专利名称：一种杂交鹅掌楸高效遗传转化方法
技术领域：
本发明涉及杂交鹅掌楸遗传转化方法，具体涉及一种杂交鹅掌楸高效遗传转化方法。
背景技术：
杂交鹅掌楸又名鹅掌楸(马褂木)，它是由南京林业大学叶培忠教授等首次通过人工杂交的方法，将分布在亚洲的中国杂交鹅掌楸与分布在北美洲的北美杂交鹅掌楸采用人工控制授粉方法育成的杂交树种。杂交鹅掌楸叶形奇特，花色艳丽，是优良的庭院栽培和园林观赏树种。同时，其树体高大，主干圆满通直，木材结构细致均匀，色浅，易干燥，易加工，纤维较长，是优良的制浆造纸、人造板及家具用材树种，社会需求量极大。但是杂交鹅掌楸生长周期长，应用常规手段育种具有较大的困难。因此必须依靠现代生物技术并与常规育种相结合，进而缩短育种周期，加速育种进程，营造优质人工林，缓解木材供需矛盾。基因工程是生物技术的核心，为林木遗传改良开辟了一条新的途径。林木基因工程是通过适合的基因转移技术，导入有用的外源基因，获得转基因植株，进行林木遗传改良或有关的研究。近年来，林木基因工程取得了较大的进展。目前，已有几百种植物得到遗传改良，在丰产，抗病，抗寒等领域广泛应用。农杆菌介导的遗传转化是外源DNA进入植物细胞最成功和应用最为广泛的方法，自1976年D.Cleene和D.Ley (1976)首次报导根癌农杆菌菌株B6 (LMG18)也能感染裸子植物受伤组织并产生冠瘿瘤(Crown gall)后，许多学者开始利用农杆菌进行木本植物的基因转移。在农杆菌介导的遗传转化过 程中，成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统的建立。所谓植物基因转化受体系统，是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。目前，以植物体胚发生体系或体胚作为受体系统越来越受到重视。该系统的主要特点有四点:其一、组成胚状体的胚性细胞接受外源DNA能力很强，是理想的基因转化感受态细胞，而且这些细胞繁殖量大，同步性好，因此转化率很高；其二、胚状体个体间遗传背景一致，无性系变异小，成苗快，数量多，而且还可以制成人工种子，有利于转基因植株的生产和推广；其三、胚状体多为单细胞起源，转化获得的转基因植株嵌合体少；其四、胚状体具有两极，在发育过程中同时可分化出芽和根，形成完整的植株，减少了不定芽发育过程中生根困难的难题。
发明内容
发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，以建立稳定高效的杂交鹅掌楸遗传转化体系。技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
一种杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，包括以下步骤:(O杂交鹅掌楸转化受体的建立:取继代2周的杂交鹅掌楸愈伤组织细胞，接入含有M13杂交鹅掌楸液体培养基的三角瓶中，230C，95r/min的恒温摇床振荡培养；每7天继代一次，继代3次后建立出悬浮细胞系，即为杂交鹅掌楸转化受体；
(2)农杆菌制备:先活化EHA105单菌落，在含有卡那霉素50mg/L、链霉素30mg/L的LB液体培养基中，28°C，280r/min振荡培养至0D_为0.6-0.8，4°C离心收集菌体，用杂交鹅掌楸液体继代培养基重悬菌体，将菌液浓度稀释至0.5左右；
(3)侵染:取3ml菌液加到杂交鹅掌楸转化受体中，并加入乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L。静置l-3min后，置于23°C、95r/min的恒温摇床中，继续振荡培养16 40h ；
(4)脱菌培养:将杂交鹅掌楸悬浮细胞经400目及150目的筛子过筛，用杂交鹅掌楸单细胞培养基将400目的筛子上的单细胞悬浮，置于23°C、95r/min的恒温摇床，振荡培养培养36h后，再用400目的筛子过筛一次，并用加有头孢霉素500mg/L的杂交鹅掌楸单细胞培养基将400目筛子上的单细胞收集。并将单细胞以2mL每皿的浓度铺平板，培养基为加有头孢霉素500mg/L，约21天继代一次；继代一次后，可以观察到子叶胚；
