专利名称：杂交鹅掌楸体胚发生同步化控制方法
技术领域：
本发明涉及林业中的种苗繁殖生物技术领域，具体涉及一种杂交鹅掌楸体胚发生 同步化控制方法。
背景技术：
木兰科鹅掌楸属(Liriodendron)树种在自然界仅存两个种，即北美鹅掌楸 (L. tulipifera Linn.)和鹅掌楸(L. chinense (Hemse.) Sarg)，现存资源十分稀少，是我国 二级珍惜濒危保护树种。鹅掌楸具有生长迅速，干形直，木材用途广，叶和花观赏价值高等 特点，特别是南京林业大学叶培忠教授等人利用中国马褂木与北美鹅掌楸杂交试验成功获 得杂交鹅掌楸(Liriodendron chinense XL. tulipifera)，具有明显的杂种优势，其生长速 度快，抗性强，树姿优美，花色美丽，叶形独特，病虫害少，材质纹理细腻，易加工，是集荒山 造林、工业用材、园林观赏、绿化等多种用途于一身的优良树种，市场前景广阔。目前杂交鹅掌楸主要通过人工杂交的有性繁殖及扦插、嫁接等传统方法进行繁 殖。但杂交制种效率低、种子量少，Fl代的种子发芽率很低，同时由于扦插生根难(季孔庶， 2005)，而嫁接繁殖系数又低，很大程度上限制了优良杂种的快速繁殖和利用，因此以传统 的繁殖方式育苗，速度缓慢，优良种苗数量远远供不应求。有学者报导过杂交鹅掌楸植物组 织培养途径进行快速繁殖的一些研究(刘根林，2000 ；陈金慧等，2002 ；蒋泽平等，2004 ；蔡 桁等，2005 ；田敏等，2006)，但均未见生产性应用。相对于传统的育苗方式，体细胞胚胎发生 具有数量多、速度快、结构完整、再生率高等优点。陈金慧等于2003年利用固体培养基培养 杂交鹅掌楸未成熟胚，成功诱导了杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生，使杂交鹅掌楸的快速繁育 体系取得了重大进展，并成功进入工厂化生产育苗，在很大程度上缓解了市场供需矛盾，但 杂交鹅掌楸种苗的供应仍然不能满足市场的需求。植株再生无疑为解决这种供需矛盾提供了一种有效方案，并且一个成熟的体胚发 生悬浮体系对进行植物体细胞杂交、遗传转化、植物种质资源的超低温保存以及对植物体 胚发育等方面的研究提供了极大的便利。同时，悬浮培养中同步化的实现，是利用生物反应 器建立规模化培养体系的基础，同时也是研究体胚发生分子机理的理想平台，因此实现悬 浮培养中体胚发生的同步化控制显得尤为重要。培养同步分裂的细胞群，可以在人工的控制下获得具有同样代谢活性和功能的细 胞所组成的大群体，为获得同步形态发生的胚状体奠定基础。体胚的同步化是指促使所有 培养的细胞或发育中的细胞团块进入同一个分裂时期，只有同步化了细胞才可能成批地产 出成熟胚胎。因此控制体胚的同步发生要从控制细胞的同步分裂开始，目前控制细胞同步 分裂的常用方法主要是化学诱导和物理选择。大多时候单一的同步化控制方法并不能取得 最佳效果，这就需要将两种或多种方法综合应用。根据所选外植体的生物性状及生理生化 特点采用不同的方法组合或试剂组合达到最佳的同步诱导效果。关于鹅掌楸属体胚发生的悬浮培养体系，仅有kott Merkle等(1991)报道过北 美鹅掌楸的体胚发生，但未见大规模生产的报道。目前，通过对杂交鹅掌楸的胚胎发生过程进行的扫描电镜观察以及对这一过程中ATP酶活性进行的超微细胞化学定位，对于非胚性 细胞向胚性细胞的转化，胚性细胞的进一步发育分化，以及体细胞胚胎发生中胚性细胞的 起源及发育已有了初步的了解，同时对体胚系统的遗传稳定性的分析表明，杂交鹅掌楸体 细胞胚胎再生体系具有长时间保持旺盛的体胚发生能力(陈金慧等，2006)。