专利名称：特异性且同时抑制参与疾病的基因的化合物和它们的用途以及相关药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及产品、它们的制备方法、它们的使用方法及含有它们的组合物，其可通过对参与病变的若干基因诱导不可逆的损害而同时抑制这些基因的表达。更具体涉及一种方法和产品，其可选择性靶向被选基因并同时抑制由涉及已知病变的若干基因共有的共有序列。
三螺旋形成性寡核苷酸(TFO)在the Museum National d′HistoireNaturelle USM 0503 Unit INSERM UR565，CNRS UMR 5153的生物实验室研究，目的是特异性干扰特定基因的表达。这些TFO已经用于其它应用，例如，质粒的纯化或靶序列的化学修饰。1997年，体外研究显示喜树碱衍生物，一种I型拓扑异构酶抑制剂或、更准确而言，毒物，与形成三螺旋的寡核苷酸的化学偶联可使I型拓扑异构酶导致的DNA裂解特异性针对由三螺旋寡核苷酸靶向的寡嘧啶-寡嘌呤序列(Matteucci等人，J.Am.Chem.Soc.119(1997)pp 6939-6940)。
正如文献，特别是本发明人发表的出版物中已经描述的那样(Arimondo等人，1999、2000、2001a、b、2002)，与特异性DNA配体偶联的I型拓扑异构酶抑制剂变成对DNA配体的结合位点特异。在本发明中，与DNA配体共价连接的I型拓扑异构酶毒物之后也被称作缀合物。该方法可研制出抗肿瘤剂，其作用机理是以涉及肿瘤状态的单一基因的选择性调节为基础的(
图1)。
某些I型拓扑异构酶抑制剂，如两种喜树碱衍生物(简言之CPT)已用于临床实践中，但具有相当高的毒性水平，可能与它们的序列特异性较低有关。
抗肿瘤药物的选择性问题也存在于其它类型的化疗药物，如抗生素中。
药物的靶向可被看作是现代疗法中的普遍问题且还涉及代谢疾病和自身免疫疾病。
现在已经发现由连接臂连接的含有I型拓扑异构酶毒物和DNA序列-特异性配体的特异性缀合物能够使I型拓扑异构酶毒物特异性作用于目标基因上，该基因的表达与疾病，特别是肿瘤或感染性疾病有关。
按照本发明可克服现有技术中提到的问题和缺点，其主要主题如下。
本发明首先涉及式A-B-C的化合物用于制备治疗基因表达所致疾病的药物的用途，其中A是能够同时且特异性识别病理目标基因共有的序列的DNA序列-特异性配体；B是连接臂，所述连接臂与A的3’末端结合；C是I型拓扑异构酶毒物；且所述基因被稳定的I型拓扑异构酶-介导的DNA裂解抑制。
在本发明的研究中，本发明人还发现了新的式A-B-C的化合物，它们是本发明的特定主题。
本发明还涉及用于制备上述化合物、含有它们的组合物的方法以及在新药物的研制和药理学试验中使用所述化合物的方法。
本发明的另一主题涉及一种同时抑制若干靶基因表达的方法，所述靶基因编码病理目标蛋白，特别是涉及肿瘤的发展和维持的蛋白、或病毒和病原蛋白、或涉及代谢或自身免疫疾病的蛋白，包括下列步骤(i)通过至少一种拓扑异构酶抑制剂与至少一种能够同时且特异性识别所述靶基因共有的序列的DNA序列-特异性配体的缀合物，使至少一种I型拓扑异构酶抑制剂作用于对所述基因特异性的位点，(ii)所述缀合物的配体识别基因组中的所述基因并获得所述配体与靶基因的结合，(iii)诱导I型拓扑异构酶-介导的DNA裂解并抑制所述基因的表达。
按照本发明，该方法可特别在体外和体内进行。
通过使用所述排列，可使I型拓扑异构酶抑制剂作用于DNA-特异性位点并利用I型拓扑异构酶在这些位点上选择性诱导断裂。与DNA-特异性配体偶联的抑制剂本身变得对DNA配体固定位点特异。有利地，可根据病变种类选择靶DNA序列。
根据本发明的优选实施方案，在其表达可控制细胞肿瘤状态的发展和维持的那些中选择所述基因。在特别优选的实施方案中，该基因选自IGF-1、IGF-1R、VEGF、BCL2。
根据本发明另一优选实施方案，在感染性微生物或病毒的那些中选择所述基因。在特别优选的实施方案中，该基因是选自HIV或HCV病毒的病原体的那些。
根据本发明另一优选实施方案，所述基因在涉及代谢疾病的那些中选择。
根据本发明另一优选实施方案，所述基因在涉及自身免疫疾病的那些中选择。
根据本发明，I型拓扑异构酶抑制剂或更准确地说是毒物，是使由I型拓扑异构酶的催化作用介导的DNA/I型拓扑异构酶裂解复合物稳定的分子。该毒物有利地选自嵌入剂，如吲哚并咔唑及其衍生物、茚并异喹啉，非嵌入剂，如喜树碱及其衍生物，小沟配体，如苯并咪唑及其衍生物。
根据本发明的优选实施方案，该毒物是喜树碱，更优选是喜树碱衍生物。
优选的喜树碱衍生物是式(I)的化合物
其中R1是-C(R5)＝N-(O)n-R4基团，其中n是0或1，R4是氢或直链或支链C1-C8烷基或C2-C8烯基、或C3-C10环烷基、或直链或支链(C3-C10)环烷基-(C1-C8)烷基、或C6-C14芳基、或直链或支链(C6-C14)芳基-(C1-C8)烷基、或杂环基或直链或支链杂环-(C1-C8)烷基，所述杂环基含有至少一个杂原子，所述杂原子选自任选被(C1-C8)烷基取代的氮原子、和/或氧原子和/或硫原子；所述烷基、烯基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环基或杂环-烷基可任选被一个或多个选自下列的基团取代卤素、羟基、酮基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NR6R7，其中R6和R7可以相同或不同，是氢、直链或支链(C1-C8)烷基、-COOH或其一种药学可接受的酯；或-CONR8R9基团，其中R8和R9可以相同或不同，是氢、直链或支链(C1-C8)烷基、苯基；或R4是(C6-C10)芳基或(C6-C10)芳磺酰基，任选被一个或多个选自下列的基团取代卤素、羟基、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C1-C8烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NR10R11，其中R10和R11，它们可以相同或不同，是氢、直链或支链C1-C8烷基；或R4是聚氨烷基，特别是-(CH2)m-NR12-(CH2)p-NR13-(CH2)q-NH2，其中m和p是2-6的整数且q是0-6的整数，包括端值且R12和R13是直链或支链C1-C8烷基，例如，N-(4-氨丁基)-2-氨乙基、N-(3-氨丙基)-4-氨丁基、N-[N-3-氨丙基)-N-(4-氨丁基)]-3-氨丙基；或R4是糖基，例如6-D-半乳糖基或6-D-葡萄糖基；R5是氢、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基、C3-C10环烷基、直链或支链(C3-C10)环烷基-(C1-C8)烷基、C6-C14芳基、直链或支链(C6-C14)芳基-(C1-C8)烷基；R2和R3，它们可以相同或不同，是氢、羟基、直链或支链C1-C8烷氧基；N1-氧化物、外消旋混合物、它们的各对映异构体、它们的各非对映异构体、它们的混合物、和药学可接受的盐。
式(I)化合物的优选例子，是其中n为1，R4是2-氨乙基或3-氨丙基，R2和R3是氢的那些(这些化合物在此处也分别被称作ST1578和ST2541)。
这些化合物在WO00/53607中完全公开且引入此处作为参考。
其它优选的喜树碱衍生物是式(II)的化合物 其中A是饱和或不饱和的直链或支链C1-C8烷基、C3-C10环烷基、直链或支链C3-C10环烷基-C1-C8烷基；当n和m等于1时，那么Y是被NR12R13或N+R12R13R14取代的饱和或不饱和的直链或支链C1-C8烷基，其中R12、R13和R14可以相同或不同，是氢或直链或支链C1-C4烷基，或Y是BCOOX，其中B是氨基酸残基，X是H、直链或支链C1-C4烷基、苯甲基或苯基，在适合位置上被至少一个选自C1-C4烷氧基、卤素、硝基、氨基、C1-C4烷基的基团取代，或，如果n和m都为0；Y是4-三甲铵-3-羟基丁酰基，是内盐的形式和药学可接受的酸的阴离子盐的形式，或Y是N+R12R13R14，如上面所定义的；R1是氢或-C(R5)＝N-(O)p-R4基团，其中p为0或1，R4是氢或直链或支链C1-C8烷基或C2-C8烯基、或C3-C10环烷基、或直链或支链(C3-C10)环烷基-(C1-C8)烷基、或C6-C14芳基、或直链或支链(C6-C14)芳基-(C1-C8)烷基、或杂环基或直链或支链杂环-(C1-C8)烷基，所述杂环基含有至少一个杂原子，所述杂原子选自任选被(C1-C8)烷基取代的氮原子、和/或氧原子和/或硫原子；所述烷基、烯基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环基或杂环-烷基可任选被一个或多个选自下列的基团取代卤素、羟基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NR6R7，其中R6和R7可以相同或不同，是氢、直链或支链(C1-C8)烷基，-COOH或其一种药学可接受的酯；或-CONR8R9基团，其中R8和R9可以相同或不同，是氢、直链或支链(C1-C8)烷基；或R4是(C6-C10)芳基或(C6-C10)芳磺酰基，任选被一个或多个选自下列的基团取代卤素、羟基、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C1-C8烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NR10R11，其中R10和R11可以相同或不同，是氢、直链或支链C1-C8烷基；或R4是聚氨烷基；或R4是糖基；R5是氢、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基、C3-C10环烷基、直链或支链(C3-C10)环烷基-(C1-C8)烷基、C6-C14芳基、直链或支链(C6-C14)芳基-(C1-C8)烷基；R2和R3可以相同或不同，是氢、羟基、直链或支链C1-C8烷氧基；N1-氧化物、外消旋混合物、它们的各对映异构体、它们的各非对映异构体、它们的混合物、和药学可接受的盐。