(5)筛选培养:待子叶胚成熟，并长到2cm左右，将其挑出，转到MS基本培养基上生长，其中加有头孢霉素200mg/L，卡那霉素50mg/L。步骤(1)中，取继代2周的杂交鹅掌楸愈伤组织细胞5mL，将其接种到250mL的三角瓶中，并在瓶壁轻轻敲散；量取50mL杂交鹅掌楸Ml3液体培养基加入三角瓶中，将材料置于23°C,95r/min的恒温摇床振荡培养。步骤(2)中，农杆菌制备，具体操作为:
1)将_70°C保存的EHA105菌液在冰上融化，用接种环蘸取少量菌液，接种到含有卡那霉素50mg/L，链霉素30mg/L的LB培养基上，将其置于28°C恒温培养箱中培养；
2)待其长出单菌落后，用接种环挑取单菌落，接种到含有卡那霉素50mg/L，链霉素30mg/L的LB培养基上,再活化一次,然后将其置于28°C恒温培养箱中培养；
3)待其长出单菌落后，用灭过菌的枪头挑取单菌落接种到含有IOmL加有卡那霉素50mg/L，链霉素30mg/L的LB液体培养基的三角瓶中，28°C、220r/min振荡培养；
4)约20h后，吸取2mL菌液，接种到含有50mL加有适量抗生素的LB液体培养基的三角瓶中，28°C、280r/min 振荡培养至 OD600 为 0.6-0.8 ；
5)待农杆菌培养到OD6tltl为0.6-0.8时，取25mL菌液于50mL离心管中，于5000r/min，4°C离心IOmin,去除上清,收集菌体；
6)用杂交鹅掌楸液体继代培养基重悬菌体，将菌液浓度稀释至0.5左右。步骤(3 )中，共培养36 40h。所述的EHA105带有35S:⑶S基因和NPT-1I基因。步骤(5 )中，每21天继代一次，继代2次后，就可用于移栽。有益效果:与现有技术相比，本发明以杂交鹅掌楸悬浮培养的单细胞作为遗传转化受体系统，通过农杆菌介导的方法，以GUS基因为报告基因，通过细胞学方法检测GUS基因的瞬间表达、长期表达、通过分子生物学方法检测等确定外源基因的高效转化。本发明采用杂交鹅掌楸单细胞起源的体细胞胚胎发生体系， 有利于外源基因的导入，并降低了嵌合体的产生，具有很好的实用性。
图1是杂交鹅掌楸的悬浮细胞系的显微照片 图2是杂交鹅掌楸体胚苗的显微照片 图3是PCR检测转化结果图；图中，泳道M为maker，泳道CK+为质粒pBI 121，泳道CK_为未经过转化的马褂木植株，泳道H2O为水，泳道1，2，3，4，5，6，7，8，9为随机选取的⑶S细胞学检测为阳性的马褂木转基因植株；
图4是RT-PCR检测转化结果图；图中，泳道M为maker，泳道CK+为质粒pBI 121，泳道CK_为未经过转化的马褂木植株，泳道1，2，3，4，5为随机选取的PCR检测及⑶S细胞学检测显示阳性的植株。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。以下实施例中，所使用到的培养基配方如下，未特别列出的，为常规培养基。MS 基本培养基配方:1650mg/L NH4NO3,1900mg/L KNO3,170mg/L KH2PO4, 370mg/L MgSO4.7H20,440mg/L CaCl2, 27.8mg/L FeSO4.7H20, 37.3mg/L Na2EDTA, 22.3mg/LMnSO4.H20,8.6mg/L ZnSO4.7H20,6.2mg/L H3BO3,0.83mg/L KI,0.25mg/L Na2MoO4.2H20,
0.025mg/L CuS04.5H20，0.025mg/L CoCl2.6H20，100 mg/L MyO-1nositol, 2.0 mg/LGlycine,0.4 mg/L Thiamine *HCI,0.5 mg/L Nictinic acid,0.5 mg/L Pyridoxine *HCL.