陈志等Q007) 也通过对影响悬浮培养的一些物理因素如摇床转速、细胞起始密度，继代周期，悬浮物的选 择等的研究初步建立了杂交鹅掌楸胚性愈伤悬浮培养体系，但高频、同步的杂交鹅掌楸体 胚发生悬浮培养体系的建立还未见报道。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杂交鹅掌楸体 胚发生同步化控制方法，为满足杂交鹅掌楸的大规模生产提供有效的方法。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下本发明的杂交鹅掌楸体胚发生同步化控制方法，以悬浮培养条件下的胚性细胞为 起始材料，在液体培养基上进行扩大培养并使细胞分散，采用物理过筛和密度梯度离心结 合的方法使植物细胞群大小均一，同时调节激素的种类和用量诱导植物细胞胚性，调整液 体培养物密度分级转接到含有适量ABA的培养基上，加大渗透压，促使体胚高频同步发生， 最后获得生长状态正常一致的再生植株。具体实施包括以下步骤(1)杂交鹅掌楸愈伤细胞悬浮系扩大培养在无菌条件下，按接种量为2g/50ml将保存在固体培养基上的胚性愈伤组织接入 液体诱导培养基I，控温25 士 2°C，在转速为95r ^irT1的摇床上暗培养2 3周，获得初始 材料；其中，每周继代一次，继代按体积比为1 9将培养物接入液体诱导培养基I，液体诱 导培养基 I 的配方为=MS 培养基，2mg · L、，4-D，0. 2mg · Γ^-ΒΑ, 500mg · L^1LH, 30g · Γ1 蔗 糖；(2)激素诱导和渗透压调节提高转化率按体积比为1 9将步骤(1)获得的初始材料接入液体诱导培养基II，控温 25士2°C，在转速为95r ^irT1的摇床上暗培养7 9d，获得悬浮培养物；其中，液体诱导培 养基 II 的配方为=MS 培养基，0. 2mg · ^2,4-0,0. 5mg · L^1KT, 200mg · L^1CH, 50g · Γ1 蔗糖；(3)机械过筛和密度梯度离心物理筛选将步骤( 悬浮培养物经孔径为400 μ m、280 μ m、150 μ m、38 μ m各层网筛，收集各 层细胞，将各层细胞分别铺于滤纸上，然后置于半固体成熟培养基上培养2 5周后获得同 步的成熟胚；其中，半固体成熟培养基的配方为MS培养基，2 IOmg · L^1ABA, 2g · L^1AC, IOOmg · L-1CH, 40g · L-1 蔗糖，5g · L-1 琼脂；(4)植株再生将成熟胚转移至生长培养基上促进萌发生长，将萌发的小植株转至植株生长培养 基上培养2 7周，即获得再生植株；其中，生长培养基配方为MS培养基，Img · L-1ABA, 30g · L-1蔗糖，6. 5g · L-1琼脂；植株生长培养基配方为=MS培养基，30g · L-1蔗糖，6. 5g · L-1 琼脂；培养条件均为25士2°C，16h(光照)/8h(黑暗)培养。步骤(3)中，对38 150 μ m的细胞团还可继续采用18% Ficoll密度梯度离心或 多次冲洗直接离心培养液的方法，去掉管状空细胞和松散的细胞团，取密实的细胞团，调整密度至500 600细胞团/mL转移至覆滤纸的固体培养基上培养，添加2 IOmg · L^1ABA 促进体胚的成熟并抑制异常胚的产生。同时，经过筛离心后的细胞团也可以在液体成熟培 养基中继续培养两周左右，再进行二次过筛，取150 280 μ m的胚性细胞团转半固体成熟 培养基培养，其中，液体成熟培养基配方为MS培养基，2 IOmg · L^1ABA, IOOmg · L^1CH, 40g · L-1 蔗糖；步骤(3)中，150 400μπι的细胞团多为胚状体或连体多胚，其中150 280 μ m的细胞团一般为较早期的球状原胚，可直接转移至覆滤纸的固体培养基上，并加 IOmg · L-1ABA,同时使用60 90mg · Γ1蔗糖提高渗透压培养。