使用随温度而变的杂交对核酸序列进行鉴定与区分的制作方法

专利名称：使用随温度而变的杂交对核酸序列进行鉴定与区分的制作方法
使用随温度而变的杂交对核酸序列进行鉴定与区分相关申请的交叉引用本发明要求2008年12月10日递交的申请号为61/193，609的美国临时申请的优先权，它的全部内容通过引用并入本文。
背景技术：
核酸扩增技术用于产生单链的核酸产物。对这些扩增产物的典型检测需要一个探针，其用扩增的核酸产物(“靶序列”)来识别特异的核酸序列。这种检测经常通过使用寡核苷酸探针来进行，其在严格的条件下与特异性靶核酸序列杂交，允许检测该特异性靶序列。在现有技术中，通常大约5°C的条件是众所周知的严格的杂交条件，其低于特异性序列在确定的离子强度和PH值下的热熔点(Tm)。所述热熔点是使50%的碱基对分离的温度(在确定的离子强度和PH值下)。尽管条件随序列变化，典型的严格的条件为盐浓度至少约为1. 5至6. OmM，其pH值为7. O至8. 3，温度范围为40°C至72。C。当使用序列特异性探针时，每个靶核酸序列一般需要一个具有用来区别每个靶序列的不同报告标记的不同探针。使用具有不同靶序列和报告标记的多个探针可能增加费用，并导致复杂的探针内相互作用。发明概述因此，在本领域中需要一种能够以随温度而变的方式鉴定大多数扩增产物的核酸探针。为了解决这些问题和满足其他需要，本发明提供了能够以随温度而变的方式与不同核酸靶序列杂交的寡核苷酸探针，其允许用相同的探针检测一个以上的核酸序列。一个实施例提供了用于检测靶核酸序列的寡核苷酸探针，其中，所述寡核苷酸探针在第一温度下与第一核酸序列杂交，并在第二温度下与第二核酸序列杂交。另一个实施例提供了一种检测两个或多个靶核酸序列的方法。所述方法包括(a) 使寡核苷酸探针在第一温度下与一个或多个靶核酸序列接触(b)改变温度以获得第二温度，然后(c)检测该探针是否在第一温度、第二温度或两种温度下与靶核酸序列杂交，其中，第一温度可能与第一靶核酸序列相关，并且第二温度可能与第二组核酸序列相关。另一个实施例提供了至少两个用来检测两个靶核酸序列的寡核苷酸探针。其中， 每个寡核苷酸探针具有一个具有相同或相似检测特征的报告分子，比如，例如相同的报告分子，但是所述探针被设计在不同温度下杂交。一个寡核苷酸探针可在第一温度下与第一靶核酸序列杂交，第二探针可在第二温度下与第二靶核酸序列杂交。可在每个探针分别对应的温度下，通过增加报告分子信号来测定两种杂交情况的分化。另一个实施例提供了一种使用两个或多个寡核苷酸探针来检测两个或多个靶核酸序列的方法。所述寡核苷酸探针标有相似或相同检测特征的报告分子，比如，例如相同的报告分子，但是所述探针被设计成在不同温度下与它们各自的靶核酸序列杂交。所述方法包括(a)在第一温度下使具有报告标记的寡核苷酸探针与一个或多个靶核酸序列接触； (b)改变温度以获得第二温度；然后(C)在第二温度下测定具有相同的报告标记的第二探针是否与其靶核酸序列杂交，其中，在第一温度下的信号可能与第一靶核酸序列相关，而且第二温度下的信号可能与第二核酸序列相关。在一个实施例中，可以使用额外的具有报告标记的探针，并且每个探针能够在确定的温度下与一个靶核酸序列杂交。一个实施例提供了一种试剂盒，其包括扩增试剂混合物和至少一个寡核苷酸探针，所述扩增试剂混合物包含至少一对用于扩增一个或多个靶核酸序列的引物，其中，寡核苷酸探针在第一温度下与第一靶核酸序列杂交，在第二温度下与第二核酸序列杂交。另一个实施例提供了一种试剂盒，其包括扩增试剂混合物和至少两个寡核苷酸探针，所述扩增试剂混合物包含至少一对用于扩增一个或多个靶核酸序列的引物。所述探针每个都具有一个具有相似或相同检测特征的报告标记，包括，例如，相同的报告标记，其中，第一寡核苷酸探针在第一温度下与第一靶核酸序列杂交，第二探针在第二温度下与第二核酸序列杂交。所述至少两个寡核苷酸探针可增加到两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、十个、或十一个以上、十二个、十五个或二十个探针。