专利名称：：一种杂交鹅掌楸快速分子检测特异性引物及其用法的制作方法
技术领域：
：本发明涉及杂交鹅掌楸的分子检测引物及其用法，专用于鹅掌楸、北美鹅掌楸和杂交鹅掌楸快速分子检测和鉴定，属于植物新品种鉴定领域。
背景技术：
：木兰科鹅掌楸属(hWo&"^wO植物现存2个种，一种是北美鹅掌楸(Z.Linn.);另一种为鹅掌楸U.c/z/"e"se(Hemsl.)Sarg.〕。鹅掌楸生长迅速，树干圆满通直，材质优良，病虫害很少，叶形奇特，花冠色泽淡雅，具有较高的观赏价值，因此，鹅掌楸是优良的园林绿化与工业用材树种(王章荣，等.鹅掌楸属树种杂交育种与利用[M].北京:中国林业出版社，2005)。自1963年我国已故著名林木遗传育种学家叶培忠教授成功获得杂交鹅掌楸以来，南京林业大学先后培育出一批杂交鹅掌楸优良家系与无性系，经过40余年的试验研究，证实了杂交鹅掌楸具有非常强的杂种优势。与2个亲本种鹅掌楸与北美鹅掌楸相比，杂交鹅掌楸表现出速生、花色艳丽、叶大、抗逆性强、适应性广、几乎无病虫害等优势，是优良的园林绿化及珍贵用材树种。迄今为止，杂交鹅掌楸已在江苏、福建、湖南、浙江、江西、山东、湖北、湖南、贵州、云南、北京等地区推广，产生了巨大的经济和社会效益。2007年，因其叶形似中国传统服装马褂以及杂交鹅掌楸速生、观赏性好、适应性广等优点而被列为2008年北京奥运会的奥运树。随着人们对杂交鹅掌楸利用价值的不断认识，其推广应用规模迅速扩大，导致其苗木供不应求，苗木价格不断攀升。为追逐利益的最大化，许多不法苗木经营商常将鹅掌楸或北美鹅掌楸苗木假冒杂交鹅掌楸苗木出售，造成杂交鹅掌楸苗木市场的混乱，无形中伤害了正规苗木生产者与经营商的积极性，必将阻碍杂交鹅掌楸的推广和发展。因此，生产上急需一种方便、快速、可靠的杂交鹅掌楸鉴别方法。传统的鹅掌楸种类鉴定基于形态特征(刘洪谔，沈湘林,曾玉亮.，中国鹅掌楸、美国鹅掌楸及其杂种在形态和生长形状上的遗传和变异，浙江林业科技，1991，11(5):1822)、解剖特征(叶金山,周守标,王章荣.杂种鹅掌楸叶解剖结构特征的识别.植物资源与环境，1997，6(4):5860)和同工酶谱带(黄敏仁,陈道明，杂种马褂木的同工酶分析，南京林产工业学院学报，1979，1(2):156158)等方面。但形态特征在苗期差异并不明显且受环境因素影响较大、同工酶标记也受基因表达的限制而影响其使用。基于检测DNA水平多态性的分子标记技术的发展为杂种识别和亲本选配提供了有效的途径。李周岐、王章荣采用RAPD分子标记技术，对杂种鹅掌楸识别方法进行了探讨(李周岐，王章荣.用RAPD标记进行鹅掌楸杂种识别和亲本选配.林业科学，2002，38(5):169~174)，利用RAPD指纹图谱进行杂种马褂木无性系鉴定(李周岐，王章荣.杂种马褂木无性系随机扩增多态DNA指纹图谱的构建.东北林业大学学报，2001，29(4):5-8)。但基于RAPD技术的分子检测与品种鉴定存在以下主要缺陷(l)RAPD的检测受反应条件的影响较大，其重复性和稳定性差，从而严重影响检测结果的可信度。(2)需要使用多对引物，操作烦琐，耗时长，不能达到快速、准确鉴定的目标。
发明内容本发明的目的是克服以往杂交鹅掌楸鉴定方法存在的缺陷，提供结果高度准确可靠、易于操作、灵敏度高的杂交鹅掌楸的检测和诊断方法。该方法可以直接应用于生产实践，对于杂交鹅掌楸苗木的鉴定和交易无疑具有十分重要的意义。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下一种杂交鹅掌楸快速分子检测特异性引物，包括鹅掌楸特异性SSR引物对LT008L/R，其引物序列为LT008LCCGAACGATGATAAAGTGAGLT008RGTAGGTTTGAAGGGAAGAGG上述LT008L和LT008R引物对在鹅掌楸中特异性扩增出190bp的产物，在北美鹅掌楸中特异性扩增出180bp的产物，在杂交鹅掌楸中特异性扩增出180bp和190bp双带位的产物。上述杂交鹅掌楸快速分子检测特异性引物的用法，包括DNA提取采用改进的CTAB裂解-硅珠吸附法，按照如下的PCR反应体系和反应程序用引物对LT008L和LT008R对鹅掌楸的样本进行PCR扩增；PCR的反应体系lOpL，包括模板DNA1^L(约20~25ng)、10xBufferlpL、10mMdNTPs0.2nL、25mMMgCl2lpL、F-primer0.25pL、R-primer0.25^L、AmpliTaqGold0.05nL、ddH206.25nL;PCR反应程序为预变性94'C4min;梯度降温扩增15循环的94'C30s，60°C30s(此后每个循环退火温度均比前一个循环低OTC)，72'C30s;—般性扩增15循环的94。