280 400 μ m的细胞团多 为较大的胚状体或连体多胚，这两层细胞均可如上直接转至半固体成熟培养基培养，也可 以在液体环境下使用低浓度的2，4-D，诱导产生更多次生胚，即所谓的二次培养，然后转半 固体成熟培养基培养；步骤(3)中，大于400 μ m的细胞团体胚发生方式多由愈伤团产生，在悬浮系中所 占比重较大，可以转半固体成熟培养基，如(2)所述方法调节体胚后期同步化发育，也可以 转回诱导培养基I继续增殖，实现循环培养；对于38 150 μ m的细胞团，从杂交鹅掌楸的胚性细胞团转移至半固体成熟培养 基培养到形成再生植株仅需7 8周，中途不用更换培养基，成苗后用植株生长培养基进行 壮苗；而对于150 400 μ m的细胞团和大于400 μ m的细胞团，各阶段完成发育所需时间较 长，约为11 13周，其间需更换新鲜培养基，且后期需采用渗透压调节的方法，逐步降渗， 同时降低ABA含量至2mg ·厂1左右，促进体胚正常萌发。以上杂交鹅掌楸体胚发育同步化控制的完整技术路线参见图1。有益效果经上述同步化调控后，在球形胚阶段的经分级筛选的杂交鹅掌楸体胚 发育同步率达90%左右；而在心形及鱼雷形胚阶段的分级处理同步化率在室温条件下为 40%左右，经过适当时间的冷藏会使同步化的比率有所提高；由球形胚阶段的材料发育而 来的成熟体胚向再生植株转化率可达70% 80%。此外，由于该同步化调控方法将材料进 行了分级处理，根据各层的状态特点制定了不同的下游操作流程，在实验和生产实践中可 因材而用，如38 150 μ m材料可直接成苗不需转换培养基，且能观察到胚胎的早期发育状 态，因此可主要用来进行相关实验的材料观察和迅速成苗用；150 400 μ m的材料经过降 渗处理和二次培养可用于扩大生产使用；大于400 μ m的细胞可用于循环培养增殖保种用 等。分级处理的同步化调控方法降低了细胞间的养分竞争，刺激更多胚性细胞的生成，同时 也方便了人工针对不同状态材料的统一调控，因此，不仅充分利用了植物材料，提高了同步 性，而且缩短了培养时间，提高了体胚发生的频率和正常植株的转化率，降低了人工操作的 难度，为实验研究和工厂的进一步规模化生产打下了良好的基础。
图1为杂交鹅掌楸体胚发育同步化控制的完整技术路线。其中虚线框内调控方法 为机动选择方法。图2是本发明杂交鹅掌楸体胚发生同步化控制方法主要工艺示意图。其中，A为液 体诱导培养基I培养的胚性悬浮细胞系；B为液体诱导培养基II培养的胚性悬浮细胞系；C 为将悬浮培养物经孔径为400 μ m、280 μ m、150 μ m、38 μ m各层网筛，收集各层细胞；D为将5各层培养物铺于直径9cm的滤纸上，然后置于半固体成熟培养基上培养；Dl为细胞团颗粒 直径介于38 150 μ m、D2为细胞团颗粒直径介于150 280 μ m、D3为细胞团颗粒直径介 于观0 400 μ m、D4为细胞团颗粒直径大于400 μ m ;E为不同层次经2 5周后获得同步 的成熟胚；F为将成熟胚转移至不覆滤纸的生长培养基上促进萌发生长；G为将萌发的小植 株转至植株生长培养基上，并换大容器培养；H为收集38 150 μ m的胚性细胞于液体诱导 培养基II中培养10 15d ；I为再次过筛，收集150 280 μ m的球形胚状体J为将收集 到的球形胚状体转入液体成熟培养基中培养，两周后得到同步的成熟胚；K为将大于150 400 μ m的各层重新置于液体诱导培养基II中继续培养；L为将大于400 μ m的细胞团重新 置于液体诱导培养基I中完成循环培养。图3是分级培养前的材料预培养状态照片。其中，A为液体诱导培养基I培养七 天胚性细胞悬浮系；B为经液体诱导培养基II处理的悬浮细胞。