在另一个实施例中，示出了一种探针，其包括用于检测靶核酸序列的寡核苷酸探针，其中，寡核苷酸探针在第一温度下与第一靶核酸序列杂交，在第二温度下与第二核酸序列杂交。在另一个实施例中，示出了一种检测两个或多个靶核酸序列的方法。所述方法包括a.在第一温度下使一个寡核苷酸探针与一个或多个靶核酸序列接触；b.改变温度以获得第二温度；以及c.在第一温度、第二温度或两种温度条件下确定该探针是否与靶核酸序列杂交。在另一个实施例中，示出了一种如上和/或如下所述的方法。其中，第一温度与第一靶核酸序列相关，而且第二温度与第二靶核酸序列相关。在另一个实施例中，示出了一种如上和/或如下所述的方法。其中，第一温度与第一靶核酸序列是可相关的，第二温度与第二靶核酸序列是可相关的。在另一个实施例中，示出了一种试剂盒，其包括一种扩增试剂混合物和至少一个寡核苷酸探针，所述扩增试剂混合物含有一对或多对用于扩增一个或多个靶核酸序列的引物，其中，所述寡核苷酸探针在第一温度下与第一靶核酸序列杂交，在第二温度下与第二核酸序列杂交。 在另一个实施例中，示出了一种包括至少两个寡核苷酸探针的组合物。其中，所述寡核苷酸探针具有相同和/或相似检测特征的报告标记，其中，第一寡核苷酸探针在第一温度下与第一靶核酸序列杂交，第二探针在第二温度下与第二靶核酸序列杂交。其中，在第一温度下检测第一靶核酸序列，在第二温度下检测第二靶核酸序列，其中，在第一温度下对报告标记的检测表明了存在第一靶核酸序列，在第二温度下对报告标记的检测表明了存在第二靶核酸序列。在另一个实施例中，示出了一种使用两个或多个寡核苷酸探针来检测两个或多个靶核酸序列的方法。所述寡核苷酸探针用一个报告分子标记，其具有至少一项下列相同和相似的检测特征(i)在第一温度下使一个具有报告标记的寡核苷酸探针与一个或多个靶核酸序列接触；
(ii)改变温度以获得第二温度；(iii)在第二温度下，确定具有报告标记的第二探针是否与靶核酸序列杂交。在如上和/或如下公开的另一个实施例中，示出了一种方法。其中，在第一温度下的信号与第一靶核酸序列是可相关的，在第二温度下的信号与第二组靶核酸序列是可相关的。在如上和/或如下公开的另一个实施例中，示出了一种方法，其中，在第一温度下的信号与第一靶核酸序列相关，在第二温度下的信号与第二靶核酸序列相关。在另一个实施例中，示出了一种试剂盒，其包括一种扩增试剂混合物和至少两个都具有相同或相似检测特征的报告标记的寡核苷酸探针，所述扩增试剂混合物含有至少一对用于扩增一个或多个靶核酸序列的引物。其中，第一寡核苷酸探针在第一温度下与第一靶核酸序列杂交，第二探针在第二温度下与第二核酸序列杂交。通过下文的详细描述对如上所述和其他特征进行说明。发明详述一种能够以随温度而变的方式与不同的扩增产物杂交的寡核苷酸探针(“耐错配探针”或“随温度而变的探针”)是十分有用的。通过在不同温度下使用耐错配探针并测定探针的杂交来确定由靶扩增序列的先验认识得知的特异性靶序列的存在。随温度而变的探针可具有对靶核酸序列的多重检测、鉴定及识别等优点。然而，除非另有说明，所有使用的技术和科学术语都遵循常规技术使用方法。一般的，这种描述的术语和所述的实验程序，分别在细胞培养、分子遗传学、核酸化学及杂交领域众所周知，并且在本领域普遍应用。将标准技术应用于重组核酸方法、寡核苷酸合成、微生物培养、细胞培养、组织培养、转化、转染、 转导、分析化学、有机合成化学、化学合成、化学分析及药剂配方及递送。一般的，根据制造商的说明进行酶反应和纯化和/或隔离步骤。在没有相反指示的情况下，根据传统方法，比如，Sambrook 等人发表的 MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, 2ded. (Cold Spring Harbor Laboratory Press，198 和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John ffiley&Sons, 1989)，进行所述技术操作和程序。