C30s，49.5。C30s，72。C30s;延伸72。Clh和最终的保存4。C;然后对PCR产物用8%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后采用了银染的方法对PCR扩增产物进行检测，根据扩增产物的有无和大小来判定结果。本发明的关键技术是鹅掌楸简单序列重复(simplerepeatsequence,SSR)标记引物。所用的引物来自于本实验室从北美鹅掌楸EST序列中开发出的EST-SSR引物(XuM,LiHQZhangB.FifteenpolymorphicsimplesequencerepeatmarkersfromexpressedsequencetagsofLiriodendrontulipifera.MolechlarEcologyNotes,2006，6:728~730)。北美鹅掌楸ESTs序列来自dbEST数据库(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/in-dex.html)。将EST序列下载后利用Phrap软件拼接聚类得到6520条EST序列。然后用SSR鉴定软件SSRIT(SimpleSequenceRepeatIdentificationTool)对这6520条EST序列进行SSR检索(http:〃www.gramene.org/gramene/searches/ssrt-ool)，对所检索到的SSR-ESTs序列进行引物设计，所用弓I物设计软件为Primer3.0(http:Wwww.genome.wi.mit.edu)。最后成功设计176对EST-SSR引物。随机选择鹅掌楸、北美鹅掌楸各4个DNA样品，杂交鹅掌楸3个样品对176对引物进行PCR扩增，筛选出有产物，主带清晰的种特异性引物8对；然后再用不同种源的鹅掌楸11个DNA样品、北美鹅掌楸5个DNA样品，不同交配组合的杂交鹅掌楸4个DNA样品，对初筛所得到的引物进行复筛，最后选取一对特异性强、通用性好且多态性高的特异性SSR引物，即LT008L/R。该引物的EST序列号为250734，共273个碱基。该引物对在鹅掌楸中特异性扩增出190bp的产物，在北美鹅掌楸中特异性扩增出180bp的产物，在杂种鹅掌楸中特异性扩增出190bp和180bp两种产物。本发明方法适用于鹅掌楸、北美鹅掌楸和杂交鹅掌楸的快速可靠的分子检测和鉴定，对于杂交鹅掌楸苗木的鉴定具有重要的实用价值，与国内其他方法相比，本发明具有以下的技术优势1、结果高度准确、可靠本发明已经对不同种源的鹅掌楸与北美鹅掌楸样本，不同杂交组合的杂交鹅掌楸的DNA样本进行了检测，检测结果100%准确，为检测结果提供了高度的可靠性。2、操作简便快速本实验方法对样本进行简单处理、PCR扩增和常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳后即可以判断结果，无需对扩增的产物进行限制性内切酶酶切。一般整个检测过程可在4个小时内完成。3、检测结果灵敏度高对待检测样品仅需提供模板DNA20ng即可准确鉴定其所属种。4、取材方便、经济效益明显本方法实验采样方便，叶片、冬芽、花等组织或器官均可为实验材料，苗期、幼林期、成年大树均可取样，不受季节、地点限制。通过对鹅掌楸苗木进行分子鉴定可以避免苗木生产与销售过程中出现鱼龙混杂的现象，对于杂交鹅掌楸的苗木生产与销售具有十分重要的经济效益。图1引物LT008L/R对鹅掌楸、北美鹅掌楸和杂交鹅掌楸的基因组DNA样本的PCR扩增电泳图。其中，M:DNA标记，1-7为不同组合的杂交鹅掌楸群体，8-14为北美鹅掌楸群体，15-21不同种源地的鹅掌楸群体。图2引物LT008L/R对鹅掌楸、北美鹅掌楸和杂交鹅掌楸的基因组DNA样本的PCR扩增电泳图。其中M:DNA标记，1-6为不同组合的杂交鹅掌楸群体，7-12为北美鹅掌楸群体，13-18为不同种源地的鹅掌楸群体。