猪胰岛素特异性表达启动子pip2及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子遗传学技术领域，尤其设及一种猪膜岛素特异性表达启动子PIP2 及其应用。
【背景技术】
[0002] W.Yang等调查显示，我国20岁W上成年人糖尿病患病率为9. 7 %，总人口数达 9240万，其中2型糖尿病患者占糖尿病人口总数的90%W上。2型糖尿病病理特征表现为： W膜岛素抵抗为主，伴膜岛素分泌不足，至W膜岛素分泌不足伴随膜岛素抵抗（WHO1999 标准）。血糖浓度的稳定与膜腺组织0细胞分泌的膜岛素密切相关，因此构建0细胞功能 受损的动物模型显得尤为重要。随着技术的发展，通过转基因制备具有不同特征的2型糖 尿病模型更能满足实际需求。大鼠、小鼠和人的膜岛素启动子已用于膜岛特定类型的细胞 祀向表达。大鼠膜岛素基因（INS2)启动子已广泛应用于不同品种小鼠膜腺0细胞目的基 因表述。然而，J.Martin等研究表明，大鼠膜腺启动子调控大脑特定区域的异位表达可能 导致在0细胞和神经细胞中出现表型。
[0003] 小鼠模型和人类之间存在诸多差异，使其获得的数据用于人类疾病防治和治疗策 略制订等方面存在局限。小型猪在形态学、解剖学、生理学、染色体结构和基因组序列等方 面与人具有较高的相似性，尤其是猪的饮食结构和食品代谢等方面与人及其相似，使其在 糖尿病研究中得到广泛应用。
[0004] 公开于该【背景技术】部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应 当被视为承认或W任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种猪膜岛素特异性表达启动子PIP2及其应 用。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用W下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种猪膜岛素特异性表达启动子PIP2,其具有SEQIDNo. 1所示的 序列。
[0008] 本发明提供了一种猪膜岛素特异性表达启动子PIP2引物对，所述的猪膜岛素特 异性表达启动子PIP2引物对具有SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3所示的序列。
[0009] 本发明还提供了所述的猪膜岛素特异性表达启动子PIP2或所述的猪膜岛素特异 性表达启动子PIP2引物对在猪遗传改良和转基因表达中的应用。
[0010] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0011] 1.本发明的猪膜岛素特异性表达启动子PIP2可为转基因调控我国小型猪膜腺0 细胞功能研究和糖尿病模型制备提供依据。
[0012] 2.本发明从中国地方猪品种中分离的猪膜岛素特异性表达启动子PIP2能够特异 性调控目的基因在膜腺组织中表达，为转基因调控猪P细胞功能的动物模型建立奠定了 基础。
【附图说明】 阳01引 图1为启动子PIP2的PCR扩增电泳图；
[0014]其中：M为Marker2000 ;泳道 1-3 为PCI^productofPIP2 ;泳道 4 为negative control。 阳01引 图2为PMD18-T-PIP2的菌液PCR产物电泳图；
[0016] 其中：M为MarkerfOOO;泳道 1-3 为PC化roductsofPIP2 ;泳道 4 为negative control。
[0017] 图3为启动子PIP2测序BLAST结果。 阳01引图4为启动子PIP2序列分析；
[0019] 其中：划线部分为转录启动子区，方框部分为TATA盒和GC盒。
[0020] 图5为双酶切产物电泳图；
[0021] 其中：M为MarkerfOOO;泳道 1-3 为PMD18-T-PIP2 双酶切；泳道 4-6 为EGFP-I双 酶切。
[0022] 图6为EGFP-1-PIP2双酶切电泳图；
[0023] 其中；M-Marke巧000 ;泳道1-2为EGFP-1-PIP2质粒双酶切。
[0024] 图7为转染前细胞状态； 阳0巧]其中：A为PK-15;B为C2C12;C为 0TC-6。 阳0%] 图8为转染4化后细胞形态W及表达情况观察； 阳0八]其中：A、B、C为EGFP-1-PIP2 分别转染 0TC-6、C2C12、PK15 的细胞；D、E、F为EGFP-Cl分别转染 0TC-6、C2C12、PK15 的细胞；G、H、J为EGFP-I分别转染 0TC-6、C2C12、 PK15的细胞。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不 局限于实施例表示的范围。运些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此 夕F，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可W对本发明作各种修改，运些等价变化同 样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