杂交鹅掌楸单细胞培养基配方:3/4MS，附加0.2 mg/L ΝΑΑ,Ο.5 mg/L KT, 0.2 mg/L BA，5 g/L VC,0.5 g/L CH, 50 g/L 蔗糖。杂交鹅掌楸M13液体培养基配方:3/4MS，附加2.0 mg/L 2，4_D，0.2 mg/L 6_BA，0.5 g/L CH, 30 g/L 蔗糖。杂交鹅掌楸体胚诱导培养基配方:3/4MS，附加2 mg/L ABA, 5 g/L VC, 0.2 g/L LH,
2g/L AC,40 g/L 鹿糖，1.15 g/L Gel。LB 培养基配方:5 g/L Yeast extract, 10 g/L Tryptone, 5 g/L NaCl。实施例1杂交鹅掌楸转化受体的建立。 成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统的建立。所谓植物基因转化受体系统，是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。20世纪70年代以来，对植物基因转化受体系统的研究已经进行了大量的工作，先后建立了多种有效的受体系统，适应于不同转化方法的要求和不同的转化目的。本实施例采用杂交鹅掌楸悬浮细胞系为受体材料。悬浮细胞系的建立与一些物理因素有关，如细胞起始密度，振荡培养时摇床的转速等。本实施例利用基于固体培养条件下建立的杂交鹅掌楸的胚性愈伤培养物，建立一个稳定性、同步性和可重复性好，细胞活力旺盛的胚性细胞悬浮体系。相关研究报道，一个良好的悬浮细胞培养体系必须满足以下基本条件:一，悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30 50个细胞以下；二，均匀性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，培养液清澈透亮，细胞色泽鲜艳；三，细胞生长迅速。因此为建立良好的杂交鹅掌楸的悬浮细胞系，选用继代2周后的愈伤材料。具体步骤如下:
I)取继代2周的杂交鹅掌楸愈伤组织细胞约5mL，将其接种到250mL的三角瓶中，并在瓶壁轻轻敲散。2)量取50mL杂交鹅掌楸Ml3液体培养基加入三角瓶中，将材料置于23°C，95r/min的恒温摇床振荡培养。3)每7天继代一次。继代3次后可用于转化，所建立的悬浮细胞系如图1所示。实施例2农杆菌制备。农杆菌的培养、生长状态及纯度对转化具有重要作用。如果农杆菌本身生长不良，则其侵染能力大大下降。如果农杆菌中的目的基因已经丢失，则无法用于转化。因此制备纯度高、生长旺盛、侵染能力强的农杆菌侵染液是转化的关键。这种侵染菌液也称为工程菌液。农杆菌的培养可分为固体平板培养和液体振荡培养固体培养一般需要2 3天，液体培养生长更快，一般需要I 2天。农杆菌接种在液体培养基后，并不立即开始增殖。一般需I 2小时才开始分裂。当生长开始后，细菌数目以一恒定的指数速率倍增，直至培养基成分改变和供养缺乏时才停止增殖。当细菌增长速率达到对数指数时称之为对数生长状态。研究表明，处于对数生长状态的农杆菌侵染能力最强。具体步骤如下:
I)将-70°C保存的带有35S:GUS基因(用于转化检测)和NPT-1I基因(用于筛选)EHA105菌液在冰上融化，用接种环蘸取少量菌液，接种到含有适量抗生素(卡那霉素50mg/L，链霉素30mg/L)的LB培养基上，将其置于28°C恒温培养箱中培养。2)待其长出单菌落后，用接种环挑取单菌落，接种到含有适量抗生素的LB培养基上，再活化一次，然后将其置于28°C恒温培养箱中培养。