具体实施例方式本发明的技术内容是微卫星SSR引物一对LT008L/R，其引物序列为CCGAACGATGATAAAGTGAGGTAGGTTTGAAGGGAAGAGG该对引物可准确地鉴定鹅掌楸、北美鹅掌楸和杂种鹅掌楸。在鹅掌楸中特异性扩增出190bp的产物，在北美鹅掌楸中特异性扩增出180bp的产物，在杂交鹅掌楸中特异性扩增出180bp和1卯bp两种产物。各种鹅掌楸存在条件下的鉴定方法DNA提取采用改进的CTAB裂解-硅珠吸附法，按照如下的PCR反应体系和反应程序用引物对LT008L/R对鹅掌楸的样本进行PCR扩增。PCR的方应体系10nL，包括模板DNAl^iL(20~25ng)、10xBufferlpL、10mMdNTPs(上海捷瑞生物有限公司)0.2pL、25mMMgCl2lpL、F-primer0.25pL、R-primer0.25pL、AmpliTaqGold(上海捷瑞生物有限公司)0.05pL、ddH206.25pL。PCR反应程序为预变性94。C4min;梯度降温扩增15循环的94'C30s，60'C30s(此后每个循环退火温度均比前一个循环低0.7'C);72'C30s，一般性扩增15循环的94'C30s，49.5。C30s，72。C30s;延伸72。Clh和最终的保存4。C。所用的PCR仪为APPL正DBIOSYSTEMSGeneAmpPCRsystem9700。然后对PCR产物加7uL上样缓冲液，进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(500mL8。/。丙烯酰胺含尿素210g，甲叉lg，丙烯酰胺39g，10XTBE50ML)。200v稳压电泳lhours左右后固定染色；固定10min(固定液10%乙醇，0.5%乙酸)，ddH20漂洗2次每次2min;再用0.15%硝酸银染色7min，双蒸水漂洗2次每次2min，最后显影(1.5%氢氧化钠，0.00756%四硼酸钠，1%甲醛)至条带清晰，然后对扩增产物进行大小判断。实施例l:引物LT008L/R对鹅掌楸、北美鹅掌楸和杂种鹅掌楸进行种类鉴定。利用引物对LT008L/R对鹅掌楸、北美鹅掌楸和杂种鹅掌楸各15个样本进行种类鉴定。结果在鹅掌楸群体上都特异地扩增出190bp的产物，在北美鹅掌楸群体上都特异地扩增出180bp的产物，在杂交鹅掌楸群体上特异地扩增出180bp和190bp两种产物杂，PCR的方应体系10pL，包括模板DNAlpL10xBufferlpL、10mMdNTPs0.2(上海捷瑞生物有限公司)、25mMMgCl2lpL、F-primer0.25pL、R-primer0.25^L、AmpliTaqGold0.05(上海捷瑞生物有限公司)、ddH206.25^L。PCR反应程序为预变性94。C4min;梯度降温扩增15循环的94。C30s，60'C30s(此后每个循环退火温度均比前一个循环低0.7。C);72'C30s,—般性扩增15循环的94'C30s，49.5°C30s，72°C30s;延伸72°Clh和最终的保存4°C。所用的PCR仪为APPLIEDBIOSYSTEMSGeneAmpPCRsystem9700。所用的样品具体情况见表1，检测结果见图1。表l、弓I物LT008L/R对鹅掌楸、北美鹅掌楸和杂交鹅掌楸<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例2:引物LT008L/R对不同于实施例1的鹅掌楸、北美鹅掌楸和杂种鹅掌楸进行种类鉴定。利用引物对LT008L/R对不同于实施例1中的鹅掌楸、北美鹅掌楸和杂种鹅掌楸各15个样本进行种类鉴定。结果在鹅掌楸群体上都特异地扩增出l卯bp的产物，在北美鹅掌楸群体上都特异地扩增出180bp的产物，在杂交鹅掌楸群体上特异地扩增出180bp和190bp两种产物。PCR的方应体系和PCR反应程序均同实例1的鹅掌楸的检测分析步骤。