图4是38 150 μ m细胞层经Ficoll密度梯度离心处理的体胚发育状况显微照 片。其中，A为通过筛选所得38 150 μ m的悬浮培养细胞；B为经18% Ficoll液密度梯 度离心分离后所得培养细胞；C为在液体成熟培养基中培养7 IOd后发育为球形胚；D为 在液体成熟培养基中继续培养7 IOd后发育为心形及鱼雷形胚，图中比例尺均为200 μ m。图5是过筛分级培养各层培养物的生长发育状况照片和转移至固体培养前液体 培养物的显微照片。其中，第一横排为显微照片，第二横排为照片；从左至右每列为对应一 组，A组为> 400 μ m培养物的生长发育状况照片和转移至固体培养前液体培养物的显微照 片，B组为280 400 μ m培养物的生长发育状况照片和转移至固体培养前液体培养物的显 微照片；C组为150 280 μ m培养物的生长发育状况照片和转移至固体培养前液体培养物 的显微照片；D组为38 150 μ m培养物的生长发育状况照片和转移至固体培养前液体培 养物的显微照片。图6是转固体培养不同接种密度下体胚的生长发育状况照片。其中，第一横排接 种量为300细胞团/mL，第二横排接种量为600细胞团/mL ；从左至右每列为对应一组，A组 为培养2周，B组为培养4周；C组为培养7周。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例来对本发明做进一步的解释。实验材料据于施季森、陈金慧等发明专利(ZL 02 1 12947. 7)所描述的杂交鹅 掌楸体胚诱导方法，于2006-2009年重新杂交并取鹅掌楸杂交组合的未成熟胚诱导体胚， 并通过多次筛选获得的具有稳定发生能力的胚性细胞。诱导培养基I 配方为:MS, 2mg · L-12，4_D，0. 2mg · L-16_BA，500mg · L^1LH, 30g · L-1 蔗糖。诱导培养基II 配方为:MS,0. 2mg · L_12,4-D,0. 5mg · L^1KT, 200mg · L^1CH, 50g · L-1 蔗糖。半固体成熟培养基配方为MS，5mg· L^1ABA, 2mg · L^1AC, 200mg · L^1CH, 40g · L—1 蔗 糖，Sg.L—1琼脂。植株生长培养基配方为MS，30g · L—1蔗糖，6. 5g · L—1琼脂。MS培养基成分单位mg · Γ1
NH4NO3 :1650KNO3 :1900CaCl2 · 2H20 :440MgSO4 · 7H20 370KH2PO4 170KI :0. 83H3BO3 :6. 2MnSO4 · 4H20 :22. 3ZnSO4 · 7H20 :8. 6Na2MnO4 · 2H20 :0. 25CuSO4 · 5H20 :0. 025CoCl2 · 6H20 :0. 025FeSO4 · 7H20 (27. 8) +Na2-EDTA · 2H20 (37. 3)肌醇100烟酸0.5盐酸吡哆醇(维生素B6) :0. 5盐酸硫胺素(维生素Bi) 0. 1甘氨酸2实施例1一种杂交鹅掌楸体胚发生同步化控制方法，如附图2所示的操作路线，包括以下 步骤(1)取2g左右保存在固体培养基上的胚性愈伤组织接种于250ml三角瓶中，加 50ml诱导培养基I，放置于摇床上，95r ^mirT1,暗培养，隔周以体积比为1 9培养物与诱 导培养基I继代，连续继代2 3周，获得初始材料，将初始材料充分摇散，呈均勻颗粒状， 如图3A所示。(2)将步骤(1)处理的初始材料倒于50ml量筒中，自动沉降!Mins，倒去上清，以 体积比为1 9培养物与培养基比例加入诱导培养基II，移入250ml三角瓶中，同步骤(1) 培养条件，继续培养1周，此时得到的为分级处理前材料，如图3B所示。