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3)待其长出单菌落后，用灭过菌的枪头挑取单菌落接种到含有IOmL加有适量抗生素的LB液体培养基的三角瓶中，28°C、220r/min振荡培养。4)约20h后，吸取2mL菌液，接种到含有50mL加有适量抗生素的LB液体培养基的三角瓶中，28°C、280r/min振荡培养至OD6tltl为0.6-0.8。5)待农杆菌培养到OD6tltl为0.6-0.8时，取25mL菌液于50mL离心管中，于5000r/min,4°C离心IOmin,去除上清,收集菌体。6)用杂交鹅掌楸Ml3液体继代培养基重悬菌体，将菌液浓度稀释至0.5左右。实施例3侵染。所谓侵染就是把工程菌接种到受体材料表面，方法就是将制备好的农杆菌菌液加入受体材料培养液中，浸泡一定时间后，进行共培养。在侵染过程中要掌握侵染时间，有助于减少后期培养过程中可能造成的污染，并可减轻细菌对植物的毒害作用。浸染时间太短，不能使足够多的农杆菌附着于外植体伤口处，从而降低遗传转化的频率。浸染时间过长，容易引起外植体的过敏反应，同时在后继培养过程中可能造成农杆菌污染，最终导致外植体褐化死亡。具体操作如下:
将菌液(实施例2)摇匀，吸取3mL菌液加到继代3天的杂交鹅掌楸悬浮细胞(实施例1)中，并加入乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L。静置l-3min后,置于23°C,95r/min的恒温摇床继续振荡培养，即共培养。接种菌体后的外植体在细胞分裂、生长的同时，农杆菌在外植体切口面也增殖生长，该两者共同培养的过程称为共培养。农杆菌和外植体共培养是整个转化过程中非常重要的环节，因为农杆菌附着，T-DNA的转移及整合都在这共培养时期内完成，因此共培养技术条件的掌握是转化的关键。研究表明，农杆菌转化时，并不“侵入”到植物细胞中去，而是把T-DNA转移到植物细胞。农杆菌附着后不能立即转化，只有在创伤部位生存16h之后的菌株才能诱发肿瘤，这一段时间称为“细胞调节期”。因此，共培养时间必须长于16h。共培养时间太长，由于农杆菌的过度生长，植物细胞因受到毒害而死亡。实施例4脱菌培养。与农杆菌共培 养一段时间后的外植体表面及浅层组织中共生有大量的农杆菌，为杀死和抑制农杆菌的生长必须进行脱菌培养，使外植体更好地生长发育。所谓脱菌培养即把共培养后的植物材料转移到含有抗生素的培养基上。常用的抗生素有羧苄青霉素、头孢霉素及羧噻吩青霉素。具体操作如下:
I)将实施例3共培养约36h后的杂交鹅掌楸悬浮细胞经400目及150目的筛子过筛，待液体漏完，用50mL Z36杂交鹅掌楸单细胞培养基将400目的筛子上的单细胞反冲到250mL三角瓶中，置于23°C，95r/min的恒温摇床振荡培养。2)单细胞培养36h后，再用400目的筛子过筛一次，并用50mL加有头孢霉素500mg/L的杂交鹅掌楸单细胞培养基将筛子上的单细胞反冲回三角瓶中。并将单细胞以2mL每皿的浓度铺平板，培养基为加有头孢霉素500mg/L。约21天继代一次。3)继代一次后，可以观察到子叶胚。实施例5筛选培养。(I)待体子叶胚成熟，并长到2cm左右，将其挑出，转到MS基本培养基上生长，其中加有头孢霉素200mg/L，卡那霉素50mg/L。(2)约21天后更换一次培养基。一般继代2次后，就可以用于移栽。选择转化的细胞也是转化过程中的一个重要环节。选择抗生素加入选择培养基后，对细胞的生长产生一种选择作用，称之为选择压。本实验中选择标记基因用的是NPT-1I (新霉素磷酸转移酶)。表达NPT-1I基因的细胞表现出对抗生素卡那霉素的抗性。因此本实施例中用卡那霉素作为选择压。按照选择压加入的时期不同，可以分为三种，即前期选择、延迟选择和后期选择。前期选择是外植体共培养后，在转入愈伤组织或不定芽诱导的一开始就加入选择压，即先选择后再生；后期选择即先再生后选择。由于未转化的细胞在含选择压的培养基上不能生长，转化细胞生长能力太弱亦难于生长形成转化体；而在无选择压培养基中非转化细胞同样能生长，并对转化细胞有滋养作用，从而有利于转化细胞的生长，因此本实验选用后期选择。实施例6⑶S细胞学检测