“序列同源性”具有一个业内认可的含义，并且可使用公开的技术来计算。参见 COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, ed. (Oxford University Press，1988)、 BI0C0MPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, ed. (Academic Press，1993)、 COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I， GrifTin&Griffin， eds. ， (Humana Press，1994)、SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, Von Heinje ed.，Academic Press(1987),SEQUENCE ANALYSIS PRIMER,Gribskov&Devereux,eds. (Macmillan Stockton Press, 1991)和 Carillo&Lipton，SIAM J. Applied Math. 48 :1073(1988)。普遍用于测定两个序列之间的同源性或相似性的方法包括但并不限于⑶IDE TO HUGE COMPUTERS,Bishop, ed.，(Academic Press, 1994)和如上所述的Carillo&Lipton中公开的那些方法。测定同源性或相似性的方法被编入计算机程序中。测定两个序列的同源性或相似性的优选的计算机程序方法包括但并不限于GCG程序组(Devereuxden等人，Nucleic Acids Research 12 :387(1984)), BLASTP，BLASTN, FASTA (Atschul 等人，J. MoI. Biol. 215 :403(1990))和 FASTDB (Brutlag 等人，Comp. App. Biosci. 6 :237 (1990))。一个实施例提供了一种寡核苷酸探针，其用于核酸扩增并能够检测和识别具有核苷酸序列变化的靶核酸的检测试验。这些寡核苷酸探针可以是耐错配探针，并且可与一个以上的靶核酸序列以随温度而变的方式杂交。第二个实施例涉及设计成不同的探针，其在不同温度下与特异的靶序列杂交。该实施例可被认为是通过杂交温度的复用。如本文所使用的，寡核苷酸是普通的，并且可包括多脱氧核糖核苷酸、多核糖核苷酸和任何一种多聚核苷酸。所述多聚核苷酸是嘌呤或嘧啶碱基，或者修饰的嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷，包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。寡核苷酸的引物和探针能够与靶核酸序列杂交。“杂交”是指通过互补碱基对使两条单链核酸构成一个双链体结构。杂交可发生在互补核酸链之间或发生在包含错配的小区域的核酸链之间。完全互补的核酸链杂交的条件被称为“严格的杂交条件”。除错配的小区域之外互补的两条单链核酸被称为“大体互补”。大体互补序列的稳定的双链体可在不太严格的杂交条件下获得。核酸技术领域的技术人员可通过测算变量数，包括，比如寡核苷酸长度和组成、离子强度和发生率以及错配的碱基对类型，来经验性地确定双链体的稳定性。在一个实施例中，一个随温度而变的探针与两个或多个靶核酸杂交。所述靶核酸的一个与另一个具有至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同源性。可通过使扩增的核酸产物与耐错配和/或随温度而变的探针接触和检测杂交双链的结构来检测和鉴定扩增的靶核酸序列。杂交可在不同温度条件下发生。比如，杂交可在10°C至90°C的温度范围内进行。