式(II)化合物的优选例子是其中p为1，R4是叔-丁基的那些，特别优选的化合物是琥珀酰基-缬氨酰基-20-O-(7-叔丁氧基亚氨基甲基喜树碱)(此处称作ST2677)。
这些化合物在WO 03/101996中完全公开并引入此处作为参考。
另一优选的喜树碱衍生物是式(III)或(IV)的化合物
其中R1是氢或-C(R5)＝N-(O)p-R4基团，其中p是整数0或1，R4是氢或直链或支链C1-C8烷基或C2-C8烯基、或C3-C10环烷基、或直链或支链(C3-C10)环烷基-(C1-C5)烷基或C6-C14芳基、或直链或支链(C6-C14)芳基-(C1-C8)烷基、或杂环基或直链或支链杂环-(C1-C8)烷基，所述杂环基含有至少一个杂原子，所述杂原子选自任选被(C1-C8)烷基取代的氮原子、和/或氧原子和/或硫原子；所述烷基、烯基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环基或杂环-烷基可任选被一个或多个选自下列的基团取代卤素、羟基、C1-C8烷基、C1-C9烷氧基、苯基、氰基、硝基、和-NR6R7，其中R6和R7可以相同或不同，是氢、直链或支链(C1-C8)烷基，-COOH或其一种药学可接受的酯；或-CONR8R9基团，其中R8和R9可以相同或不同，是氢、直链或支链(C1-C8)烷基；或R4是(C6-C10)芳基或(C6-C10)芳磺酰基，任选被一个或多个选自下列的基团取代卤素、羟基、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C1-C8烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NR10R11，其中R10和R11可以相同或不同，是氢、直链或支链C1-C9烷基；或R4是聚氨烷基；或R4是糖基；R5是氢、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基、C3-C10环烷基、直链或支链(C3-C10)环烷基-(C1-C8)烷基、C6-C14芳基、直链或支链(C6-C14)芳基-(C1-C8)烷基；R2和R3可以相同或不同，是氢、羟基、直链或支链C1-C8烷氧基；n＝1或2，Z选自氢、直链或支链C1-C4烷基；N1-氧化物、外消旋混合物、它们的各对映异构体、它们的各非对映异构体、它们的混合物、和它们药学可接受的盐。
这些化合物在WO 03/101995中完全公开且引入此处作为参考。
另一优选的喜树碱是在Arimondo P.B.等人，Nucleic AcidResearch，2003，Vol.31，No.14；4031-4040中公开的那个，具体而言是7-乙基-10-羟基喜树碱。另一优选的化合物是10-羟基喜树碱。
配体选自核糖核酸、脱氧核糖核酸、PNA、肽核酸、2’O-烷基核糖核酸、寡氨基磷酸酯(oligophosphoramidate)、LNA(核糖构象被阻断的RNA(Petersen和Wengel 2003)且当它形成三股螺旋时被称作TFO，当它与小沟结合时被称作MGB。后者选自N-甲基吡咯、N-甲基咪唑和N-甲基-3-羟基吡咯和β-丙氨酸的聚酰胺。
本发明的主题还有式I的化合物A-B-C其中A是能够同时且特异性识别病理目标基因共有的序列的DNA序列-特异性配体；B是连接臂，所述连接臂与A的3’末端结合；C是上式(I)-(IV)的喜树碱衍生物。
在本发明的广泛教导中，上述化合物的单元A和C可通过毒物分子不同位置的连接臂连接，条件是该位置具有适宜的官能团与配体结合。
在本发明的优选实施方案中，使用喜树碱衍生物，优选配体A可与喜树碱分子在第7、10或20位相连。
适宜的连接臂包括长度为1-50、优选2-30的碳与选自N或O的杂原子的连续片段(succession)；且末端部分能够反应产生磷酰胺或酰胺键，或硫酯(thioeter)。
这种连接臂的例子是二氨基烷基，如-HN-(CH2)n-NH-，其中n是整数1-12；-NH-(CH2)n-CO-、二醇(-O(CH2)mO)n-，其中n是整数2-6，m是2-3。
根据所述实施方案，缀合物的例子选自TFO-L3-SCPT、和(3+3)-CPT、(4+4)-CPT、TFO-18-L6-10CPT TFO-18-L4-10CPT、TFO16-L6-10CPT、和TFO 16-L4-10CPT、TFO16-L6-7CPT、TFO18-L6-7CPT、SCPT-Ln-TFO、TFO-L4-cCPT、TFO-L6-cCPT，其中TFO是三螺旋形成性寡核苷酸，L是CH2基团数且CPT是喜树碱衍生物。(3+3)和(4+4)是发夹聚酰胺。
其它缀合物包括瑞必克霉素，特别是瑞必克霉素的吲哚并咔唑衍生物作为毒物。
种缀合物的例子是TFO-Ln-RBC(Ln＝-O(CH2)2O)n-，n＝2；3或6。
根据本发明另一实施方案，所述缀合物是一种二元复合物，其特征在于它由配体，如上面所定义的，和所述I型拓扑异构酶抑制剂的衍生物组成，其中所述连接臂被整合到抑制剂的取代基中。所述取代基包括能够与磷酸酯或硫代磷酸酯基团反应的末端部分。这种缀合物的例子是TFO-ST1578和TFO-ST2541以及式(I)-(IV)的相关化合物。
第三类缀合物的特征在于它由配体，被发挥所述连接体的部分作用的基团取代的所述I型拓扑异构酶毒物的衍生物，和连接臂组成。例子是TFO-(CH2)n-cCPT，n是2-6的整数；TFO-(CH2)3-SCPT、SCT-TFO、TFO-ST2677。
如上所述，本发明的缀合物在所述靶基因的各寡嘧啶·寡嘌呤序列附近进行I型拓扑异构酶-介导的DNA裂解，所述靶基因在第2和30位之间含有很多嘌呤。
由于DNA/I型拓扑异构酶裂解复合物的几何学，裂解位点应在靶序列寡嘧啶链的三股螺旋的3’侧上。
该化合物的特征还在于由I型拓扑异构酶抑制剂诱导的所述裂解位点距离配体结合位点末端1-10个核苷酸。
取代基的例子包括二氨基烷基，任选不饱和，如H2N(CH2)n-O-N＝CH-，其中n是2-6的整数，和式(I)-(IV)化合物的R4基团中可识别的那些基团。
其它取代基包括含-CO-NH-基团的二羧酸链。
这种基团是例如 ，其中R是C1-C4直链或支链烷基，n’是1-6的整数。
在本发明的缀合物中，抑制剂是例如喜树碱且取代基占据其第20位。
根据本发明另一实施方案，该缀合物包含经由上述连接臂与抑制剂的取代基相连的配体。
本发明还涉及所述缀合物的制备方法。磷酰胺键是如Grimm等人，2000所述，在有4-二甲基氨基吡啶存在的条件下，通过与三苯基膦和二吡啶基二硫化物反应获得的；而酰胺键或者通过该方法形成，或者利用酸功能的碳二亚胺激活形成，或者通过使用HATU的改进的肽合成过程形成。
与细胞抑制分子相比，所述缀合物通过新的机理而特别有效。如实施例所示，所述缀合物渗透到细胞中并结合它们的靶。
因此本发明的新方法目的在于维持该最佳抗肿瘤有效性，同时降低副作用。
例如，建立了在大约15％的病例中I型拓扑异构酶抑制剂的使用与继发性白血病的出现有关，其特征在于基因的相互易位。
使这些抑制剂作用于某些被选基因可通过治疗作用更好的选择性来降低它们的致白血病能力。
本发明还涉及所述缀合物在特异性抑制目标基因表达或同时抑制若干基因表达的方法中的用途，例如该基因或这些基因编码一种或多种病毒或病原蛋白，或涉及细胞肿瘤状态的发展和维持的蛋白。
以有利的方式，判断出单一的寡核苷酸-抑制剂缀合物可具有与目前临床所用抗肿瘤药物的组合类似的作用。与单独使用CPT相比，缀合物靶向的位点数大大降低。
因此，本发明还涉及药物组合物，其特征在于它们包含有效量的至少一种上述缀合物，以及药学惰性载体。
这些组合物的注射或喷雾给药的形式是有利的。单位和每日剂量由本领域技术人员根据病变类型，特别是所治疗癌症的类型来测量。
在这一点上，应认识到可仅体外在无细胞系统中试验本领域公开的一些缀合物。本发明人发现很难，甚至不能将化合物给予细胞。因此，本发明的化合物，不论是新化合物还是已知化合物的使用，都将连同转染载体一起在无细胞系统中给药。转染载体的例子是纳米颗粒、脂质体、阳离子脂类和阳离子聚合物。