(3)将步骤(2)培养的材料倒于从上至下网孔逐渐减小的叠垛网筛上，用MS培养 基冲洗2 3次；将各层网筛分别反扣于漏斗上，用少量MS将网层上的材料分别冲洗收集 起来。对38 150 μ m的材料用移液器取一滴在细胞计数器上，观察密度，添加培养基，调 整材料密度至300 600细胞团/mL ；对于精确实验要求的材料，可将该层多次冲洗或置于 用与培养液等渗的3%的蔗糖水溶液为溶剂，18%的Ficoll密度梯度离心液中，200g转速 离心lOmin，收集位于Ficoll层的细胞，用液体培养基MS冲洗后重新在液体成熟培养基中 培养，如图4所示；大于150 μ m的材料可视情况涂布于半固体成熟培养基上，各层生长状况 如图5所示，也可以继续分别置于诱导培养基I和II中继续培养，实现二次培养和循环培 养；(4)用移液器将步骤(3)中调整密度后的悬浮细胞均勻涂布在垫脱脂棉的滤纸 上，9cm滤纸，约加1 anl，待多余液体吸干后，将培养物连同滤纸一起转至半固体成熟培养基上(IOcm培养皿每皿约50ml培养基)，封口，25士2°C，黑暗培养；约四周后，体胚长成 子叶胚状，转25士2°C，1 (光照)/8h (黑暗)，继续培养2 3周，长成小植株，图6为不同 接种密度情况下植株的生长状况；将生长整齐的小植株转至植株生长培养基上，改用培养瓶，25士2°C，1 (光 照)/ (黑暗)培养4 5周，待长出侧根可转入苗圃培养。实施例2按照实施例1的方法操作步骤⑴、(2)，步骤(3)还可以采用以下操作对38 150 μ m的细胞团还可继续采用18 % Ficoll密度梯度离心或多次冲洗 直接离心培养液的方法，去掉管状空细胞和松散的细胞团，取密实的细胞团，调整密度至 500 600细胞团/mL转移至覆滤纸的固体培养基上培养，添加2 IOmg -L^1ABA促进体胚 的成熟并抑制异常胚的产生。同时，经过筛离心后的细胞团也可以在液体成熟培养基中继 续培养两周左右，再进行二次过筛，取150 280 μ m的胚性细胞团转半固体成熟培养基培 养，其中，液体成熟培养基配方为=MS培养基，2 IOmg · L-1ABA, IOOmg · L^1CH, 40g · L-1蔗 糖；150 400 μ m的细胞团多为胚状体或连体多胚，其中150 280 μ m的细胞团一般 为较早期的球状原胚，可直接转移至覆滤纸的固体培养基上，并加IOmg · L-1ABA,同时使用 60 90mg -L"1蔗糖提高渗透压培养。280 400 μ m的细胞团多为较大的胚状体或连体多 胚，这两层细胞均可如上直接转至半固体成熟培养基培养，也可以在液体环境下使用低浓 度的2，4-D，诱导产生更多次生胚，即所谓的二次培养，然后转半固体成熟培养基培养；大于400 μ m的细胞团体胚发生方式多由愈伤团产生，在悬浮系中所占比重较大， 可以转半固体成熟培养基，如(2)所述方法调节体胚后期同步化发育，也可以转回诱导培 养基I继续增殖，实现循环培养；对于38 150 μ m的细胞团，从杂交鹅掌楸的胚性细胞团转移至半固体成熟培养 基培养到形成再生植株仅需7 8周，中途不用更换培养基，成苗后用植株生长培养基进行 壮苗；而对于150 400 μ m的细胞团和大于400 μ m的细胞团，各阶段完成发育所需时间较 长，约为11 13周，其间需更换新鲜培养基，且后期需采用渗透压调节的方法，逐步降渗， 同时降低ABA含量至2mg ·厂1左右，促进体胚正常萌发。
权利要求