在一个实施例中，扩增一个样品内的一个或多个靶核酸序列，在第一温度下观察杂交情况，然后在不同于第一温度的一个以上的温度下观察杂交情况。使用在不同温度下不同的靶序列会杂交的先验知识，可确定存在哪个靶核酸序列。在另一个实施例中，在检测和鉴定步骤过程中升温或降温。寡核苷酸探针可用于检测来自任何生物学样品的靶核酸。 生物学样品可包括，例如，真核的、原核的或病毒源的生物材料。细菌可以是革兰氏阴性、革兰氏阳性细菌或古生菌。革兰氏阴性细菌包括，例如但不限于弧菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、假单胞杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、肠杆菌属、赛氏杆菌属、摩拉克氏菌属、军团菌属、包特菌属、加德纳氏菌属、嗜血杆菌属、奈瑟菌属、布鲁氏菌属、耶尔森氏菌属、巴氏菌属、类菌体和螺杆菌属。革兰氏阳性细菌包括，比如但不限于芽胞杆菌属、梭状芽胞杆菌属、节杆菌属、微球菌属、葡萄球菌属、链球菌属、李斯特菌属、棒状杆菌、动性球菌属、分枝杆菌属、诺卡菌属、红球菌属和抗酸杆菌如分枝杆菌属。古生菌包括，比如但不限于产甲烷菌、嗜盐菌、嗜热菌、嗜冷菌、嗜泉古菌界、 广域古菌界和初生古菌界。在一个实施例中，纳米乳组合物可用于使芽孢杆菌失去活性。所述芽孢杆菌包括但不限于炭疽杆菌、蜡状芽孢杆菌、二环状、枯草杆菌和巨大芽孢杆菌。纳米乳的成分也可用于使梭状芽胞杆菌属失去活性。所述梭状芽胞杆菌属比如肉毒梭菌、产气荚膜梭菌和破伤风梭菌。其他可用纳米乳失活的细菌包括但不限于流感嗜血杆菌、淋球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌和霍乱弧菌(典型的和爱尔托型)，和耶尔森氏菌属，包括鼠疫菌、小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森氏菌。在另一个实施例中，细菌是炭疽杆菌。在另一实施例中，细菌是类结核分支杆菌结核病。可用耐错配探针检测的病毒包括但不限于，杆状病毒科、疱疹病毒科、虹彩病毒科、痘病毒科、“非洲猪瘟病毒”、腺病毒科、花椰菜花叶病毒科、肌病毒科、藻类去氧核糖核
6酸病毒科、盖病毒科、乳多空病毒科、环病毒科、微小病毒科、肝脱氧核糖核酸病毒科、囊病毒科、双股双节RNA病毒科、呼肠孤病毒科、日冠状病毒科、黄病毒科、披膜病毒科、“动脉炎病毒属”、星状病毒科、杯状病毒科、小核糖核酸病毒科、马铃薯Y病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、纤丝病毒科、副粘病毒科、弹状病毒科、沙粒病毒科和本扬病毒科家族中的任何一种。在一个实施例中，病毒是疱疹病毒、水痘病毒、乳头瘤病毒、冠病毒、流行性感冒病毒、 肝炎病毒、仙台病毒、新必斯病毒和牛痘病毒、西尼罗热病毒、汉他病毒、以及引发普通感冒的病毒。在一个实施例中，探针检测到柯萨基病毒。在一个实施例中，真菌是一种酵母菌，就像例如很多种类的念珠菌属(比如白色念珠菌)或丝状酵母菌。所述丝状酵母菌包括但不限于曲霉属真菌种或皮肤真菌，比如红色毛癣菌、须癣毛癣菌、犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、絮状表皮藓菌及以上和其他类型。另一些实施例包括真核生物体。所述真核生物体包括但不限于原生动物、藻类、植物和动物核酸。寡核苷酸可以成为任何适当尺寸，这取决于包括寡核苷酸的功能或用途等很多因素。寡核苷酸可通过任何适当的方法进行制备。所述适当的方法包括，比如，克隆、较大核苷酸的限制酶切、以及通过以下方法直接化学合成例如Narang等人在Meth. Enzymol. 68 90-9(1979)中发表的磷酸三酯方法、Brown等人在Meth. Enzymol. 