以十分令人吃惊的方式，其中C是式(I)-(IV)的喜树碱衍生物，特别是用代码ST1578和ST2677鉴定的喜树碱衍生物的化合物无需任何转染载体来向细胞给药，这是因为它们可穿透离体细胞膜。因此，含化合物A-B-C的组合物和药物，其中C是式(I)-(IV)的喜树碱衍生物，特别是用代码ST1578和ST2677鉴定的喜树碱衍生物，有利地无需补充转染载体，由此使它们的生物学应用更简单。
本发明的其它特征和优点可参考科学文献、附图和实施例给出，其中-图1是举例说明利用I型拓扑异构酶将DNA的裂解/切割靶向特定位点的简图；-图2A举例说明已知的研究系统含有靶寡嘌呤·寡嘧啶序列和相应的三螺旋形成性寡核苷酸(TFO)序列的324-bp双螺旋。
修饰三螺旋形成性寡核苷酸(TFO16、TFO18、TFO20、TFO23)，以增加复合物的稳定性(例如，使用5-甲基-脱氧胞嘧啶(M)和5-丙炔基-脱氧尿嘧啶(P)。TFO与20S-10-羧基喜树碱(10CPT)、20S-7-氨乙基喜树碱(7CPT)、20S-7-乙基-10-羟基喜树碱乙酸(SCPT)、20S-7-氨基乙基亚氨基甲基喜树碱(ST1578)、20S-7-氨基丙基亚氨基甲基喜树碱(ST2541)和琥珀酰基-缬氨酰基-20-O-(7-叔丁氧基亚氨基甲基喜树碱)(ST2677)偶联。
(3+3)和(4+4)发夹聚酰胺类型的两个小沟配体与10-羧基喜树碱(10CPT)偶联。
TFO16与2个小沟配体的结合位点由正方形表示。寡核苷酸与寡嘌呤·寡嘧啶序列结合，与Watson-Crick碱基对的嘌呤形成Hoogsteen-型氢键。
小沟配体，(3+3)和(4+4)，在小沟中结合相互作用。缀合物的化学式在图下方详列且连接臂用斜体字表示。寡核苷酸源自Eurogentec(Belgium)公司并按照Grimm等人。
Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 19(2000)pp.1943-1965所述方法及以使用HATU为基础的改良的肽合成方法与抑制剂偶联。小沟配体是按照Arimondo等人，Angewandte Chem.Int.Ed.40(2001)pp.3045-3048所述合成的；-图2B表示喜树碱衍生物ST1578、ST2541和ST2677及缀合物TFO-ST1578、TFO-ST2541、TFO-L4-ST2677和TFO-L4-1OCPT的化学式；-图3A表示I型拓扑异构酶裂解位点。在有三种喜树碱衍生物(孔2-4，10CPT、7CPT、SCPT)或与TFO16缀合的这三个衍生物(孔5-7，TFO16-L4-10CPT、TFO16-L6-CPT、TFO16-L3-SCPT)存在的条件下，用I型拓扑异构酶培育寡嘧啶链3’位(孔1)上的放射性标记的324-bp双螺旋。裂解位点用字母表示，缀合物的结合位点以图表示。L3＝二氨基丙炔基；L4＝二氨基丁基，L6＝二氨基己基；培育后，通过用SDS/蛋白酶K处理而消化蛋白，并在变性凝胶上分析裂解产物；-图3B代表使用本发明其它缀合物获得的结果，其中使用DNA作为对照，在仅有拓扑异构酶存在的条件下或与5μM的10CPT、ST1578、ST2677或ST2541、或1μm未缀合的TFO一起，所有缀合物均利用人拓扑异构酶仅在寡核苷酸结合位点的3’侧进行DNA裂解，其中抑制剂位于三股螺旋形成处(位点b)。nTFO具有未修饰的胞嘧啶核苷及胸腺嘧啶核苷。
相反，单独的抑制剂在很多位点刺激裂解(位点a、b、c和d)。
缀合物TFO-ST1578和TFO-ST2541较之缀合物TFO-L4-10 CPT有效3倍。
缀合物TFO-L4-ST2677与缀合物TFO-L4-10 CPT相当。
还给出了有关另一化学修饰的TFO，即具有序列+CP+CP+CP+CP+CP+TP+TP+TP的LNA(被锁核酸)(其中C表示LNA胞嘧啶核苷且+T＝LNA胸腺嘧啶核苷)的结果。
LNA以一步合成的方式与ST1578相连，得到LNA-ST1678缀合物。评价其在位点b进行裂解的效果。所述缀合物较之TFO-ST1578类似物的有效性要低2倍。
DNA/I型拓扑异构酶裂解复合物的分子限制支配三元复合物的几何学并在有结合的三螺旋形成性寡核苷酸存在的条件下指导DNA裂解。
-图4表示三股螺旋的存在可诱导靶序列的寡嘌呤链的三股螺旋5’侧的裂解和寡嘧啶链的3’侧的裂解，而不论其是否为优选位点。寡核苷酸3’位上抑制剂的存在具有扩增信号的作用。
-图5A代表实验构造所用质粒是通过在含SV40启动子的控制下的Pyralis荧光素酶基因的pGL3启动子载体(Promega)的转录且未翻译区中的Hind III/Nco I位点克隆54-bp的双螺旋获得的。TFO结合序列和其附近的对喜树碱敏感的位点位于Pyralis荧光素酶基因(luc)上游的转录区中。
54-bp的插入物包含完整的三股螺旋序列(pWT)，用于体外实验中；在3个位点上突变的三股螺旋序列(pMUT)；三股螺旋序列且在3’侧上存在一个熟知的由喜树碱刺激的裂解位点(pTID)，和插入在相反链上从而避免TFO任何反义作用的完整的三股螺旋序列(pIWT)。
-图5B给出靶双螺旋、TFO和对照寡核苷酸序列TFO-L4-10CPT用作缀合物且，作为对照，3’位被磷酸保护的寡核苷酸(化合物TFOP)、或3’位被用于偶联10CPT的NH2-(CH2)4-NH2连接臂保护的寡核苷酸(化合物TFO-NH2)。所述臂与二苯乙酸连接(化合物TFO-NPh2)。作为最后的对照，使用含相同修正碱基但具有不同序列的寡核苷酸，其或者在3’位与磷酸连接(16HIVUP)，或经由连接臂NH2-(CH2)6-NH2与10CPT连接(化合物16HIV-CPT)。然后将缀合物TFO-ST1578与TFO-L4-10CPT进行比较。
-图6A首次举例说明使用这些分子抑制HeLa细胞中Pyralis荧光素酶基因的转录。在37℃和10％CO2条件下，在补充了FCS 10％的DMEM(Invitrogen)中培养人粘着HeLa细胞。以125μL/孔将细胞接种在(110000个细胞/mL)96孔平板中。24小时后，用112.5μL新鲜培养基和12.5μL转染混合物更换培养基。所述转染混合物含有1μgpGL3Pr或修饰的；0.5μg pRL-TK、各浓度的寡核苷酸及3μLSuperfectTM(QIAGEN)，混合于没有血清的培养基中。一式两份或一式三份制备该混合物。24小时后，将细胞溶解并评价荧光素酶表达。Dual-luciferaseTMReporter Assay System(Promega)用于测定两个报道基因(Pyralis和Renilla)在同一细胞溶解产物上的活性96-孔平板的每个孔均溶于30μL被动溶解缓冲液中，用配有自动装置的“Duai-luciferaseTMReporter Assay System”(Victor/Wallac)对15μL进行分析。活性之间的比值(Pyralis和Renilla)用于测量作用的选择性。相对于没有缀合物(DNA)存在条件下的质粒表达，校准有不同寡核苷酸存在条件下的活性之间的所有比值。对照寡核苷酸对Pyralis荧光素酶的表达没有作用。只有0.5μM缀合物TFO-L4-10CPT抑制两个靶的表达约40-50％，两个靶都含有完整的三股螺旋序列(pTID和pWT)。
该缀合物对没有插入物的市售质粒pGL3Pr没有作用且对具有突变三股螺旋的质粒(pMUT)的作用大大降低；-图6B涉及使用具有反向链的质粒构建体时获得的结果。
-图7A和7B表示在有缀合物存在条件下形成三股螺旋且存在强特异性断裂(实施例A)、在三股螺旋位点突变的情况下没有形成三股螺旋且没有DNA特异性裂解(实施例B)、在双螺旋裂解位点b和c突变的情况下形成三股螺旋但三股螺旋3’末端没有较强的I型拓扑异构酶-介导的DNA裂解位点(实施例C)。
-图8给出生物学作用与DNA/I型拓扑异构酶/CPT复合物形成之间的关联结果在细胞中形成复合物后进行免疫印迹。
-图9举例说明用于本发明方法中的特定缀合物/复合物的有效性(与单独的抑制剂相比的裂解强度和已知位点a、b、c和d)。
通过将拓扑异构酶抑制剂与能够特异性识别DNA序列的寡核苷酸缀合，可使抑制剂靶向一类被选基因，这是由于在与被选基因共有的靶序列上形成了特异性三股螺旋复合物。然后可对这些基因选择性诱导不可逆的损害并抑制它们的表达。
这可以本来已知的方式实现，特别是，使用I型拓扑异构酶抑制剂与序列-特异性DNA配体，如寡核苷酸，或非-核酸配体如小沟配体(由N-甲基吡咯和咪唑组成的聚酰胺)或锌指肽共价偶联。
事实上，这种配体可分别通过在双螺旋的大沟和小沟中结合而特异性识别特定的DNA序列。I型拓扑异构酶抑制剂与这些DNA配体的化学偶联可选择性使抑制剂定位于配体结合位点附近，并因此使I型拓扑异构酶诱导的断裂特异性针对该位点。
本发明人因此以拓扑异构酶抑制剂对涉及细胞肿瘤状态的增殖和维持的基因或一组基因的靶向作用为基础提出了一个新的概念。选择这些基因，例如，控制细胞循环和分裂、增殖的基因，和抗-编程性细胞死亡的基因。该策略也可针对病毒基因。
根据被选寡核苷酸的长度，可调节选择性，以便仅针对单一基因，或广泛地，以便抑制一组基因。
抗肿瘤化疗中的该创新策略可被延伸至其它病变，所述其它病变中若干基因/功能的同时抑制很显然将是治疗目标。
下面将要描述的药物化学方法的有效性基本上属于新的“双头”方法学的定义，其中使用具有2个头的缀合物，一个识别靶DNA，另一个募集拓扑异构酶。