1.一种杂交鹅掌楸体胚发生同步化调控方法，其特征在于，包括以下步骤(1)在无菌条件下，按接种量为2g/50ml将保存在固体培养基上的胚性愈伤组织接入 液体诱导培养基I，增殖培养，控温25士2°C，在转速为95r ^irT1的摇床上暗培养2 3周， 获得初始材料；其中，每周继代一次，继代按体积比为1 9将培养物接入液体诱导培养基 I，液体诱导培养基I的配方为=MS培养基，2mg · ^2,4-0,0. 2mg · Γ^-ΒΑ, 500mg · L^1LH, 30g · L-1 蔗糖；(2)按体积比为1 9将步骤⑴获得的初始材料接入液体诱导培养基II，控温 25士2°C，在转速为95r ^irT1的摇床上暗培养7 9d，获得悬浮培养物；其中，液体诱导培 养基 II 的配方为=MS 培养基，0. 2mg · ^2,4-0,0. 5mg · L^1KT, 200mg · L^1CH, 50g · Γ1 蔗糖；(3)将步骤( 悬浮培养物过孔径40(^111、28(^111、15(^111、384 111网筛，并按不同孔 径分层收集细胞，分别铺于滤纸上，然后置于半固体成熟培养基上培养2 5周后获得同 步的成熟胚；其中，半固体成熟培养基的配方为MS培养基，2 IOmg · L^1ABA, 2g · L^1AC, IOOmg · L-1CH, 40g · L-1 蔗糖，5g · L-1 琼脂；(4)将成熟胚转移至生长培养基上促进萌发生长，将萌发的小植株转至植株生长培养 基上培养，即获得再生植株；其中，生长培养基配方为MS培养基，Img · L1ABAdOg · Γ1蔗 糖，6. 5g · L-1琼脂；植株生长培养基配方为=MS培养基，30g · L-1蔗糖，6. 5g · L-1琼脂；培养 条件均为25士2°C，l^i (光照)/ (黑暗)培养。
2.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸体胚发生同步化控制方法，其特征在于步骤 (3)中，收集38 150 μ m的胚性细胞于液体诱导培养基II中培养10 15d，再次过筛， 收集150 280μπι的球形胚状体，将收集到的球形胚状体转入液体成熟培养基中培养，两 周后得到同步的成熟胚。其中，液体成熟培养基的配方为MS培养基，2 IOmg · L-1ABA, IOOmg · L-1CHJOg · L-1 蔗糖。
3.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸体胚发生同步化控制方法，其特征在于步骤(3) 中，收集150 280 μ m和280 400 μ m的细胞团，分别将其转至步骤3所述半固体成熟培 养基或进行步骤( 培养。
4.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸体胚发生同步化控制方法，其特征在于步骤(3) 中，将大于400μπι的细胞团按照步骤(1)继续增殖，并依次按照步骤(2)、(3)和(4)操作， 实现循环培养。
全文摘要
本发明公开了一种杂交鹅掌楸体胚发生同步化调控方法。该方法利用生长激素调节机理，逐步降低2，4-D浓度，附加0.5mg·L-1KT诱导出较为均一的胚性细胞团，然后采用机械过筛的方法将胚性细胞团分级培养，并根据细胞团大小和体胚发生方式的不同，选用不同的后续同步化控制方法。经上述同步化调控后，在球形胚阶段的经分级筛选的杂交鹅掌楸体胚发育同步率达90％左右；而在心形及鱼雷形胚阶段的分级处理同步化率在室温条件下为40％左右，经过适当时间的冷藏会使同步化的比率有所提高；由球形胚阶段的材料发育而来的成熟体胚向再生植株转化率可达70％～80％。
文档编号A01H4/00GK102037896SQ201010298850
公开日2011年5月4日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者施季森, 李婷婷, 陈金慧, 龙伟 申请人:南京林业大学