68 :109-51(1979)中发表的磷酸二酯方法、Beaucage等人在^Tetrahedron Lett. 22 :1859-62(1981)中发表的二乙基亚磷酰胺的方法以及美国专利号4，458，066中公开的载体方法。对合成方法的复验在 Goodchild, Bioconjugate Chemistryl :165-87 (1990)中发表。可在一种试剂盒中提供耐错配探针和/或随温度而变的探针。该试剂盒可包括一些或所有必要的试剂。该试剂盒可包括一对单独的引物或一组或多组引物，和一个或多个寡核苷酸探针。术语“引物”是指一种寡核苷酸，不论天然的或合成的，其能够作为DNA合成的起点，在诱发互补于一条核酸链的一个引物延伸产品的合成的条件下发挥作用。比如，这种条件包括在适当的温度下，在适当的缓冲液内的四种不同核苷三磷酸与用于聚合的试剂的掺杂物(即DNA聚合酶或逆转录酶)。引物可以是单链寡脱氧核糖核苷酸。引物的长度可变， 并且取决于引物的用途。在一个实施例中，引物具有6至40个核苷酸。引物不需要反映模板的准确序列，但应该足以与模板杂交互补。引物可包含额外的特征，允许其进行引物的检测或固定，但不改变引物作为DNA合成的起点发挥作用的基本能力。寡核苷酸弓I物和探针可在一种扩增混合物内使用。术语“扩增反应混合物，，是指用于进行核酸扩增反应的适当试剂的组合。典型的反应混合物由在适当的缓冲液内的寡核苷酸引物、三磷酸核苷酸(dNTP)和核酸加工处理酶组成。所述核酸加工处理酶比如，例如耐高温的聚合酶、解旋酶、RNA聚合酶或连接酶。适当的聚合酶如在美国专利号4，889，818 中所描述的。可使用任何适当的解旋酶和RNA聚合酶，而且很多这种酶都在现有技术中是众所周知的。适当的解旋酶和RNA聚合酶如在欧洲专利号06四706和美国专利号56M142 中所描述的。可使用任何适当的方法对扩增的核酸进行检测。比如，在一个实施例中，可使用像 YO-PROYo Yo 和STOR 染料这样的无序列特异性的检测系统对双链的DNA进行检测。与单链的DNA相比，所述染料在与双链的DNA结合时会发出更多的荧光。在另一个实施例中，可使用一种特异于核酸区域的寡核苷酸探针，即“杂交探针”。 存在很多不同的杂交探针，然而，使用杂交探针的方法的主要特点是通过检测寡核苷酸探针与扩增的靶DNA或RNA杂交识别样品内存在的核酸。用于核酸杂交技术的探针能够通过一种或多种类型的化学键与互补序列的靶核酸结合，通常是通过氢键的形成产生的互补碱基对相结合。探针可包括天然碱基(即A、G、 U、C或Τ)或修正的碱基(7-脱氮鸟嘌呤核苷、肌苷等)。此外，只要核酸不干扰杂交，可通过一个非磷酸二酯键连接。因此，探针可以是肽核酸，其中组成的碱基可通过非磷酸键的肽键连接。寡核苷酸探针可通过现有技术中的任何方法制备。探针优选地至少具有6、12、14、 16、18、20、22、24、30 或 40 个核苷酸。寡核苷酸探针可以随意地与分子结合，其允许探针检测或固定，但不改变探针的杂交特性。现有技术中的一种方法认为，通常一个寡核苷酸探针的补体也适于作探针。与确定的靶核酸互补的探针可被化学合成，使用限制酶从较长的核苷酸中生成； 或可通过使用如聚合酶链反应(PCR)的技术获得。例如，使用放射性的、生物素酰化的或荧光的标签对探针进行标记。在一个实施例中，序列特异性的探针可采用两种荧光染料之间荧光共振能量转移 (FRET)作为检测方法。序列特异性的寡核苷酸探针可使用已知的标记化学知识，用如荧光素、罗丹明和花青染料进行标记。受体染料，像DABCYL或甲基红，可作为受体(或淬灭剂) 染料使用。在还一个实施例中，分子信标、具有发夹二级结构的寡核苷酸探针和位于第5'端和3'端的供体-受体对可从使探针与扩增的核酸区域结合的互补序列中生成。参见，比如 Tyagi 和 Kramer 发表的 Nat. Biotechnol. 14 :303-8(1996)，和 Tyagi 等人发表的 Nat. Biotechnol. 18 :1191-6(2000)。