这些化合物的设计必须适合所针对的序列且必须具有上述特征。
该生药学方法包括基于I型拓扑异构酶毒物对涉及癌性肿瘤的细胞增殖和维持的特异性基因的靶向作用研究新的治疗策略。
所述方法包括将I型拓扑异构酶抑制剂与修饰或未修饰的寡核苷酸化学偶联，该寡核苷酸能够通过在特别涉及细胞生长和/或抗编程性细胞死亡、血管生成的基因上形成稳定的三股螺旋而选择性结合(图2寡核苷酸-抑制剂缀合物靶向I型拓扑异构酶-介导的DNA裂解)。
DNA配体方法提供了同时作用于若干基因表达的可能性，其中选择这些基因共有的靶序列。
为了有效治疗多基因病变如癌症，事实上重要的是同时控制基因家族，且更准确而言，控制改变细胞正常增殖循环的一组基因。
因此，以十分有利的方式，单一的寡核苷酸-抑制剂缀合物可能具有与目前临床所用的抗肿瘤药物组合类似的作用。
该方法可维持最佳抗肿瘤有效性，同时降低某些副作用。
例如，已经确定的事实是II型拓扑异构酶的使用，在大约15％病例中，与特征在于相互基因易位的继发性白血病的出现有关。使这些抑制剂针对特定的被选基因可通过治疗作用更好的选择性来降低它们的致白血病能力。
且在其中一个特别重要的方面，本发明还涉及一种方法，可使I型拓扑异构酶抑制剂的作用针对DNA-特异性位点，从而能够利用I型拓扑异构酶在该位点选择性诱导裂解。
之后将通过举例但非限制性说明来详细描述该新概念，其中使用两组涉及癌症发展和维持的基因(1)生存途径的基因，如当生长因子IGF-1(胰岛素-样生长因子-1)与其受体(IGF-1R)结合时建立的基因和(2)抑制编程性细胞死亡的基因，如IAP和Bcl-2家族的抗编程性细胞死亡的基因。这些基因在某些癌症中过量表达，阻断它们可产生抗肿瘤作用。
本发明人对能够形成三股螺旋且为所要靶向的一组目标基因的共有序列的序列进行了研究。该研究是使用GCG软件Unixfindpatterns程序(Genetics Computer Group，Infobiogen，Villejuif)进行的。
在初步研究中，本发明人鉴定了与IGF-1、IGF-1R和AKT/PBK基因共有的、含12个碱基对(bps)的寡嘧啶序列，和与bcl-2、bcl-XL和survivine抗-编程性细胞死亡基因共有的10-bp序列。
此外，图2所述TFO序列与表1报道的基因结合。当游离CPT衍生物以较小的特异性(且因此在许多位点)在基因组中诱导裂解时，具有图2所述碱基序列的TFO-毒物缀合物仅在这些基因上诱导裂解，且，它们之中，特别是，IGF1R和VEGF，涉及肿瘤增殖和维持。研究是利用在UCSC公开得到的生物信息学资源进行的。
正如已经提到的，还可使用序列-特异性DNA的非-核酸配体，如小沟配体(N-甲基吡咯和N-甲基咪唑组成的聚酰胺)使拓扑异构酶抑制剂作用于规定位点。
它们的使用应当可以没有由于形成稳定的三股螺旋而带来的寡嘧啶·寡嘌呤靶序列限制。
此后给出与喜树碱偶联的小沟配体的结果。
对一组靶基因共有的序列进行研究应当能够限定最佳靶序列，以这种方式选择，从而仅形成一部分，或主要地，被选一组基因的一部分。
如果使用三股螺旋寡核苷酸，缀合物所致的裂解针对含2-100，优选10-30个嘌呤的各寡嘧啶寡嘌呤靶序列，I型拓扑异构酶诱导的裂解位点位于靶序列寡嘧啶链的3’侧上。
此外，由抑制剂诱导的裂解位点有利地距离三股螺旋末端1-10个核苷酸，且连接臂适合于裂解位点、所用抑制剂和抑制剂与寡核苷酸连接的点。
关于寡核苷酸-拓扑异构酶抑制剂缀合物，本发明人进行了喜树碱衍生物即拓扑异构酶抑制剂的偶联。在准备工作中，本发明人指出喜树碱和瑞必克霉素衍生物(它们是I型拓扑异构酶抑制剂)与16个核苷酸长的寡核苷酸的共价偶联，使得I型拓扑异构酶所致的裂解在体外特异性针对其中由于三股螺旋形成而决定抑制剂位置的位点(Arimondo等人，1999，2000a)。
可使用其它类型的抑制剂进行同一步骤，它们是可以相同方式，即共价方式与DNA-特异性配体的末端连接的拓扑异构酶毒物。
连接配体部分和抑制剂部分的连接臂的优化是非常重要的，且相对于配体结合位点和抑制剂与寡核苷酸连接的点，必须适合于所用抑制剂的裂解位点位置(Arimondo等人，2002)。
合成寡核苷酸-抑制剂缀合物后，且在评价它们的细胞活性前，应当通过凝胶位移实验和热离解实验分析它们形成三股螺旋的能力。例如，图2描述的组成中的TFO体外结合两个试验基因中的配体识别位点并使I型拓扑异构酶-介导的DNA裂解特异性针对该配体识别位点，所述两个试验基因共有同一靶序列。
被选抑制剂的细胞活性关于寡核苷酸-I型拓扑异构酶抑制剂缀合物的活性，分子和细胞系统可研究不同缀合物对包括IGF-1及其受体的基因级联的作用(Hamel等人，1999)。特别是，可通过直接分析基因组DNA、和transcriptome(DNA芯片和RNA印迹)及蛋白质组(二维凝胶和蛋白质印迹)的作用特异性而评价裂解活性。因为IGF-1和IGF-1R基因涉及成胶质细胞瘤、肝癌和前列腺肿瘤的增殖，因此反义构建体对它们的抑制可阻断移植到动物上的肿瘤增殖(Lafarge-Frayssinet等人，1977)。对培养物中肿瘤细胞的试验可选择最有效的寡核苷酸缀合物，并使用动物模型(例如，将成胶质细胞瘤注射到裸小鼠中或将肝癌注射到同系基因大鼠中)。
缀合物的药动学还可使用标准方法评价。
对于最有效的缀合物，它们抑制癌细胞增殖的能力可通过使用不同肿瘤细胞系部分评价，在来源于异种移植到小鼠中的人肿瘤体内模型上体外评价细胞毒性最大的分子。
某些方面工业应用的实施例和本发明的目的与I型拓扑异构酶抑制剂偶联的DNA配体作为抗癌剂的评价。
经济效益是十分可观的，因为涉及非常重要的癌症病例的新治疗途径。
因此鉴定病变中失调节的基因可形成新的药物产品的基础。
显然药物成功具有下列重要的结果·副作用减轻且治疗效率增加·与药物研究有关的费用减少·研究出适于患者的许多治疗解决方案·公众健康费用显著降低这种经济影响在癌症领域将是非常重要的，而原来只是在有效水平较低的若干治疗方案之间进行选择。
实施方案缩写词CPT＝喜树碱；P＝5-丙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷；M＝5-甲基-2’-脱氧胞嘧啶核苷；R＝双螺旋的寡嘌呤链，Y＝双螺旋的寡嘧啶链·＝Watson-Crick碱基配对Topo＝拓扑异构酶材料和方法抑制剂将所有抑制剂溶于二甲基亚砜中并用水稀释。在所有试验中，二甲基亚砜的终浓度均不超过0.3％(v/v)。
如图2所述，抑制剂与TFO的3’或5’末端结合。
按照Arimondo等人(2002)和Villemin等人(1996)所述的技术合成喜树碱衍生物。
寡核苷酸和DNA片段寡核苷酸由Eurogentec销售并在“quick spin”柱和SephadexG-25 fine(Boehringer，Mannheim)上纯化。25℃时，用分光光度法测量浓度，并使用根据最接近的模型计算的260nm摩尔消光系数(Cantor等人，1970)。
CTP缀合物的合成喜树碱CPT衍生物通过不同的连接臂在寡核苷酸3’或5’末端与磷酸结合或与小沟配体N，N-二甲基-N’{1-甲基-4-[1-甲基-4-[1-甲基-4-[4-{[1-甲基-4-[1-甲基-4[1-甲基-4-(4-氨基butiryl)氨基吡咯基-2-羰基]氨基吡咯基-2-羰基]氨基吡咯基-2-羰基]}氨基butiryl]氨基吡咯基-2羰基]氨基吡咯基-2-羰基]氨基吡咯基-2-羰基}丙二胺(3+3)结合，其中对Grimm等人Nucleosides，Nucleotides(2000)描述的技术进行微小改进，对于酰胺键形成，使用适于寡核苷酸的HATU进行肽合成过程。连接臂通过氨基-末端的反应在3’或5’末端与磷酰化寡核苷酸结合，所述寡核苷酸已通过用N-甲基咪唑、二吡啶基二硫化物和三苯基膦处理而活化，如Arimondo等人(2001)AngewandteChem.和上面Arimondo(2002)所述。通过UV光谱和质谱描述缀合物的特征。
如Grimm等人，2000所述，当在ST1578和ST2541中没有使用连接臂时，CPT衍生物上的氨基直接与寡核苷酸的末端磷酸连接。
(DNA)靶基因的制备pBSK(+/-)质粒由Promega(USA)销售，77-bp的靶双螺旋插在BamHI和EcoRI位点之间。PvuII和EcoRI消化质粒，产生一个324聚体的片段，适于利用Klenow聚合酶(Ozyme，GB)和α[32P]dATP(Amersham，U.S.A.)在3’末端标记。分离、纯化和标记该双螺旋DNA的技术在(Arimondo 2002)中详细描述。两个59-bp的双螺旋是通过利用末端转移酶(Ozyme，GB)和α[32P]ddATP(Amersham，U.S.A.)标记链，接着在90℃与未标记的互补链杂交5分钟，然后缓慢冷却至室温而获得的。接着如前面所述(Arimondo 2002)用凝胶色谱纯化放射性标记的片段。链的命名如下寡嘌呤为R链，寡嘧啶链为Y。
拓扑异构酶裂解试验30℃，在有上述浓度的TFO或MGB存在的条件下，在50mMTris-HCl，pH-7.5、60mM KCl、10mM MgCl2、0.5mM DTT、0.1mM EDTA和30μg/μL BSA中孵育放射性标记的双螺旋(50nM)1小时(总反应体积10μL)。为了分析I型拓扑异构酶DNA裂解产物，加入10个单位的酶(Invitrogen Inc)，按照上面所述用配体和/或抑制剂预-孵育，接着在30℃孵育20分钟。
