一种锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交胚的繁育方法
【专利摘要】本发明公开了一种锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交胚的繁育方法，包括：1）初代培养，取锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交种胚，在WPM培养基上培养120天，萌发出的幼苗；2）继代培养，取初代培养基中萌发出的幼苗，接入Read培养基进行培养，隔40天转瓶一次；3）生根培养，选取生长健壮的单苗，接入到生根培养基中进行生根培养。本发明锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交胚的繁育方法，对未成熟的杂交胚进行初代培养萌发形成的苗，该苗经过增殖培养后得到的芽苗，然后接入到生根培养基中成功的进行了生根培养，可以大大提高锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交胚的萌发率，促进幼苗生长，缩短育种周期，具有很好的实用性和工业化前景。
【专利说明】一种锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交胚的繁育方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物繁育【技术领域】，具体涉及一种锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交胚的繁育 方法。
【背景技术】
[0002] 杜鹃花是杜鹃花科杜鹃属的植物，具有很高的观赏、食用和药用价值。中国约有杜 鹃花542种，是世界杜鹃花分布中心，但是大多优良野生杜鹃仍然隐匿于山间，我国的杜鹃 花园艺栽培品种总数不到300种。国外杜鹃花杂交育种工作起步较早，截至2004年，已登记 的杜鹃花新品种达2. 8万个，已培育出了耐寒、大花、早花、晚花和香花品种。国内杜鹃花育 种工作起步较晚，开始于20世纪80年代，截至2004年，只登记了 34个品种。关于杜鹃资源 的应用与研究，尤其是新品种选育方面，我国的研究基础相当薄弱，仅有张长芹等进行了报 道。锦绣杜鹃（R. Pulchrum)是杜鹃花科半常绿灌木，花期4-5月份，花大色艳，耐热耐寒性 较好，产我国长江南部，分布区域较为广泛而且在园林中被广为应用的一种杜鹃花。大字杜 匿$ (R. schlippenbachi)是杜醇花科落叶灌木，叶纸质全缘，大小不等的五片叶呈"大"字形 集生枝顶，春季可观大花，秋季叶变艳丽红色，异常美观，分布于我国东北，耐寒性极强，是 一种重要的园林观赏濒危种。研究人员为获得一些春季即可观艳丽的大花又能秋季观赏美 丽的色叶，耐热又耐寒可以在我国广泛种植的杂交新品种，丰富杜鹃花的应用资源，往往会 进行杜鹃远缘杂交，例如以锦绣杜鹃做母本，以大字杜鹃做父本进行杂交，获得新品种。但 是，杜鹃远缘杂交存在着受精后障碍，主要表现为杂交胚胎的败育，种子无法萌发和后代白 化苗等，这一状况阻碍了我国杜鹃杂交育种的进程，在国内外，对于杜鹃花杂交胚拯救的研 究还鲜有报道。
【发明内容】
[0003] 发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种锦绣杜鹃与 大字杜鹃杂交胚的繁育方法，以锦绣杜鹃做母本，以大字杜鹃做父本进行杂交，对杂交胚运 用组培的方法进行胚拯救，以提高杂交胚萌发率，缩短育种周期。
[0004] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
[0005] -种锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交胚的繁育方法，包括以下步骤：
[0006] 1)初代培养
[0007] 取锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交种胚，在WPM培养基上培养120天，部分杂交胚萌发 形成幼苗，部分杂交胚脱分化，形成愈伤组织，培养条件为：光照12h/d，光照强度16001x， 温度25±0. 5°C ;其中，在WPM培养基中添加有50mg/L GA3、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH = 5. 0 ；
[0008] 2)继代培养
[0009] 取初代培养基中萌发出的幼苗，接入继代增殖培养基进行继代培养，隔40天转瓶 一次；在继代增殖培养基基中加入：1〇?50g/L蔗糖，5?15mg/L2iP，0. 01?0? 20mg/L NAA，0?0. 80% (质量百分比）AC，8g/L琼脂；培养条件为：光照12h/d，光照强度16001x， 温度25 ±0. 5°C ;其中，继代增殖培养基选自MS、Anderson、Read和WPM，pH = 5. 0 ;
[0010] 3)生根培养
[0011] 选取生长健壮的单苗，接入到生根培养基中进行生根培养，生根培养基的基本 培养基为1/2WPM，添加有10?30g/L蔗糖，琼脂8g/L，pH = 5. 0,光照12h/d，光照强度 16001x，温度 25±0. 5°C。
[0012] 步骤1)中，所述的锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交种胚由以下方法制备：于授粉3个月 后采收蒴果，刮去蒴果表面的绒毛，置于超净工作台上，用75%乙醇消毒30s，无菌水冲洗3 遍，再用10% NaClO消毒15min，无菌水冲洗5遍，瞭干用解剖刀切开取种胚即可。
[0013] 步骤2)中，继代增殖培养基优选为Read培养基。
[0014] 步骤2)中，继代增殖培养基优选加入20?30g/L蔗糖。
[0015] 步骤2)中，继代增殖培养基优选加入10?12mg/L2ip，0. 5mg/L NAA，0. 17? 0. 3% ACo
[0016] 步骤3)中，在所述生根培养基中优选添加有10g/L蔗糖。
[0017] 步骤3)中，培养40天后，即能生根。
