专利名称：诱导花生不定芽的方法
技术领域：
本发明涉及一种组织培养诱导花生丛生芽的方法，特别是涉及一种高效诱导花生不定 芽的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
花生是一种重要的油料作物和经济作物，在我国种植面积较大。提高花生的产量、质 量，离不开优良品种，花生组织培养是利用生物技术进行花生育种的一个重要环节。目前，有些作物建立起了高效的植株再生体系，筛选出高诱导率基因型(如水稻的 日本晴，中华11)，但大多数作物的植株再生率仍很低(1%-30%)，成为限制基因工程技术应 用的瓶颈。目前花生丛生芽诱导率报道的平均不超过50%，且稳定性和重复性差。花生高效 再生体系的建立是花生基因转化的基础。植株再生受基因型影响很大，同时也和外植体类 型及培养基配方有关。细胞分裂素在组织培养诱导芽再生中比较有效，BA和TDZ在多种作
发明内容
本发明要解决的技术问题提供一种诱导率高、稳定性高、重复性好的组织培养诱导花 生不定芽的方法。本发明的技术方案
一种诱导花生不定芽的方法，包括如下步骤
(1)种子预培养选取成熟的豫花1号花生种子，先用70%乙醇浸润20-30S，然后用 0. 1%的HgCl2溶液消毒8-lOmin，用无菌水冲洗5飞次，然后在无菌水中浸泡2 3h，将花生 种皮去掉，再去掉一片子叶，将剩下带有胚芽的另一半子叶接种于不添加激素的MS培养基 中培养，培养温度25 26°C，光照时间12-14h/d，光照强度1000-2000 Ix,培养4天；
(2)外植体制备将培养后的花生子叶掰掉，夹紧胚轴，用无菌刀片将花生幼叶从基部 切下，将幼叶横切，平均分成三份，或从近叶柄1/3处一分为二，得到外植体；
(3)诱导和分化将外植体接种在诱导培养基中培养，培养温度为25 26°C、光照时间 12-14h/d，光照强度1000-2000 lx，培养7-8天后外植体边缘出现绿色芽点，转到继代培养 基中，再培养18-22天获得诱导芽。所述诱导培养基为MS+BA 3 mg/L +NAA 0. 4 - 0. 8 mg/L +TDZ 0. 1 - 0. 3 mg/ L +AgNO3 3. 5 mg/L ο所述继代培养基为MS +BA 5 mg/L +NAA lmg/L +AgNO3 3. 5 mg/L。本发明的有益效果
(1)本发明通过严格筛选，选出基因型豫花1号作为外植体，经过种子预培养、外植体 制备和诱导、分化等环节，得到花生不定芽，比目前文献报道的花生丛生芽的诱导率高，经 多次接种试验证明，诱导率结果稳定，重复性较好。(2)本发明优化了芽诱导培养基配方，使外植体萌发不定芽的时间大大提前，萌发 时间从原来的14天左右，提前到7-8天。(3)本发明方法可获得稳定的高诱导率，豫花1号在三种不同的培养基上培养(MS +BA 3 mg/L +NAA 0. 4 mg/L +TDZ 0. 3 mg/L +AgNO3 3. 5 mg/L ；MS +BA 3 mg/L +NAA 0. 8mg/L +TDZ 0. 1 mg/L +AgNO3 3. 5 mg/L ；MS +BA 3 mg/L +NAAO. 8 mg/L +TDZ 0. 3 mg/L +AgNO3 3. 5 mg/L)，芽诱导率稳定在 90% 以上，分别为 91. 6 92. 5%,97. 5 98. 5%,99. 5 100%。而同样条件下开农49、开农30、豫花15号在MS +BA 3 mg/L +ΝΑΑ0. 8 mg/ L +TDZ 0.3 mg/L +AgNO3 3.5 mg/L培养基上培养，其不定芽诱导率分别为51. 2 52. 6%、 31. 8^33. 5%,36. 8^38. 5%。可看出，豫花1号作为外植体时的不定芽诱导率比其他品种优势 明显。