通过加入SDS(终浓度0.25％)而解离I型拓扑异构酶-DNA复合物。乙醇沉淀后，将所有样品重悬于6μl甲酰胺中，加热至90℃共4分钟，再次在冰上冷却4分钟，接着长和短的靶序列分别在8％和10％变性聚丙烯酰胺凝胶[19/1丙烯酰胺∶双丙烯酰胺]上沉积，在1xTBE缓冲液(50mM Tris-HCl、55mM硼酸、1mM EDTA)中含有7.5M尿素。为了量化裂解强度，用Dynamics 445SI Phosphorimager扫描凝胶。为了测定裂解率，相对于总沉积进行标准化。
20S-(7-乙基-10-羟基喜树碱)乙酸(SCPT)，一种在制备于第10位与酸结合的TFO-SCPT和SCPT-TFO缀合物中使用的新CPT衍生物，以及在第10位或第7位连接的其它缀合物，如TFO-10CPT、和TFO-7CPT、(3+3)-CPT和(4+4)-CPT的化学式例如在图2A中给出的。具有发挥连接臂作用的取代基的喜树碱衍生物ST1578和ST2677在图2B中给出。
本发明人证实了将三种瑞必克霉素衍生物(与作为抗肿瘤剂的目前进行临床试验的分子相似)和六种喜树碱衍生物与TFO(三螺旋形成性寡核苷酸)偶联，并将10-羧基喜树碱衍生物与两个小沟配体偶联(MGB，小沟结合剂)(图2)的方法。
当不存在于抑制剂衍生物上或不够长时，本发明人经由适宜的连接臂将抑制剂与寡核苷酸其中一个末端或小沟配体共价结合。通过UV光谱和质谱(Q-star I)描述缀合物的特征。通过标准的I型拓扑异构酶裂解试验体外测量缀合物的裂解特异性。根据有与DNA配体偶联的抑制剂和有未-结合抑制剂存在条件下的裂解强度之间的关系计算裂解指数。靶向的例子在图3中给出。三个未偶联的喜树碱衍生物(孔2、3、4)在若干位点刺激裂解(位点a-i)。当衍生物使用适宜的臂与TFO的3’末端共价结合时，形成三股螺旋(孔5、6、7)，且缀合物仅在三股螺旋的3’侧诱导裂解(位点“b”)。这是由于缀合物的寡核苷酸部分与其靶结合，使抑制剂特异性作用于三股螺旋位点的3’侧。配体的存在，在寡核苷酸的情况下带负电荷，阻止缀合的抑制剂与其它位点结合，正如位点“a”消失所清楚表明的那样，位点“a”位于三股螺旋或与该位点相距较大距离处的其它位点的5’侧。
本发明人证实了I型拓扑异构酶将I型拓扑异构酶介导的DNA裂解靶向至不同长度(16、18、20和23个核苷酸)(见图9)的TFO和不同的瑞必克霉素和喜树碱衍生物的DNA配体结合位点附近。相同的方法可扩展至其它序列-特异性DNA配体，如N-甲基吡咯发夹聚酰胺，其在DNA的小沟中特异性结合(图2(3+3)-CPT和(4+4)-CPT缀合物)。本发明人还将它扩展至另一靶HIV-1病毒的PPT(聚嘌呤片段)(5’AAAAGAAAAGGGGGGA3/TTTTCTTTTCCCCCCT5’)以及存在于IGF-1的启动子中的22-聚体序列(5’GAAGAGGGAGAGAGAGAGAAGG3’/TCTTCTCCCTCTCTCTCTCTTCC5’)。此外，证实了图2所述TFO与IGF1R的内含子2结合(表1)。
因此该方法特别对于两类序列-特异性DNA配体(TFO和MGB)、不同种类的I型拓扑异构酶抑制剂和不同靶有效。
本发明的主题还在于上面定义的方法，其中，以有利的方式，所用配体是从由序列-特异性DNA配体如寡核苷酸，或非-核酸配体，如小沟配体(由N-甲基吡咯和N-甲基咪唑组成的发夹聚酰胺，特别是(3+3)-CPT和(4+4)-CPT缀合物)或锌指肽构成的组中选择的。
本发明人还证实了在配体结合位点受到刺激的I型拓扑异构酶裂解效率一方面取决于抑制剂与配体之间连接臂的大小，另一方面取决于抑制剂的内在有效性。此外，本发明人观察到通过配体结合使抗肿瘤剂定位具有增加该分子在靶位点处的体外局部浓度的作用；事实上，1-10nM浓度的缀合物可刺激I型拓扑异构酶所致的裂解。此外，当抑制剂与TFO结合且形成三股螺旋时，DNA/拓扑异构酶/抑制剂裂解复合物更加稳定。为了使它解离，需要高浓度的盐(＞600mM NaCl)。
该方法(其中这些抗肿瘤剂的作用选择性针对位点，该位点的序列通过配体-抑制剂缀合物的DNA配体的结合而被识别)在研究新的抗肿瘤药物方面是一种全新的方法。
目前，三元I型拓扑异构酶/DNA/抑制剂复合物的结构还不完全清楚，本发明人使用缀合物进行三元DNA/拓扑异构酶/抑制剂复合物的结构分析。改变抑制剂与TFO的连接点可改变三元复合物中抑制剂的定向并因此改变酶所致裂解的有效性(见图4和9)。因此本发明人将两个喜树碱衍生物即10-羧基喜树碱和7-氨基乙基喜树碱与不同长度的TFO共价结合。对三元复合物附近的位置和裂解强度进行研究，证实了目前描述三元复合物的模型是不适宜的，必须考虑其它构象。三元复合物的构象灵活性的另一指征来自下列事实，即不论10-羟基喜树碱是与大沟配体(TFO)或还是与小沟配体(MGB)连接，裂解有效性都是相当的。
意想不到的是，三股螺旋本身的单独存在，可诱导I型拓扑异构酶-介导的DNA裂解的特定靶向。
本发明人证实了当缀合物具有下述特征时发生裂解本发明的主题首先是一种同时抑制编码蛋白，特别是涉及肿瘤的发展和维持的若干靶基因表达的方法，包括下列步骤(iv)通过至少一种拓扑异构酶抑制剂与至少一种能够同时且特异性识别所述靶基因共有的序列的DNA序列-特异性配体的缀合，使至少一种I型拓扑异构酶抑制剂作用于对所述基因特异性的位点，(v)所述缀合物中的所述配体识别基因组中的所述基因，并且所述配体与所述靶标结合，(vi)诱导I型拓扑异构酶-介导的DNA裂解并抑制所述基因的表达。
接触阶段是使用含所述基因和拓扑异构酶、源于培养物的来自体内的细胞体外进行的。
拓扑异构酶抑制剂的存在可以有利的方式增强I型拓扑异构酶介导的DNA裂解的靶向作用。由三股螺旋诱导的该裂解取决于精确的几何学寡核苷酸与其靶的结合仅刺激靶序列的寡嘧啶链三股螺旋3’侧和靶序列的寡嘌呤链5’侧的裂解(图4)。
本发明还涉及至少一个配体的复合物，特别是与寡核苷酸形成的三股螺旋的复合物(“TFO”)，该寡核苷酸通过I型拓扑异构酶在靶序列的寡嘌呤链的5’侧上和靶基因寡嘧啶链的3’侧上诱导裂解。
此外，本发明涉及一种形成三股螺旋且在3’位与I型拓扑异构酶抑制剂偶联的嘧啶寡核苷酸，其刺激酶在三股螺旋3’侧上的选择性和强裂解。
三股螺旋的3’侧被定义为通过形成氢键，由TFO识别的寡嘌呤序列的3’侧。该裂解的定向与下列事实相关，即I型拓扑异构酶在裂解位点处DNA上的结合是不对称的且酶与裂解链的3’磷酸形成偶磷酪氨酰基而留下5’OH末端。因此三股螺旋可存在于靶上裂解位点的3’侧，对于酶而言没有空间位阻。必须强调的是不仅I型拓扑异构酶的优选位点是由于三股螺旋的存在而诱导的，而且该位点仅在有三股螺旋存在的条件下可以检测。可以设想这是由于与三股螺旋存在有关的DNA构象的局部改变。事实上，必须注意的是三股螺旋5’侧和3’侧的裂解有效性是不同的，且已知三股螺旋的两个末端是不等价的。另一方面，还可设想酶的前进被三股螺旋结构的物理阻断而终止，该三股螺旋结构引起酶“暂停”，并给它时间在附近裂解。这两个假设并不互相排斥。
本发明还涉及上述方法，包括下列步骤(vii)通过至少一种拓扑异构酶抑制剂与至少一种能够同时且特异性识别所述靶基因共有的序列的DNA序列-特异性配体的缀合，使至少一种I型拓扑异构酶抑制剂作用于对所述基因特异性的位点，(viii)所述缀合物中的所述配体识别基因组中的所述基因，并且所述配体与所识靶标结合，(ix)诱导I型拓扑异构酶-介导的DNA裂解并抑制所述基因的表达。
根据本发明方法的优选实施方案，靶序列含有由配体识别的位点，在寡核苷酸的情况下，所述配体是含有2-100、优选2-30个嘌呤碱基对的各寡嘧啶·寡嘌呤靶序列。
以更优选的方式，所述靶序列还在附近包括拓扑异构酶抑制剂的位点，从而获得更大的有效性。由抑制剂诱导的裂解位点必须距离三股螺旋末端1-10个核苷酸。连接臂必须适于裂解位点、所用抑制剂和抑制剂与寡核苷酸的连接点。
本发明人首次指出该方法在细胞中的有效性。
因为体外实验不能考虑到核屏障、染色质的结构、和缀合物在核中的特异性，因此本发明人在细胞系统中测试缀合物。该缀合物在细胞中诱导特异性作用，其取决于三股螺旋的形成以及与寡核苷酸偶联的抑制剂的存在。
更准确而言，本发明人使用转染到HeLa细胞中的质粒表达载体，其中TFO的结合序列和其附近对喜树碱敏感的位点的序列位于Pyralis荧光素酶基因(luc)上游的转录区。该质粒是在载体pGL3Promoter(Promega)中Hind III和Nco I位点之间克隆具有54个碱基对的片段后获得的，该片段含有图5所述序列。pRL-TK(Promega)，编码Renilla荧光素酶基因，被用作转染对照。
在37℃和10％CO2条件下，在补充有10％FCS的DMEM培养基(Invitrogen)中培养HeLa人粘附细胞。
以125μL/孔将细胞接种(110,000个细胞/mL)在96-孔平板上。24小时后，用含有血清的新鲜培养基和12.5μL转染混合物更换细胞培养基。转染混合物含有1μg pWT或pMTUC或pMUT或pIWT；0.5μgpRL-TK、不同浓度的寡核苷酸、和3μL SuperfectTM(Qiagen)，混合于没有血清的培养基中。一式两份或一式三份制备混合物。24小时后，将细胞溶解用于荧光素酶表达测定。