⑶S基因存在于某些细菌体内，编码β -葡萄糖苷酸酶(β -glucuronidase,⑶S)，该酶是一种水解酶，能催化许多β_葡萄糖苷酯类物质的水解。绝大多数植物细胞内不存在内源的GUS活性，因而GUS基因被广泛用作转基因植物的报告基因。使用细胞学检测⑶S基因是通过X-Gluc为底物，通过显色反应直接观察到组织器官中GUS基因的活性。该方法不用将酶从组织中提取出来，而是使底物进入被测的植物组织、细胞或原生质体之中。将被检测的材料浸泡在含有底物的缓冲液中保温，若材料成功发生了⑶S基因转化，表达出⑶S，在适宜条件下该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物质，可用肉眼或在显微镜下观察到。
取植株长约2cm的体胚苗为GUS染色材料。将准备好的体胚苗浸泡在染液中，于37°C保温2h至过夜。⑶S染液配方:
Cl) 50mmol/L磷酸钠缓冲溶液(pH7.0):A液:称取NaH2PO4.2H20 3.12g溶于无菌水，定容至100ml。B液:称取NaH2PO4.12H20 7.17g溶于无菌水，定容至100ml。取39ml A液与61ml B液混合。(2)染色液:7.1ml 50mmol/L 憐酸钠缓冲溶液,0.2ml 10mmol/T, Na2EDTA,0.2ml5mmol/L K4 [Fe (CN)6], 0.2ml K3 [Fe (CN)6]，0.05ml 0.05% (v/v)Triton-100, 2ml 20% 甲酉享,0.25ml 0.5mg/ml X-Gluc0 配制 IOmlGUS 染液备用。以⑶S基因为报告基因，通过细胞学方法检测⑶S基因的瞬间表达、长期表达、通过分子生物学方法检测等确定外源基因的高效转化。肉眼或显微镜下观察，材料中的蓝色即为⑶S表达位点。如图2所示，左图是对照样，右图是⑶S转化体胚苗。可见，外源基因已被高效转化。实施例7
通过CTAB法，分别提取未经转化的杂交鹅掌楸植株DNA、经带有GUS标记基因侵染的杂交鹅掌楸植株DNA、根癌农杆菌质粒DNA，用质粒DNA作为正对照，未经转化的植株DNA作为负对照，用无菌水代替模板DNA为阴性对照，对转基因植株进行PCR检测。从PCR结果的电泳图谱上可以看出，泳道I为Marker,泳道2为质粒DNA,泳道3为未经转化植株DNA,泳道4为水，泳道5至泳道34为经农杆菌侵染植株DNA。由图3显示，泳道9、12、13、16、18、19、20、21、22、23、24、25、28、29、30、32、33、34都出现了目的条带，即初步检测60%的经农杆菌侵染的植株中可以检测到GUS基因，研究结果进一步表明GUS基因整合进转化植株的基因组。按常规方法提取带有GUS标记基因侵染的杂交鹅掌楸植株的RNA，反转录成cDNA后，利用⑶S基因的特异引物进行PC R反应，检测上述基因组PCR反应阳性的植株中⑶S基因的表达情况，RT-PCR的结果表明(图4)，⑶S基因不仅成功整合进基因组、并且在转录水平进行了表达。由以上细胞学和分子生物学的研究结果可以看出，以胚性细胞为受体、通过体细胞胚胎发生方式实现植株再生的杂交鹅掌楸遗传转化体系已经建立起来。
权利要求
1.一种杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)杂交鹅掌楸转化受体的建立:取继代2周的杂交鹅掌楸愈伤组织细胞，接入含有杂交鹅掌楸M13液体培养基的三角瓶中，23°C，95r/min的恒温摇床振荡培养；每7天继代一次，继代3次后建立出悬浮细胞系，即为杂交鹅掌楸转化受体； (2)农杆菌制备:先活化EHA105单菌落，在含有卡那霉素50mg/L、链霉素30mg/L的LB液体培养基中，28°C，280r/min振荡培养至0D_为0.6-0.8，4°C离心收集菌体，用杂交鹅掌楸M13液体继代培养基重悬菌体，将菌液浓度稀释至0.5左右； (3)侵染:取3ml菌液加到杂交鹅掌楸转化受体中，并加入乙酰丁香酮lOOymol/L； 静置l_3min后，置于23°C、95r/min的恒温摇床中，继续振荡培养16 