚胎诱导培养一周的球型期体细胞胚胚；6为诱导培养二周的鱼雷期体细胞胚；7为诱导培养三周的子叶期体细胞胚；8为成熟的子叶体细胞胚胚。
[0018]图10是Tl代阳性植株PCR检测结果图；图中，1-14:转ZAZ5ZM基因烟草植株DNA ；Ck+:质粒 DNA ；CK-:野生型烟草植株 DNA ；H20:ddH20 ；M:2000bp Mark。
[0019]图11是Tl代/YM转基因株系与野生型的生长情况图；图中，a:野生型烟草植株；b ??转基因烟草植株；c:野生型烟草叶片；d:转基因烟草叶片；e:野生型烟草茎段；f:转LhPINl基因烟草茎段；
图12是转基因烟草茎段横切面的表型图；图中，a:野生型烟草植株；b:a图局部放大；c:转基因烟草植株；d:c图局部放大。
【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
以杂交鹅掌楸为材料，提取总RNA，并反转成cDNA，设计相应引物进行PCR，琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的条带，与PMD19-T载体连接，转入大肠杆菌，测序并分析。挑取阳性克隆进行质粒抽提，加入酶切位点后与载体PBI121同时双酶切，在T4连接酶的作用下连接后，转入农杆菌EHA105中，待烟草适龄后，通过农杆菌介导法进行转化，观察Tl代表型，进行统计分析，分析其功能。
[0021](I)总RNA的提取
以杂交鹅掌楸的幼叶为材料，按照TIANGEN植物总RNA提取试剂盒(DP432)的操作步骤进行RNA的提取，所使用的试剂和耗材均经过0.1%DEPC水处理使其无RNA酶。杂交鹅掌楸总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示；28S、18S、5.8S条带均清晰可见，并且28S的荧光亮度是18S的两倍；0D26Q/0D2S。值为2.07，OD 26Q/0D23。为2.09，RNA质量较好。
[0022]RNA提取的具体过程为:1.匀浆处理:剪取约10mg新鲜叶片在液氮中迅速研磨成粉末，转移至450ulRL (用前加入β-巯基乙醇)，涡旋剧烈震荡混匀。2.将所有溶液转移至过滤柱中(过滤柱放在收集