“dual-LuciferaseTMReporter Assay System”(Promega)用于测定两个报道基因(Pyralis和Renilla)在同一细胞溶解产物上的活性96-孔平板的每个孔均溶于30μL“被动溶解缓冲液”中，用配有自动化装置的“dual-LuciferaseTMReporter Assay System”试剂盒(Victor/Wallac)对15μL进行分析。
两个活性(Pyralis/Renilla)之间的比值用于测量作用的选择性。图6表示有不同寡核苷酸存在条件下的两个活性之间的比值，通过与没有缀合物存在条件下的质粒表达相比较而标准化。描述三个质粒pWT、pMTUC和pMUT以及寡核苷酸部分的长度、臂长度和结合的喜树碱衍生物不同的4个缀合物。在3’位与(CH2)4-NH2(寡-NH2)臂结合的寡核苷酸TFO 16用作对照。该寡核苷酸形成非常稳定的三股螺旋。
1μM对照寡核苷酸寡-NH2(其形成三股螺旋)的存在可抑制荧光素酶基因表达的约30％。与喜树碱偶联可增强抑制作用(缀合物可抑制45％-60％)。抑制的这种增强可通过体外观察到的，在有通过三股螺旋形成而定位的喜树碱存在的条件下，由拓扑异构酶在三股螺旋位点附近诱导的DNA裂解来解释。缀合物的有效性不同10-羧基喜树碱TFO16的衍生物TFO16-L6-10CPT和TFO16-L4-10CPT最有效(约抑制60％)(见图9)。结合臂的长度不会很大程度地影响抑制的有效性。体外实验表明这些缀合物可有效刺激距离三股螺旋3’末端4bp的位点“b”处的裂解(见上面，图3)。TFO18-L6-10CPT缀合物，体外同样有效，但较之16-聚体特异性较低，仅抑制45％的荧光素酶基因表达。TFO16-L6-7CPT缀合物，含有7-氨基乙基喜树碱，较之相应的TFO16-L6-10CPT缀合物有效性较低，约抑制50％。这与抑制剂裂解有效性的体外结果一致10-羧基喜树碱较之7-氨基乙基-喜树碱可更有效刺激I型拓扑异构酶所致的DNA裂解。所观察到的作用确实是由于缀合物的寡核苷酸部分导致在靶上形成三股螺旋。这是通过测量三股螺旋序列中突变靶上的两个(pMTUC)或三个(pMUT)位点加以证实的。两处嘌呤突变的存在降低了抑制的有效性，仍然形成三股螺旋，但不太有效寡-NH2从30％抑制到约15％，TFO16-L6-10CPT缀合物从60％-45％。结合位点中存在三处嘧啶突变意味着抑制的全部丧失。见图7A和7B。
为了避免缀合物对合成的RNA(pIWT)的反义作用，使用具有反向链的质粒构建体。结果在图6B中给出。对照组不能抑制荧光素酶Pyralis的表达，0.5μM缀合物TFO-L4-CPT可抑制其40-50％表达。缀合物TFO-ST1578仍然更有效，且经测量，在0.5μM时抑制50-60％。所述缀合物对质粒pGL3Pr构建体是非活性的，该质粒没有三股螺旋位点。
在与图8相对应的实验中，制备HeLa核细胞(5000000)并在37℃培养3小时，其中使用游离的I型拓扑异构酶毒物(CPT或ST1578)，或与寡核苷酸偶联的I型拓扑异构酶毒物(TFO-L4-10CPT或TFO-ST1578或LNA-ST1578)，或使用不同浓度的对照寡核苷酸(TFO-NH2或TFO-NPh2)(在图8中为5μM)。
加入N-十二烷基肌氨酸钠(sarkosyl)后，以CsCl梯度将溶解产物超速离心16小时。回收12个级分并通过蛋白质狭线印迹分析显示含I型拓扑异构酶的级分(未处理过的对照组在1-4中(mock))。
通过测量260nm处的吸光度来鉴定含DNA的级分(级分8-10)。在有抑制剂(CPT或ST1578)或缀合物TFO-L4-10CPT、TFO-ST1578或LNA-ST1578存在的条件下，仅在含DNA的级分中观察到I型拓扑异构酶，表示DNA/I型拓扑异构酶裂解复合物的稳定化。使用对照TFO(TFO-NH2、TFO-NPh2)，相对于未处理过的细胞，I型拓扑异构酶仅存在于第一级分中(mock)。
使用该方法，本发明人指出缀合物可通过拓扑异构酶在细胞系统中的被选位点上诱导特异性断裂。可使用不同的I型拓扑异构酶且抑制取决于抑制剂的内在有效性，正如发明人使用六种喜树碱衍生物和吲哚并咔唑衍生物观察到的。
为了增加抑制剂的作用，可使用化学修饰的寡核苷酸，如PNA、肽核酸，2’O烷基核糖核酸、寡氨基磷酸酯、LNA(核糖构象被阻断的RNA)。
缀合物可针对·单一序列，例如，存在于人基因组中，其病变依赖特定(单一)基因表达，或存在于病毒前基因组(progenome)中(例如，导致特定病毒HIV和HSV发展的基因)或存在于寄生虫基因组中。然后缀合物可选择性灭活基因；·或涉及病变维持和发展的若干基因共有的靶序列(例如，致癌基因、生长因子、抗-编程性细胞死亡的基因、控制细胞循环和分裂的基因，其参与在肿瘤细胞中观察到的疾病)。然后缀合物可同时控制若干基因。
事实上，根据相对于缀合物配体部分选择的结合位点的长度和序列，缀合物的选择性可以是严格的，为了仅针对单一基因，或宽松的，为了靶向一组基因。
在第一种情况下，可靶向整合病毒的基因组并被针对仅存在于该基因组中的序列的缀合物特异性裂解。在本申请的范围内，本发明人扩展了该方法，从而包括HIV-1病毒的PPT。
在第二种情况下，若干基因(其涉及某些肿瘤病变)可被I型拓扑异构酶特异性且同时裂解，其中选择了共有靶序列。
与癌特性的获得和维持有关的基因的同时抑制可针对重要的生物化学过程，该生物化学过程对肿瘤细胞的恶性性质是特异性的。本发明人选择了两组基因，涉及生长信号的传输和编程性细胞死亡的抑制。在第一种情况下，选择生长因子IGF-1(胰岛素-样生长因子-1)、其受体IGF-1R和位于相应信号化级联下游的基因。这些基因可激活细胞存活途径并涉及成胶质细胞瘤、肝癌和前列腺肿瘤的增殖。反义构建体对IGF-1或IGF-1R基因的抑制可阻断移植到动物中的肿瘤增殖。在第二种情况下，目的是在癌细胞中诱导编程性细胞死亡，针对编程性细胞死亡-抑制基因共有的序列(例如C-IAP1/2、XIAP、survivine、bcl-2、bcl-W、bcl-XL、Mcl-1)。编程性细胞死亡或细胞程序性死亡是由caspase进行的细胞受控裂解。该过程受诱导编程性细胞死亡的蛋白与抑制它的蛋白之间的平衡所控制。编程性细胞死亡-抑制基因通过延长细胞生命，增加导致细胞恶性转化的基因事件的几率；它们在癌细胞中常常过量表达。
为了研究与本发明人希望针对的基因组共有的序列形成三股螺旋的序列，后者使用GCG Unix软件findpatterns程序(GeneticsComputer Group，Wisconsin package version 8.1，by Infobiogen，Villejuif)，还使用UCSC人基因组数据库。
对IGF-1、IGF-1R和AKT/PKB基因共有的12个碱基对(bps)(GGAGGAGGAGGG)的寡嘧啶-寡嘌呤序列和抗-编程性细胞死亡的bcl-2、bcl-XL和survivine基因共有的10-bp序列(GAAGAAGAGG)进行的初步研究显示了该方法的可行性。寡嘧啶·寡嘌呤序列的选择不是该方法的限制，因为这些序列在人基因组中过量提供且全部基因(调节区、编码和非-编码区)是三螺旋形成性寡核苷酸的潜在靶。
此外，图2描述的寡核苷酸可识别存在于若干基因中的共有序列(表1)，例如，涉及癌性特征的获得和维持的IGF1R和VEGF。此外，不能忘记的是拓扑异构酶抑制剂具有特定序列特异性，通常限于裂解位点周围的二核苷酸。事实上，本发明人观察到缀合物与三股螺旋位点的结合不足以诱导较强裂解且三股螺旋位点附近存在的对抑制剂特异性的位点对于拓扑异构酶所致的裂解的募集和诱导是十分优选的。本发明人据此推断出靶向序列优选不仅含有寡核苷酸识别的位点，还在其附近含有I型拓扑异构酶抑制剂的位点，因此增加缀合物的选择性。
最终，本发明人证实了DNA配体如寡核苷酸和N-甲基吡咯和N-甲基咪唑的聚酰胺的方法，但原理可扩展至其它种类的配体，如锌指肽。
本发明的主题还在于·此外，上述定义的方法特征还在于缀合物(特别包括TFO(三螺旋形成性寡核苷酸)-拓扑异构酶抑制剂)所致的裂解可针对所述含2-100、优选2-30个嘌呤的寡嘧啶·寡嘌呤靶基因的各序列，由I型拓扑异构酶抑制剂在靶序列寡嘧啶链3’侧上诱导的裂解位点更有效。
·此外，上面定义的方法特征还在于I型拓扑异构酶诱导的所述裂解位点位于自三股螺旋末端开始的1-10个核苷酸。
·此外，上面定义的方法特征还在于所述靶基因的序列或者是存在于参与病变的基因上的基因组中的单一靶序列，或者是仅存在于病毒或寄生虫基因中且不存在于人基因组中的靶，或是存在于涉及病变的维持或发展的一组基因上的序列。
此外，本发明人提出和/或表明·用于本发明方法中的缀合物应构成能够作用于细胞增殖、生长因子或激素受体信号化、及抗-编程性细胞死亡基因组的新的有效抗肿瘤剂。
·与I型拓扑异构酶抑制剂偶联的所述小沟配体还选择性将酶所致裂解针对配体的结合位点并具有与寡核苷酸-抑制剂缀合物相同的应用。
参考文献Arimondo et al.，C.R.Acad.Sci.Paris，Series III，Sciencesde la Vie/Life Sciences 322.