在另一个实施例中，如Lee等人发表的Anal. ChLn. Acta 457 =61-70(2002)中所述的寡核苷酸探针，可用于检测扩增的核酸区域。现有技术中的一种方法认为，使用不同检测分析的标签或固定方法在条件和/或探针序列中可要求细节优化。特定应用将决定使用哪种探针。扩增反应还包括对靶核酸的存在进行校准和验证的内部对照。可使用任何适当的内部对照。通过使用内部对照进行双链扩增，并且监测靶核酸和内部对照核酸的扩增产物。扩增反应还包括特异于其他目的核酸的产物和探针。比如，可重复扩增反应用来扩增和检测与其他生物学上的危害相关的基因。可通过任何适当方法进行扩增产物的检测，比如终端测定方法。寡核苷酸可以包含在一个系统中的试剂形式提供，比如预包装的消耗品。比如，消耗品可以一种材料带状物形式存在，所述带状物具有过滤器，以捕捉如核酸这样的生物颗粒。这种带状物还可包含其他试剂，以对靶核苷酸进行扩增和/或检测。过滤器和试剂可在材料带状物上处理掉并纵向延伸。在另一个实施例中，寡核苷酸可包含在一个缓冲容器外壳内，与一个活塞外壳以可移动的方式相连。使用这种装置，用与活塞一端相连的一个拭子采集标本样品进行分析，以用于生物战试剂，比如蓖麻毒素。将拭子和活塞一并插入活塞外壳中，将缓冲容器置于缓冲容器外壳中，并将缓冲容器外壳与活塞外壳相连。让缓冲液流过拭子洗脱样品，并且使样品与试剂混合。通过抖动将制备的样品转移到反应管中。可将一个或多个耐错配和随温度而变的探针作为试剂盒的一部分提供。一个试剂盒可包括一种含有一对或多对引物的扩增试剂混合物，所述引物用于扩增一个或多个靶核酸序列。在一些例子中，可在适当的支撑膜上提供寡核苷酸探针和/或引物，比如微孔板， 或将其在消耗品容器、壳管或带状物上冻干。一个试剂盒的其他可选组成部分包括，比如， 一种用于催化引物延伸产物的合成的试剂、底物核苷三磷酸、用于扩增和杂交反应的适当的缓冲液操作检测方法的说明书。耐错配和/或随温度而变的探针可用于检测来自微生物、植物和动物的遗传物质，所述微生物包括病原微生物。一种病原微生物可以是但不限于一种细菌、一种病毒、一种真菌、一种原生动物或组合物。在一个典型实施例中，示出了一种用于检测一个靶核酸序列的寡核苷酸探针，其中，所述寡核苷酸探针在第一温度下与第一核酸序列杂交，并在第二温度下与第二核酸序列杂交。在另一个典型实施例中，示出了一种检测两个或多个靶核酸序列的方法。所述方法包括a.在第一温度下使一个寡核苷酸探针与一个或多个靶核酸序列接触；b.改变温度以获得第二温度；以及c.在第一温度、第二温度或两种温度下，确定该探针是否与靶核酸序列杂交，其中，第一温度与第一靶核酸序列相关，而且第二温度与第二核酸序列相关。在另一个实施例中，示出了一种试剂盒，其包括一种扩增试剂混合物和至少一个寡核苷酸探针，所述扩增试剂混合物含有一对或多对用于扩增一个或多个靶核酸序列的引物，其中，所述寡核苷酸探针在第一温度下与第一核酸序列杂交，并在第二温度下与第二核酸序列杂交。在另一个实施例中，示出了一种包括至少两个寡核苷酸探针的混合物。其中，所述寡核苷酸探针具有一个具有相同或相似检测特性的报告标记；其中，第一寡核苷酸探针在第一温度下与第一核酸序列杂交，第二寡核苷酸探针在第二温度下与第二核酸序列杂交； 其中，在第一温度下对第一靶核酸序列进行检测，在第二温度下对第二靶核酸序列进行检测；其中在第一温度下对报告标记的检测表明了存在第一靶核酸序列，在第二温度下对报告标记的检测表明了存在第二靶核酸序列。在另一个实施例中，示出了一种使用两个或多个寡核苷酸探针以检测两个或多个靶核酸序列的方法。所述寡核苷酸探针用具有相同或相似检测特性的报告分子标记，其检测特性包括(i)在第一温度下使具有报告标记的寡核苷酸探针与一个或多个靶核酸序列接触；(ii)改变温度以获得第二温度；(iii)在第二温度下，确定具有报告标记的第二探针是否与靶核酸序列杂交。其中，在第一温度下的信号与第一靶核酸序列相关，而且在第二温度下的信号与第二靶核酸序列相关。
