分析杂交鹅掌楸EST序列中的序列和18S序列分别设计了两对引物和一对18S引物，通过溶解曲线分析最终选择了一对Ac tin^丨物扩增内参基因，引物要求Tm值在58~61 °C之间，扩增产物长度200bp左右。以杂交鹅掌楸体胚发生不同阶段材料的RNA为模板进行半定量PCR (如图8)和 Real-time PCR (如图 9)分析。
[0061]合成以下引物:
pinl-aS -.5' -CCCCTCCTCTCCTTCCACTT-3r，pinl-aA -.5' -AATCCCCGTACATCCCCTTAA-3'，actin-S -.5' - TGGTGTGATGGTTGGTATGGG-3'，actin-A -.5' -CACGATTAGCCTTCGGATTGA-3'。
[0062]2) RT-PCR 反应体系
以cDNA第一链为模板，使用Τ0Υ0Β0公司的KOD PLUS高保真酶按下列组成配制PCR反应液，20μ1 体系:10XPCR Buffer 2PL，2mM dNTPs 2PL，25mM MgSO4 0.8PL，pinl_aS 0.6μ?,pinl-aA 0.&VL, cDNA 0.4?, KOD DNA polymerase (1U/KL) 0.4?, ddH20 13.2PL。
[0063]3) RT-PCR 反应条件如下:94°C 2min ；94°C 15sec,59°C 30sec,72°C lmin, 30-35Cycles ；72°C 1min ；4°C Forever。
[0064]PCR反应分别进行30个和35个循环。
[0065]4)qRT_PCR按说明书配制下列PCR反应溶液(避光，20μυ:2 X Power SYBR GreenPCR Master Mix 10μ?, Primer I (1uM) ?μ?, Primer 2 (1uM) ?μ?, cDNA ?μ?, ddH207μ?0
[0066]5) qRT-PCR 反应条件:95°C 1min ；95°C 15sec,60°C lmin, 40 Cycles。
[0067]6)试验结果
根据实时定量PCR结果发现，结果显示，/YM基因在胚性愈伤组织中表达量最高，其次是球形胚时期，在胚胎发育的整个过程中基因的表达都维持在一定的水平，到成熟子叶胚时期又略有上升(如图9所示)。
[0068](4)农杆菌的转化
1.本发明使用的农杆菌菌株为EHA105 ( B1vector C0.，LTD公司购入)。采用的是液氮冻融法将构建好的Lh/ΥΜ表达载体转入农杆菌。具体过程如下:I)冰浴融化EHA105感受态细胞，加入至少100 ng回收纯化的表达载体质粒，轻轻混勾，冰浴20~30 min ； 2)液氮速冻I min，37°C热击3 min，迅速置于冰上l~2min ; 3)加入800 μ I无抗生素的LB培养基，28。。，200 rpm复苏3.5h ;4000 rpm离心3 min，吸掉培养基;4)混勾剩余菌液，涂抹于添加50 mg.L 1卡纳霉素的固体LB培基上；5)28°C倒置培养30~48h ； 6)PCR检测阳性克隆，4°C保存备用。
[0069]PCR检测所用引物为:
35S-F:5，-TGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTG-3，；
^-LhPINl-R:5’ -CATCCATAAGCGACATTACATCAG-3’。
[0070]PCR 反应体系(20 yL):10 X PCR Buffer (Mg+ Free) 2.0 μ L, MgCl2 (25 mmol/L) 1.2 μ L，dNTPs (10 mmol/L) 0.4 μ L，引物 I (10 uM) 1.0 μ L，引物 2 (10 uM) 1.0 μ L，rTaq (5 U/ μ L) 0.2 μ L，DNA 2.0 μ L，ddH20 补足至 20 μ L0
[0071]PCR 反应条件:95°C 5 min ；95°C 45 s,57°C 45 s,72°C I min，35Cycles ；72°C 10min ；4°C forever。