(1999)pp.785-790.
Arimondo et al.，Bioorg.Med.Chem.8(2000)pp.777-784.
Arimondo et al.，Bioconj.Chem.12(2001)pp.501-509.
Arimondo et al.，Angewandte Chem.Int.Ed.40(2001)pp.3045-3048.
Arimondo et al.，J.Biol.Chem.277(2002)pp.3132-3140.
Cantor et al.，(1970)Biopolymers 9，pp.1059-1077.
Grimm et al.(2000)Nucleosides，Nucleotides，Nucleic Acids，pp.1943-65Shevelev，A.；Burfeind，P.；Schulze，E.；Rininsland，F.；Johnson，T.R.；Trojan，J.；Chernicky，C.L.；Hélène，C.；Ilan，J.Cancer Gene Ther.1997，4，105-112Lafarge-Frayssinet，C.；Duc，H.T.Frayssinet，C.；Sarasin，A.；Anthony，D.；Guo，Y.；Trojan，J.Cancer Gene Ther.
1997，5，276-285Hamel Y，Lacoste J，Frayssinet C，Sarasin A，Garestier T，Francois JC，Helene C.
Inhibition of gene expression by anti-sense C-5 propyneoligonucleotides detected by a reporter enzyme.
Biochem J.1999 May 1；339(Pt 3)547-53.
Petersen M，Wengel J.
LNAa versatile tool for therapeutics and genomics.
Trends Biotechnol.2003 Feb；21(2)74-81.
Villemin et al.26(1996)Synthetic Communications pp.4337-4341.
权利要求
1.式A-B-C的化合物用于制备治疗基因表达所致疾病的药物中的用途，其中A是能够同时且特异性识别病理目标基因共有的序列的DNA序列-特异性配体；B是连接臂，所述连接臂与A的3’末端结合；C是I型拓扑异构酶毒物；且所述基因被稳定的I型拓扑异构酶-介导的DNA裂解所抑制。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述基因是其表达控制细胞肿瘤状态的发展和维持的基因。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述基因是选自IGF-1、IGF-1R、VEGF、BCL2的基因。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述基因是感染性微生物或病毒的基因。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述基因是HIV或HCV病毒的基因。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述基因参与代谢疾病。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述基因参与自身免疫疾病。
8.根据权利要求1-7任何一项所述的用途，其中所述I型拓扑异构酶毒物选自喜树碱、瑞必克霉素、小沟配体和苯并咪唑。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述拓扑异构酶毒物是喜树碱。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述喜树碱选自7-乙基-10-羟基喜树碱和10-羟基喜树碱。
11.根据权利要求9所述的用途，其中所述喜树碱是式(I)的化合物 其中R1是-C(R5)＝N-(O)n-R4基团，其中R4是氢或直链或支链C1-C8烷基或C2-C8烯基、或C3-C10环烷基、或直链或支链(C3-C10)环烷基-(C1-C8)烷基、或C6-C14芳基、或直链或支链(C6-C14)芳基-(C1-C8)烷基、或杂环基或直链或支链杂环-(C1-C8)烷基，所述杂环基含有至少一个杂原子，所述杂原子选自任选被(C1-C8)烷基取代的氮原子、和/或氧原子和/或硫原子；所述烷基、烯基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环基或杂环-烷基可任选被一个或多个选自下列的基团取代卤素、羟基、酮基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NR6R7，其中R6和R7可以相同或不同，是氢、直链或支链(C1-C8)烷基、-COOH或其一种药学可接受的酯；或-CONR8R9基团，其中R8和R9可以相同或不同，是氢、直链或支链(C1-C8)烷基、苯基；或R4是(C6-C10)芳酰基或(C6-C10)芳磺酰基，任选被一个或多个选自下列的基团取代卤素、羟基、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C1-C8烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NR10R11，其中R10和R11可以相同或不同，是氢、直链或支链C1-C8烷基；或R4是聚氨烷基；或R4是糖基；R5是氢、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基、C3-C10环烷基、直链或支链(C3-C10)环烷基-(C1-C8)烷基、C6-C14芳基、直链或支链(C6-C14)芳基-(C1-C8)烷基；R2和R3可以相同或不同，是氢、羟基、直链或支链C1-C8烷氧基；N1-氧化物、外消旋混合物、它们的各对映异构体、它们的各非对映异构体、它们的混合物、和药学可接受的盐。
12.根据权利要求9所述的用途，其中所述喜树碱是式(II)的化合物 其中A是饱和或不饱和的直链或支链C1-C8烷基、C3-C10环烷基、直链或支链C3-C10环烷基-C1-C8烷基；当n和m等于1时，那么Y是被NR12R13或N+R12R13R14取代的饱和或不饱和的直链或支链C1-C8烷基，其中R12、R13和R14可以相同或不同，是氢或直链或支链C1-C4烷基，或Y是BCOOX，其中B是氨基酸残基，X是H、直链或支链C1-C4烷基、苯甲基或苯基，在适合位置上被至少一个选自C1-C4烷氧基、卤素、硝基、氨基、C1-C4烷基的基团取代，或，如果n和m都为0；Y是4-三甲铵-3-羟基丁酰基，是内盐的形式和药学可接受的酸的阴离子盐的形式，或Y是N+R12R13R14，如上面所定义的；R1是氢或-C(R5)＝N-(O)p-R4基团，其中p为0或1，R4是氢或直链或支链C1-C8烷基或C1-C8烯基、或C3-C10环烷基、或直链或支链(C3-C10)环烷基-(C1-C8)烷基、或C6-C14芳基、或直链或支链(C6-C14)芳基-(C1-C8)烷基、或杂环基或直链或支链杂环-(C1-C8)烷基，所述杂环基含有至少一个杂原子，所述杂原子选自任选被(C1-C8)烷基取代的氮原子、和/或氧原子和/或硫原子；所述烷基、烯基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环基或杂环-烷基可任选被一个或多个选自下列的基团取代卤素、羟基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NR6R7，其中R6和R7可以相同或不同，是氢、直链或支链(C1-C8)烷基，-COOH或其一种药学可接受的酯；或-CONR8R9基团，其中R8和R9可以相同或不同，是氢、直链或支链(C1-C8)烷基；或R4是(C6-C10)芳酰基或(C6-C10)芳磺酰基，任选被一个或多个选自下列的基团取代卤素、羟基、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C1-C8烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NR10R11，其中R10和R11可以相同或不同，是氢、直链或支链C1-C8烷基；或R4是聚氨烷基；或R4是糖基；R5是氢、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基、C3-C10环烷基、直链或支链(C3-C10)环烷基-(C1-C8)烷基、C6-C14芳基、直链或支链(C6-C14)芳基-(C1-C8)烷基；R2和R3可以相同或不同，是氢、羟基、直链或支链C1-C8烷氧基；N1-氧化物、外消旋混合物、它们的各对映异构体、它们的各非对映异构体、它们的混合物、和药学可接受的盐。
13.根据权利要求9所述的用途，其中所述喜树碱是式(III)或(IV)的化合物 其中R1是氢或-C(R5)＝N-(O)p-R4基团，其中p是整数0或1，R4是氢或直链或支链C1-C8烷基或C2-C8烯基、或C3-C10环烷基、或直链或支链(C3-C10)环烷基-(C1-C5)烷基或C6-C14芳基、或直链或支链(C6-C14)芳基-(C1-C8)烷基、或杂环基或直链或支链杂环-(C1-C8)烷基，所述杂环基含有至少一个杂原子，所述杂原子选自任选被(C1-C8)烷基取代的氮原子、和/或氧原子和/或硫原子；所述烷基、烯基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环基或杂环-烷基可任选被一个或多个选自下列的基团取代卤素、羟基、C1-C8烷基、C1-C9烷氧基、苯基、氰基、硝基、和-NR6R7，其中R6和R7可以相同或不同，是氢、直链或支链(C1-C8)烷基，-COOH或其一种药学可接受的酯；或-CONR8R9基团，其中R8和R9可以相同或不同，是氢、直链或支链(C1-C8)烷基；或R4是(C6-C10)芳酰基或(C6-C10)芳磺酰基，任选被一个或多个选自下列的基团取代卤素、羟基、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C1-C8烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NR10R11，其中R10和R11可以相同或不同，是氢、直链或支链C1-C9烷基；或R4是聚氨烷基；或R4是糖基；R5是氢、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基、C3-C10环烷基、直链或支链(C3-C10)环烷基-(C1-C8)烷基、C6-C14芳基、直链或支链(C6-C14)芳基-(C1-C8)烷基；R2和R3可以相同或不同，是氢、羟基、直链或支链C1-C8烷氧基；n＝1或2，Z选自氢、直链或支链C1-C4烷基；N1-氧化物、外消旋混合物、它们的各对映异构体、它们的各非对映异构体、它们的混合物、和它们药学可接受的盐。