40h ； (4)脱菌培养:将杂交鹅掌楸悬浮细胞经400目及150目的筛子过筛，用Z36杂交鹅掌楸单细胞培养基将400目 的筛子上的单细胞悬浮，置于23°C、95r/min的恒温摇床，振荡培养36h后，再用400目的筛子过筛一次，并用加有头孢霉素500mg/L的Z36杂交鹅掌楸单细胞培养基将400目筛子上的单细胞收集；并将单细胞以2mL每皿的浓度铺平板，培养基加头孢霉素500mg/L，约21天继代一次；继代一次后，可以观察到子叶胚； (5)筛选培养:待子叶胚成熟，长到2cm左右，将其挑出，转到MS基本培养基上生长，其中加有头孢霉素200mg/L，卡那霉素50mg/L。
2.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，其特征在于:步骤(I)中，取继代2周的杂交鹅掌楸愈伤组织细胞5mL，将其接种到250mL的三角瓶中，并在瓶壁轻轻敲散；量取50mL杂交鹅掌楸M13液体培养基加入三角瓶中，将材料置于23°C，95r/min的恒温摇床振荡培养。
3.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，其特征在于:步骤(2)中，农杆菌制备，具体操作为: 1)将_70°C保存的EHA105菌液在冰上融化，用接种环蘸取少量菌液，接种到含有卡那霉素50mg/L，链霉素30mg/L的LB培养基上，将其置于28°C恒温培养箱中培养； 2)待其长出单菌落后，用接种环挑取单菌落，接种到含有卡那霉素50mg/L，链霉素30mg/L的LB培养基上,再活化一次,然后将其置于28°C恒温培养箱中培养； 3)待其长出单菌落后，用灭过菌的枪头挑取单菌落接种到含有IOmL加有卡那霉素50mg/L，链霉素30mg/L的LB液体培养基的三角瓶中，28°C、220r/min振荡培养； 4)约20h后，吸取2mL菌液，接种到含有50mL加有适量抗生素的LB液体培养基的三角瓶中，28°C、280r/min 振荡培养至 OD600 为 0.6-0.8 ； 5)待农杆菌培养到OD6tltl为0.6-0.8时，取25mL菌液于50mL离心管中，于5000r/min，4°C离心IOmin,去除上清,收集菌体； 6)用杂交鹅掌楸液体继代培养基重悬菌体，将菌液浓度稀释至0D_为0.5。
4.根据权利要求1或3所述的杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，其特征在于:所述的EHA105带有35S KUS基因和NPT-1I基因。
5.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，其特征在于:步骤(3)中，共培养36 40h。
6.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，其特征在于:步骤(5)中，每21天继代一次，继代2次后，就可用于移栽。
全文摘要
本发明公开了一种杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，包括杂交鹅掌楸转化受体的建立、农杆菌制备、侵染、脱菌培养和筛选培养。本发明以杂交鹅掌楸悬浮培养的单细胞作为遗传转化受体系统，通过农杆菌介导的方法，以GUS基因为报告基因，通过细胞学方法检测GUS基因的瞬间表达、长期表达、通过分子生物学方法检测等确定外源基因的高效转化。本发明采用杂交鹅掌楸单细胞起源的体细胞胚胎发生体系，有利于外源基因的导入，并降低了嵌合体的产生。
文档编号A01H5/00GK103088059SQ201310037010
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月31日 优先权日2013年1月31日
发明者陈金慧, 王丹, 施季森, 成铁龙, 王鹏凯 申请人:南京林业大学