[0029] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所 使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030] 连施例1:
[0031] 1.1试验材料
[0032] 1. 1. 1试验样品
[0033] 广西己马小型猪血液样品采自广西大学己马小型猪封闭猪场。
[0034] 1. 1. 2菌株及克隆载体
[0035] D册a感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；不含启动子的EGFP-I载体 为广西大学动物遗传实验室保存。
[0036] 1. 1. 3主要试剂及来源
[0037] 2XESTap聚合酶购自北京康为世纪生物科技有限公司；
[0038]SnaBI、甜al限制性内切酶、PMD18-Tvector、T4连接酶购自TaKaRa公司；
[0039] 基因组DNA提取试剂盒、DNA胶回收纯化试剂盒、小提质粒抽提试剂盒购自杭州博 日度ioFlux)生物有限公司； W40] 小提去内毒素质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司；
[0041] 氨节霉素、卡那霉素、氯化钢、氯化钟购自上海华舜生物技术有限公司；
[0042] 膜蛋白腺、酵母提取物、琼脂粉、氯化钢：德国OXOID ; 阳0创 DNA Marker购自广州东盛生物科技有限公司；
[0044] 细胞转染试剂、细胞培养基和FBS购自Gibco公司。
[0045] 1.1. 4试剂的配制
[0046] (I)LB液体培养基：称取膜蛋白腺2.Og,酵母浸出物1.Og,氯化钢2.Og,d地2〇定 容200血，化OH溶液调PH值7. 0,高压灭菌后保存于4°C冰箱备用。
[0047] (2)琼脂平板的制作：称取膜蛋白腺2. 5g，酵母浸出物1. 25g，氯化钢2. 5g，琼脂粉 3. 75g，d地2〇定容250血，调PH值到7. 0后高压灭菌40分钟，稍稍冷却后按1 :1000的比例 加入IOOmg/血的氨节青霉素或卡那青霉素，W10血一个的量倒板于玻璃平板内，完全凝固 后保存于4°C冰箱。
[0048] (3)lOOmg/mL氨节青霉素\卡那霉素储存液：称取Ig氨节青霉素溶于10血d地2〇 中，分装后保存于-20°C冰箱。
[0049]1. 2试验方法 阳化0] 1. 2. 1 DNA提取
[0051] 己马小型猪血液样品DNA抽提按照DNA提取试剂盒说明书进行。
[0052] 1. 2. 2引物的设计与合成
[0053] 根据GenBank中已发表的普通猪膜岛素启动子2(PIP2)基因序列（序列号： AY044828. 1)，设计一对特异性引物（Primer-F: 5' -TACGTAGCCTTGCACACCCTCTCA-3'；Prime r-R:5^-GGATCCACAGCTGGTCCCAGAGGG-3'。上下游引物的5'端分别添加SnaBI和甜al酶切 位点（划线部分），所扩增的片段约为853bp，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
[0054] 1.2. 3PCR扩增 W55]W己马小型猪基因组DNA为模板，扩增PIP2启动子序列，PCR反应体系为 20.OyL:基因组DNALOyL,上、下游引物（lOymol/L)各0. 5yL，PCRTaq酶 10. 0yL(3mM Mg2〇，d地2〇 8. 0yL。反应程序：94°C预变性 2min;94°C30s，55°C30s，72°C30s，进行 30 个 循环；72 °C延伸2min。终产物用I%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0056] 1.2.4目的片段连接T载体
[0057]PCR产物的回收纯化按照博日度ioFlux)胶回收试剂盒说明进行。将回收的PIP2 片段连接至PMD18-TVector,连接反应体系见表1。
[0058] 表1连接反应液的组成
[0059]
W60] 将连接反应液混匀、封口，于16°C连接IOhW上。
[0061] 1.2. 5