[0018] 有益效果：与现有技术相比，本发明锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交胚的繁育方法，对 未成熟的杂交胚进行初代培养萌发形成的苗，该苗经过增殖培养后得到的芽苗，然后接入 到生根培养基中成功的进行了生根培养，可以大大提高锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交胚的萌发 率，促进幼苗生长，缩短育种周期，具有很好的实用性和工业化前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1是杂交幼苗增殖率复合极差图；
[0020] 图2是杂交幼苗增殖系数复合极差图；
[0021] 图3是杂交胚愈伤组织芽诱导率复合极差图；
[0022] 图4是杂交胚愈伤组织芽诱导系数复合极差图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0024] 以下实施例中所使用的试验材料为：以南京本地的锦绣杜鹃为母本，以庐山地区 采集的大字杜鹃花粉为父本进行杂交，授粉3个月后，取杂交蒴果，剥胚。
[0025] 实施例1
[0026] -种锦绣杜醇与大字杜醇杂交胚的繁育方法，包括：未成熟的杂交胚在初代培养 基中培养，初代培养后萌发形成的苗转入继代增殖培养基中培养，经过增殖培养后得到的 芽苗接入到生根培养基中进行生根培养。
[0027] 1)初代培养
[0028] 于授粉3个月后采收蒴果，刮去蒴果表面的绒毛，置于超净工作台上，用75%乙醇 消毒30s，无菌水冲洗3遍，再用10% NaClO消毒15min，无菌水冲洗5遍，瞭干用解剖刀切 开取种胚，在WPM培养基上培养120天，其中，在WPM培养基中添加有50mg/L GA3、30g/L蔗 糖和8g/L琼脂，pH = 5. 0。培养条件为：光照12h/d，光照强度16001x，温度25±0. 5°C。 培养120天后统计杂交胚萌发率、出苗率和出愈率；萌发率=萌发的数量八接种的总数 量-污染数）X 100%，结果为50. 1%;出苗率=直接萌发成苗的/萌发的总数X 100%，结 果为37.8% ;出愈率=直接萌发成愈伤的/萌发的总数X100%，结果为12. 3%。
[0029] 2)继代培养
[0030] 1、杂交苗的继代增殖培养基的筛选
[0031] 取等量的初代培养基中萌发出的幼苗，分别接入MS、Anderson、Read、WPM4种不同 基本培养基进行培养，隔40天转瓶一次。培养条件为：光照12h/d，光照强度16001x，温度 25±0.5°C。其中，每种培养基中均加入：10. 00mg/L2iP，30g/L蔗糖，8g/L琼脂，pH = 5.0。 培养40天后统计增殖率与增殖系数，结果如表1所示。增殖率=发生增殖的苗数八接入 苗数-死亡数）X 100% ;增殖系数=总苗数八接入苗数-死亡数），下同。
[0032] 表1杂交幼苗增殖培养基本培养基筛选统计（三次重复）
【权利要求】
1. 一种锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交胚的繁育方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 初代培养 取锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交种胚，在WPM培养基上培养120天，部分杂交胚萌发形成 幼苗，部分杂交胚脱分化，形成愈伤组织，培养条件为：光照12h/d，光照强度16001x，温度 25±0. 5°C ;其中，在WPM培养基中添加有50mg/L GA3、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH=5. 0 ; 2) 继代培养 取初代培养基中萌发出的幼苗，接入继代增殖培养基进行继代培养，隔40天转瓶 一次，直至长出健壮单苗；在继代增殖培养基基中加入：l(T50g/L蔗糖，5~15mg/L 2iP， 0. 01?0. 20mg/L NAA，(T〇. 80%AC，8g/L琼脂；培养条件为：光照12h/d，光照强度16001x，温 度25±0.51：;其中，继代增殖培养基选自]^、411(16^〇11、1^3(1和'^]\1，口11=5.0; 3) 生根培养 选取生长健壮的单苗，接入到生根培养基中进行生根培养，生根培养基的基本培养基 为1/2WPM，添加有l(T30g/L蔗糖，琼脂8g/L，pH=5.0,光照12h/d，光照强度16001x，温度 25±0. 5°C。
2. 根据权利要求1所述的锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交胚的繁育方法，其特征在于：步 骤1)中，所述的锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交种胚由以下方法制备：于授粉3个月后采收蒴 果，刮去蒴果表面的绒毛，置于超净工作台上，用75%乙醇消毒30s，无菌水冲洗3遍，再用 10%NaC10消毒15min,无菌水冲洗5遍,晾干用解剖刀切开取种胚即可。
3. 根据权利要求1所述的锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交胚的繁育方法，其特征在于：步骤 2)中，继代增殖培养基为Read培养基。
4. 根据权利要求1所述的锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交胚的繁育方法，其特征在于：步骤 2)中，继代增殖培养基加入2(T30g/L蔗糖。
5. 根据权利要求1所述的锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交胚的繁育方法，其特征在于：步骤 2) 中，继代增殖培养基加入 l(Tl2mg/L 2ip，0. 5mg/L NAA，0. 17?0? 3% AC。
6. 根据权利要求I所述的锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交胚的繁育方法，其特征在于：步骤 3) 中，在所述生根培养基中添加有10g/L蔗糖。
7. 根据权利要求1所述的锦绣杜鹃与大字杜鹃杂交胚的繁育方法，其特征在于：步骤 3)中，培养40天后，即能生根。
【文档编号】A01H4/00GK104303999SQ201410432155
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年8月27日 优先权日:2014年8月27日
【发明者】耿兴敏, 徐雁南, 杨君凯, 吴影倩, 王良桂 申请人:南京林业大学