所用的样品具体情况见表2，检测结果见图2表2、引物LT008L/R引物对鹅掌楸、北美鹅掌楸和杂交鹅掌楸_各15个样本的特异性扩增结果_样本数量LT008L/R检测结果杂交组合(个)190bpl抑bpl卯，180bp鹅掌楸浙江松阳2+—_浙江富阳1+——四川叙永2+—江西庐山3+—云南西畴1+——云南马关1+—_浙江遂昌1+—_贵州松桃1+—_贵州黎平1+——浙江安吉1+——安徽绩溪1+—一北美鹅掌楸密苏里3_+_路易斯6_+_佐治亚6—+—杂交鹅掌楸南卡X桑植11—_+北美X庐山21一—+密苏里x黄山1_—+北美X庐山31__+路易斯X庐山11——+松阳x北卡1—_+北卡x松阳1——+路易斯x富阳1_+路易斯X庐山21_+路易斯x酉阳1——+南卡x松阳1_一+南卡X桑植21—_+庐山x路易斯1——+路易斯x松阳1_—+密苏里x庐山1_—+实施例3:利用本发明的特异性引物LT008L/R对鹅掌楸多父本混合控制授粉子代鉴定利用引物对LT008L/R对母本为南卡、路易斯和庐山，父本范围已知(庐山、富阳、密苏里、南卡、路易斯)的控制授粉子代进行的86个样本进行种类鉴定。PCR的方应体系和PCR反应程序均同实施例1的鹅掌楸的检测分析步骤。实验的具体结果见表3。表3、引物LT008L/R对鹅掌楸多父本混合控制授粉子代鉴定结果母本子代数量190bpLT008L/R检测结果180bp190,180bp鉴定结果南卡7—+一北美鹅掌楸(北美鹅掌楸)31—+杂交鹅掌楸路易斯1—+_北美鹅掌楸(北美鹅掌楸)19———+杂交鹅掌楸庐山24+——鹅掌楸(鹅掌楸)4——+杂交鹅掌楸SEQUENCELISTING<110>南京林业大学〈120〉一种杂交鹅掌楸快速分子检测特异性引物及其用法<130〉njfu080917<140〉2008100224416<141〉2008-07-21<160>2〈170>Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉20〈212〉DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉LT008L<400>1ccgaacgatgataaagtgag<210>2<211>20<212〉DNA〈213〉Artificial〈220〉<223>LT008R〈400〉2gtaggtttgaagggaagagg权利要求1、一种杂交鹅掌楸快速分子检测特异性引物，包括鹅掌楸特异性SSR引物对LT008L/R，其引物序列为LT008LCCGAACGATGATAAAGTGAGLT008RGTAGGTTTGAAGGGAAGAGG上述LT008L和LT008R引物对在鹅掌楸中特异性扩增出190bp的产物，在北美鹅掌楸中特异性扩增出180bp的产物，在杂交鹅掌楸中特异性扩增出180bp和190bp两种产物。2、权利要求1所述杂交鹅掌楸快速分子检测特异性引物的用法，包括DNA提取采用改进的CTAB裂解-硅珠吸附法，按照如下的PCR反应体系和反应程序用引物对LT008L和LT008R对鹅掌楸的样本进行PCR扩增；PCR的反应体系10pL，包括模板DNAluL、10xBufferlpL、10mMdNTPs0.2pL、25mMMgCl2ljxL、F-primer0.25^L、R-primer0.25nL、AmpliTaqGold0.05nL、ddH206.25nL;PCR反应程序为预变性94'C4min;梯度降温扩增15循环的94'C30s，60'C30s(此后每个循环退火温度均比前一个循环低0.7'C)，72'C30s;—般性扩增15循环的94。C30s，49.5。C30s，72。C30s;延伸72°Clh和最终的保存4'C。；然后对PCR产物用8%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后采用银染方法对PCR扩增产物进行检测，根据扩增产物的有无和扩增产物大小来判定结果。全文摘要本发明公开了一种杂交鹅掌楸分子检测引物及其用法，专用于鹅掌楸、北美鹅掌楸、杂交鹅掌楸的快速分子检测和鉴定，属于植物新品种分子鉴定领域。设计了一对SSR引物对即LT008L/R，该引物对在鹅掌楸中特异性扩增出190bp的产物，在北美鹅掌楸中特异性扩增出180bp的产物，在杂交鹅掌楸中特异性扩增出180bp和190bp两种产物。本发明采用一对特异性SSR引物，进行一次PCR扩增反应，利用8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，可直接根据产物的片断进行判断。本发明可直接应用于杂交鹅掌楸及鹅掌楸、北美鹅掌楸种水平的鉴定。文档编号C12N15/11GK101348830SQ20081002244公开日2009年1月21日申请日期2008年7月21日优先权日2008年7月21日发明者冯源恒,张红莲,李火根,猛胥申请人:南京林业大学