图 1 豫花 1 号外植体在 MS +BA 3 mg/L +NAAO· 8 mg/L +TDZ 0. 3 mg/L +AgNO3 3. 5 mg/L培养基上诱导不定芽情况。图中外植体切口边缘的绿色突起为诱导产生的不定芽。图 2:开农 49 (对照)外植体在 MS +BA 3 mg/L +NAAO· 8 mg/L +TDZ 0.3 mg/L +AgNO3 3.5 mg/L培养基上诱导不定芽情况。图中外植体切口边缘的绿色突起为诱导产生 的不定芽，黄、白色为愈伤组织。从图1、2可以看出，在相同的培养基和培养条件下，豫花1号外植体的芽点多而且 长势旺；开农49 (对照)外植体芽点较稀少，而且外植体边缘产生白色的疏松愈伤组织，说 明豫花1号和开农49基因型间的芽诱导率存在显著差异。图3 豫花15号(对照)在三种不同的培养基上的外植体诱导不定芽对照图图中 外植体切口边缘的绿色突起为诱导产生的不定芽，黄、白色为愈伤组织。图中(1)培养基为MS +BA 3 mg/L +NAAO· 8 mg/L +TDZ 0.3 mg/L +AgNO3 3.5 mg/ L ； (2)培养基为 MS +BA 3 mg/L +NAA 0.8 mg/L +TDZ 0.1 mg/L +AgNO3 3.5 mg/ L ；(3) 培养基为 MS +BA 3 mg/L +NAA 0. 4 mg/L +TDZ 0. 3 mg/L +AgNO3 3. 5 mg/L。从图3可看出，同一基因型(豫花15号)在不同培养基上，不定芽的诱导反应不同。 图中(2)和(3)较(1)诱导出较多愈伤组织，但不定芽诱导率均较低，诱导率不足40%。
具体实施例方式
以下结合实施例详细说明本发明，其中出现的百分比浓度如无特别说明，均指质量百 分比浓度。实施例1 诱导花生不定芽的方法，包括如下步骤
1、种子预培养选取颗粒饱满、较大、表面无裂痕、没有出胚芽的豫花1号成熟种子，用 镊子加入无菌三角瓶中，先用70%乙醇浸润30s，再用0. 1%的HgCl2溶液消毒8min，用无菌 水冲洗5飞次，然后在无菌水中浸泡2 3h，待花生种皮舒展之后，在超净工作台上用镊子将 花生种皮去掉，再去掉一片子叶，将剩下带有胚芽的另一半子叶接种于装有MStl (MS培养基 不添加任何激素)培养基的无菌罐头瓶中，置光照培养室中，在25°C、光照强度为20001x，光 照14h/d条件下培养4天；
2、制备外植体用镊子将花生的子叶掰掉，之后夹紧胚轴，再用无菌刀片将花生幼叶从 基部切下，将幼叶近叶柄部1/3处一分为二 ；
3、诱导和分化将外植体分别接种在诱导培养基中，芽诱导培养基为MS+BA 3 mg/L +NAA 0.8 mg/L +TDZ 0.3 mg/L +AgNO3 3.5 mg/L，置光照培养室 25°C、光照强度为 20001x， 光照14h/d条件下培养，经过7-8天，部分外植体切口边缘可见绿色芽点出现；14天左右， 所有外植体边缘均出现大量绿色芽点。两周后，转到继代培养基中，使芽点进一步分化，继代培养基为MS +BA 5 mg/L +NAA lmg/L +AgNO3 3.5 mg/L，再培养18天得到诱导花生不定芽。经统计，诱导率达到
100% ο实施例2 诱导花生不定芽的方法
种子预培养选取颗粒饱满、较大、表面无裂痕、没有出胚芽的豫花1号成熟种子，用镊 子加入无菌三角瓶中，先用70%乙醇浸润20s，再用0. l%HgCl2溶液消毒lOmin，用无菌水冲 洗5飞次，然后在无菌水中浸泡2 3h，待花生种皮舒展之后，在超净工作台上用镊子将花生 种皮去掉，再去掉一片子叶，将剩下带有胚芽的另一半子叶接种于装有MStl (MS培养基不添 加任何激素)培养基的无菌罐头瓶中。置光照培养室中，在26°C、光照强度为1500 lx，光照 12h/d条件下培养4天。制备外植体用镊子将花生的子叶掰掉，之后夹紧胚轴，再用无菌刀片将花生幼叶 从基部切下，将幼叶横切平均一分为三。诱导和分化将外植体分别接种在诱导培养基上MS +BA 3 mg/L +NAA 0. 8 mg/L +TDZ 0. 