在另一个实施例中，示出了一种试剂盒，其包括一种扩增试剂混合物和至少两个都具有相同或相似检测特征的报告标记的寡核苷酸探针，所述扩增试剂混合物含有至少一对用于扩增一个或多个靶核酸序列的引物，其中，第一寡核苷酸探针在第一温度下与第一靶核酸序列杂交，第二探针在第二温度下与第二核酸序列杂交如本发明所公开的，本领域技术人员应该理解的是，在本发明的范围和主旨内还有其他实施例和改进形式。基于此，本领域技术人员从在本发明范围和主旨内的公开中可获得的所有改进形式都将作为本发明的其他实施例包括在本发明中。
权利要求
1.一种探针，其包括用于检测靶核酸序列的寡核苷酸探针，其中，所述寡核苷酸探针在第一温度下与第一核酸序列杂交，并且在第二温度下与第二核酸序列杂交。
2.一种检测两个或多个靶核酸序列的方法，所述方法包括a.在第一温度下使寡核苷酸探针与一个或多个靶核酸序列接触；b.改变所述温度以获得第二温度；以及c.在所述第一温度、所述第二温度或两种温度下，确定该探针是否与靶核酸序列杂交。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述第一温度与第一靶核酸序列相关，并且所述第二温度与第二靶核酸序列相关。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述第一温度与第一靶核酸序列是可相关的，并且所述第二温度与第二靶核酸序列是可相关的。
5.一种试剂盒，其包括扩增试剂混合物和至少一个寡核苷酸探针，所述扩增试剂混合物含有一对或多对用于扩增一个或多个靶核酸序列的引物，其中，所述寡核苷酸探针在第一温度下与第一核酸序列杂交，并且在第二温度下与第二核酸序列杂交。
6.一种组合物，其包括至少两个寡核苷酸探针，其中，所述寡核苷酸探针具有一个具有相同和/或相似检测特性的报告标记；其中，第一寡核苷酸探针在第一温度下与第一核酸序列杂交，并且第二寡核苷酸探针在第二温度下与第二核酸序列杂交；其中，在所述第一温度下对所述第一个靶核酸序列进行检测，并且在所述第二温度下对所述第二靶核酸序列进行检测；以及其中，在所述第一温度下对报告标记的检测表明了存在所述第一靶核酸序列， 并且在所述第二温度下对报告标记的检测表明了存在所述第二靶核酸序列。
7.一种使用两个或多个寡核苷酸探针检测两个或多个靶核酸序列的方法，所述寡核苷酸探针用报告分子标记，其具有至少一项下列相同和相似的检测特征(i)在第一温度下使具有报告标记的寡核苷酸探针与一个或多个靶核酸序列接触；( )改变所述温度以获得第二温度；(iii)在所述第二温度下，确定具有所述报告标记的第二探针是否与靶核酸序列杂交。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，在所述第一温度下的信号与所述第一靶核酸序列是可相关的，并且在第二温度下的信号与第二靶核酸序列是可相关的。
9.根据权利要求7所述的方法，还包括使在所述第一温度下的信号与所述第一靶核酸序列相关，并且使在所述第二温度下的信号与所述第二靶核酸序列相关。
10.一种试剂盒，其包括扩增试剂混合物和至少两个都具有相同或相似检测特征的报告标记的寡核苷酸探针，所述扩增试剂混合物含有至少一对引物用于扩增一个或多个靶核酸序列，其中，第一寡核苷酸探针在第一温度下与第一核酸序列杂交，并且第二寡核苷酸探针在第二温度下与第二核酸序列杂交。
全文摘要
本发明提供了一种寡核苷酸探针，其能够以随温度而变的方式与不同的靶核酸序列杂交，允许用相同的探针或具有相同或相似检测特性的报告标记的不同探针对一个以上的靶核酸序列进行检测。本发明还提供了一种方法，通过使用一种能够以随温度而变的方式与序列进行杂交的寡核苷酸探针，或使用具有相同或相似检测特性的报告标记的不同探针，对靶核酸序列进行检测。
文档编号C12Q1/68GK102301007SQ200980156022
公开日2011年12月28日 申请日期2009年12月7日 优先权日2008年12月10日
发明者H·A·格罗里基安, J·W·查卡 申请人:史密斯探测公司