[0072]2.待继代培养约3周龄的烟草无菌苗，取近植株顶端大小、性状、色泽基本一致，且生长状态良好的幼嫩叶片作为转化材料。将PCR检测的阳性克隆，摇菌至OD 0.2时，进行烟草叶片浸泡转化。具体过程如下:1)4000 rpm离心10 min，去上清，收集菌体。用一定体积的MS或1/2MS液体培养基重悬菌体，稀释菌液至0D600 =0.2，备用；2)预培养:组培3-4周龄的无菌试管苗，取其大小、性状，色泽基本一致，且生长状态良好的试管苗顶尖向下第1~4片的叶子，用剪刀剪去叶片边缘，除去主叶脉，将叶片剪成0.5 Cm2-1.0 cm2左右的正方形小叶片，叶片远轴端朝下平铺于不加任何抗生素的分化培养基上暗培养2天。将拟南芥的地上部分在农杆菌悬浮溶液中浸泡15~30 sec，期间轻轻晃动3)侵染与共培养:
将预培养的叶片浸入至制备好的0D600 =0.2的菌液中侵染10 min，期间可轻轻摇动，利于叶片与菌体的充分接触。取出后用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，置于铺有滤纸的不加抗生素的分化培养基上进行共培养2天，共培养为暗培养。4)筛选和生根:共培养的叶片用添加Cef 400 mg/L的MS液体培养基洗2_3次(每次5 min)，再用无菌水冲洗3次后，置于烟草筛选培养基上培养，每两周更换一次培养基。当芽长至I cm左右时转至烟草筛选生根培养基上。
[0073](5)转基因植株表型观察
1.将筛选出的可能的转基因阳性植株移栽到土里继续培养。提取转基因烟草的总DNA作模板进行PCR检测，显示阴性对照无条带，转基因植株PCR目的条带与阳性对照一致，确定其为阳性植株。检测结果如图10。
[0074]2.转LhPim基因烟草植株的表型观察。经统计，移栽的30株转LhPim基因烟草植株中，有15株转基因烟草植株的茎段明显较野生型烟草粗壮，叶片较密集，叶片轻微下垂，节间距缩短。野生型烟草(图11 a)平均节间距为5 cm，平均株高为118.2 cm，转ZAZ5ZM基因烟草植株(图1Ib)平均节间距为2 cm，且植株矮化，株高72.3 cm。由(图lld，f)可见，转基因烟草植株近叶柄处的叶片有褶皱产生，主叶脉较粗，近叶柄处二级叶脉较明显，且侧脉分布密集；野生型烟草叶片(图11 c、e)较平展，近叶柄处二级叶脉不明显，排列稀疏不规则。转基因烟草叶片的叶基类型为耳型，野生型烟草叶片的叶基类型为下延型。
[0075]3.转基因烟草茎段的表型观察
取茎顶端分生组织向下10 Cm处茎段，在相同放大倍数下观察茎段横切面(图12a、c)，发现，转基因烟草茎段(图12c、d)的木质部较发达，与野生型相比，其木质部范围有所扩张；野生型(图12a、b)木质部不发达。可见，在转基因烟草中基因的表达促进了烟草茎段的形成层分化形成木质部，进一步证明了基因影响维管组织的发育。
【主权项】
1.一种杂交鹅掌楸/5ZM基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。2.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸/5ZM基因，其特征在于:其编码序列如SEQIDN0.2所示。3.权利要求1所述的杂交鹅掌楸/YM基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.3所示。4.权利要求1所述的杂交鹅掌楸/5ZM基因在杂交鹅掌楸育种中的应用。5.含有权利要求1所述的杂交鹅掌楸/5ZM基因的载体。6.含有权利要求1所述的杂交鹅掌楸/5ZM基因的宿主细胞。
【专利摘要】本发明公开了一种杂交鹅掌楸<i>PIN1</i>基因及其应用，<i>PIN1</i>基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。本发明在建立成熟的杂交鹅掌楸体胚发生体系的基础上，同源克隆生长素运输蛋白基因<i>PIN1</i>全长，通过基因克隆表达分析，证明了杂交鹅掌楸<i>PIN1</i>基因在杂交鹅掌楸中具有广泛的表达。通过对其功能分析发现，过表达<i>PIN1</i>基因抑制植株增高，节间距缩短，影响植株的生长发育，可为开展杂交鹅掌楸分子育种提供更好的方法。
【IPC分类】C12N15/82, C12N15/29, C07K14/415, C12N5/10, A01H5/00
【公开号】CN105219783
【申请号】CN201510685439
【发明人】陈金慧, 李美平, 王鹏凯, 施季森, 周燕威
【申请人】南京林业大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月20日