1 mg/L +AgNO3 3.5 mg/L，置光照培养室26°C、光照强度为1500 lx，光照12h/d条 件下培养，经过7-8天，部分外植体切口边缘可见绿色芽点出现；14天左右，几乎外植体边 缘均出现大量绿色芽点。两周后，转到继代培养基上，继代培养基为MS +BA 5 mg/L +NAA lmg/L +AgNO3 3.5 mg/L，使芽点进一步分化，再培养22天得到诱导花生不定芽。经统计， 诱导率为97. 5%。实施例3 同实施例1基本相同，不同之处在于 培养室条件26°C、光照强度1000 lx，光照13h/d ；
芽诱导培养基:MS +BA 3 mg/L +NAA 0.4 mg/L +TDZ 0.3 mg/L +AgNO3 3.5 mg/L，诱 导率为91. 6%ο说明书摘要
本发明涉及一种高效诱导花生不定芽的方法，包括选取成熟的豫花1号花生种子，先 用70%乙醇浸润，然后用0. 1%的HgCl2溶液消毒，用无菌水冲洗，然后在无菌水中浸泡，将剩 下带有胚芽的另一半子叶接种于不添加激素的MS培养基中培养，培养4天；将培养后的幼 叶横切，平均分成三份，得到外植体；诱导和分化，将外植体接种在诱导培养基中培养7-8 天后外植体边缘出现绿色芽点，转到继代培养基中，再培养18-22天获得诱导芽。本发明选 出基因型豫花1号作为外植体得到花生不定芽，优化了芽诱导培养基配方，经多次接种试 验证明，芽诱导率稳定在90%以上，重复性好。
权利要求
一种诱导花生不定芽的方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)种子预培养 选取成熟的豫花1号花生种子，先用70%乙醇浸润20 30s，然后用0.1%的HgCl2溶液消毒8 10min，用无菌水冲洗5~6次，然后在无菌水中浸泡2~3h，将花生种皮去掉，再去掉一片子叶，将剩下带有胚芽的另一半子叶接种于不添加激素的MS培养基中培养，培养温度25~26℃，光照时间12 14h/d，光照强度1000 2000 lx，培养4天；(2)外植体制备 将培养后的花生子叶掰掉，夹紧胚轴，用无菌刀片将花生幼叶从基部切下，将幼叶横切，平均分成三份，或从近叶柄1/3处一分为二，得到外植体；(3)诱导和分化 将外植体接种在诱导培养基中培养，培养温度为25~26℃、光照时间12 14h/d，光照强度1000 2000 lx，培养7 8天后外植体边缘出现绿色芽点，转到继代培养基中，再培养18 22天获得诱导芽。
2.根据权利要求1所述的诱导花生不定芽的方法，其特征在于所述诱导培养基为MS +BA 3 mg/L +NAA 0. 4 - 0. 8 mg/L +TDZ 0. 1 - 0. 3 mg/L +AgNO3 3. 5 mg/L。
3.根据权利要求1或2所述的诱导花生不定芽的方法，其特征在于所述继代培养基 为 MS +BA 5 mg/L +NAA lmg/L +AgNO3 3. 5 mg/L。全文摘要
本发明涉及一种高效诱导花生不定芽的方法，包括选取成熟的豫花1号花生种子，先用70%乙醇浸润，然后用0.1%的HgCl2溶液消毒，用无菌水冲洗，然后在无菌水中浸泡，将剩下带有胚芽的另一半子叶接种于不添加激素的MS培养基中培养，培养4天；将培养后的幼叶横切，平均分成三份，得到外植体；诱导和分化，将外植体接种在诱导培养基中培养7-8天后外植体边缘出现绿色芽点，转到继代培养基中，再培养18-22天获得诱导芽。本发明选出基因型豫花1号作为外植体得到花生不定芽，优化了芽诱导培养基配方，经多次接种试验证明，芽诱导率稳定在90%以上，重复性好。
文档编号A01H4/00GK101960988SQ20101029825
公开日2011年2月2日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者张新友, 汤丰收, 苗利娟, 董文召, 高伟, 黄冰艳 申请人:河南省农业科学院