14.根据权利要求9所述的用途，其中所述喜树碱是7-乙基-10-羟基喜树碱或10-羟基喜树碱。
15.根据权利要求1-14任何一项所述的用途，其中所述配体是三螺旋形成性寡核苷酸(TFO)。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述TFO选自核糖核酸、脱氧核糖核酸、PNA、肽核酸、2’O-烷基核糖核酸、寡氨基磷酸酯、LNA。
17.根据权利要求1-14任何一项所述的用途，其中所述DNA序列-特异性配体是小沟结合剂(MGB)。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述MGB选自N-甲基吡咯、N-甲基咪唑和N-甲基-3-羟基吡咯和β-丙氨酸的聚酰胺。
19.根据权利要求1-18任何一项所述的用途，其中所述连接臂是通过长度为1-50，优选2-30的、碳原子和选自N或O的杂原子的接续形成的；且末端部分能够反应产生磷酰胺或酰胺键、或thioeter。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述连接臂选自二氨基烷基和二醇。
21.根据权利要求1-20任何一项所述的用途，其中所述药物是通过局部注射到疾病部位给药的。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述疾病是肿瘤或感染。
23.根据权利要求1-20任何一项所述的用途，其中所述药物是通过全身途径给药的且所述化合物被转染载体载体化，或仅是所述化合物。
24.根据权利要求20所述的用途，其中所述转染载体选自纳米颗粒、脂质体、阳离子脂类和阳离子聚合物。
25.根据权利要求1-20任何一项所述的用途，其中所述药物是通过全身途径给药的，且在化合物中，C选自7-(2-氨基乙氧基亚氨基甲基)喜树碱和7-(3-氨基丙氧基亚氨基甲基)喜树碱。
26.式I的化合物A-B-C其中A是能够同时且特异性识别病理目标基因共有的序列的DNA序列-特异性配体；B是连接臂，所述连接臂与A的3’末端结合；C是式I的喜树碱衍生物其中 R1是-C(R5)＝N-(O)n-R4基团，其中R4是氢或直链或支链C1-C8烷基或C2-C8烯基、或C3-C10环烷基、或直链或支链(C3-C10)环烷基-(C1-C8)烷基、或C6-C14芳基、或直链或支链(C6-C14)芳基-(C1-C8)烷基、或杂环基或直链或支链杂环-(C1-C8)烷基，所述杂环基含有至少一个杂原子，所述杂原子选自任选被(C1-C8)烷基取代的氮原子、和/或氧原子和/或硫原子；所述烷基、烯基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环基或杂环-烷基可任选被一个或多个选自下列的基团取代卤素、羟基、酮基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NR6R7，其中R6和R7可以相同或不同，是氢、直链或支链(C1-C8)烷基，-COOH或其一种药学可接受的酯；或-CONR8R9基团，其中R8和R9可以相同或不同，是氢、直链或支链(C1-C8)烷基、苯基；或R4是(C6-C10)芳酰基或(C6-C10)芳磺酰基，任选被一个或多个选自下列的基团取代卤素、羟基、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C1-C8烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NR10R11，其中R10和R11可以相同或不同，是氢、直链或支链C1-C8烷基；或R4是聚氨烷基；或R4是糖基R5是氢、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基、C3-C10环烷基、直链或支链(C3-C10)环烷基-(C1-C8)烷基、C6-C14芳基、直链或支链(C6-C14)芳基-(C1-C8)烷基；R2和R3可以相同或不同，是氢、羟基、直链或支链C1-C8烷氧基；N1-氧化物、外消旋混合物、它们的各对映异构体、它们的各非对映异构体、它们的混合物、和药学可接受的盐。
27.根据权利要求26所述的化合物，其中R1选自2-氨基乙氧基亚氨基甲基和3-氨基丙氧基亚氨基甲基，R2和R3是氢。
28.式I的化合物A-B-C其中A是能够同时且特异性识别病理目标基因共有的序列的DNA序列-特异性配体；B是连接臂，所述连接臂与A的3’末端结合；C是式(II)的喜树碱衍生物 其中A是饱和或不饱和的直链或支链C1-C8烷基、C3-C10环烷基、直链或支链C3-C10环烷基-C1-C8烷基；当n和m等于1时，那么Y是被NR12R13或N+R12R13R14取代的饱和或不饱和的直链或支链C1-C8烷基，其中R12、R13和R14可以相同或不同，是氢或直链或支链C1-C4烷基，或Y是BCOOX，其中B是氨基酸残基，X是H、直链或支链C1-C4烷基、苯甲基或苯基，在适合位置上被至少一个选自C1-C4烷氧基、卤素、硝基、氨基、C1-C4烷基的基团取代，或，如果n和m都为0；Y是4-三甲铵-3-羟基丁酰基，是内盐的形式和药学可接受的酸的阴离子盐的形式，或Y是N+R12R13R14，如上面所定义的；R1是氢或-C(R5)＝N-(O)p-R4基团，其中p为0或1，R4是氢或直链或支链C1-C8烷基或C1-C8烯基、或C3-C10环烷基、或直链或支链(C3-C10)环烷基-(C1-C8)烷基、或C6-C14芳基、或直链或支链(C6-C14)芳基-(C1-C8)烷基、或杂环基或直链或支链杂环-(C1-C8)烷基，所述杂环基含有至少一个杂原子，所述杂原子选自任选被(C1-C8)烷基取代的氮原子、和/或氧原子和/或硫原子；所述烷基、烯基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环基或杂环-烷基可任选被一个或多个选自下列的基团取代卤素、羟基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NR6R7，其中R6和R7可以相同或不同，是氢、直链或支链(C1-C8)烷基、-COOH或其一种药学可接受的酯；或-CONR8R9基团，其中R8和R9可以相同或不同，是氢、直链或支链(C1-C8)烷基；或R4是(C6-C10)芳酰基或(C6-C10)芳磺酰基，任选被一个或多个选自下列的基团取代卤素、羟基、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C1-C8烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NR10R11，其中R10和R11可以相同或不同，是氢、直链或支链C1-C8烷基；或R4是聚氨烷基；或R4是糖基；R5是氢、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基、C3-C10环烷基、直链或支链(C3-C10)环烷基-(C1-C8)烷基、C6-C14芳基、直链或支链(C6-C14)芳基-(C1-C8)烷基；R2和R3可以相同或不同，是氢、羟基、直链或支链C1-C8烷氧基；N1-氧化物、外消旋混合物、它们的各对映异构体、它们的各非对映异构体、它们的混合物、和药学可接受的盐。
29.式A-B-C的化合物，其中A是能够同时且特异性识别病理目标基因共有的序列的DNA序列-特异性配体；B是连接臂，所述连接臂与A的3’末端结合；C是式(III)或(IV)的喜树碱衍生物 其中R1是氢或-C(R5)＝N-(O)p-R4基团，其中p是整数0或1，R4是氢或直链或支链C1-C8烷基或C2-C8烯基、或C3-C10环烷基、或直链或支链(C3-C10)环烷基-(C1-C5)烷基或C6-C14芳基、或直链或支链(C6-C14)芳基-(C1-C8)烷基、或杂环基或直链或支链杂环-(C1-C8)烷基，所述杂环基含有至少一个杂原子，所述杂原子选自任选被(C1-C8)烷基取代的氮原子、和/或氧原子和/或硫原子；所述烷基、烯基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环基或杂环-烷基可任选被一个或多个选自下列的基团取代卤素、羟基、C1-C8烷基、C1-C9烷氧基、苯基、氰基、硝基、和-NR6R7，其中R6和R7可以相同或不同，是氢、直链或支链(C1-C8)烷基，-COOH或其一种药学可接受的酯；或-CONR8R9基团，其中R8和R9可以相同或不同，是氢、直链或支链(C1-C8)烷基；或R4是(C6-C10)芳酰基或(C6-C10)芳磺酰基，任选被一个或多个选自下列的基团取代卤素、羟基、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C1-C8烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NR10R11，其中R10和R11可以相同或不同，是氢、直链或支链C1-C9烷基；或R4是聚氨烷基；或R4是糖基；R5是氢、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基、C3-C10环烷基、直链或支链(C3-C10)环烷基-(C1-C8)烷基、C6-C14芳基、直链或支链(C6-C14)芳基-(C1-C8)烷基；R2和R3可以相同或不同，是氢、羟基、直链或支链C1-C8烷氧基；n＝1或2，Z选自氢、直链或支链C1-C4烷基；N1-氧化物、外消旋混合物、它们的各对映异构体、它们的各非对映异构体、它们的混合物、和它们药学可接受的盐。
30.式A-B-C的化合物，其中A是能够同时且特异性识别病理目标基因共有的序列的DNA序列-特异性配体；B是连接臂，所述连接臂与A的3’末端结合；C是喜树碱衍生物，选自7-乙基-10-羟基喜树碱和10-羟基喜树碱、琥珀酰基-缬氨酰基-20-O-(7-叔丁氧基亚氨基甲基喜树碱)(ST2677)、20S-7-氨基乙基亚氨基甲基喜树碱(ST1578)、20S-7-氨基丙基亚氨基甲基喜树碱(ST2541)。
31.一种药物组合物，包含权利要求1所述的化合物以及至少一种药学可接受的载体和/或赋形剂。
32.根据权利要求31所述的药物组合物，适于注射。
33.根据权利要求31或32所述的药物组合物，还包含转染载体。
34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述转染载体选自纳米颗粒、脂质体、阳离子脂类和阳离子聚合物。
35.一种同时抑制编码病理目标蛋白，特别是参与肿瘤的发展和维持的蛋白、或病毒和病原蛋白、或参与代谢或自身免疫疾病的蛋白的若干靶基因表达的体外方法，包括下列步骤(i)通过至少一种拓扑异构酶抑制剂与至少一种能够同时且特异性识别所述靶基因共有的序列的DNA序列-特异性配体的所述缀合物，使至少一种I型拓扑异构酶抑制剂作用于对所述基因特异性的位点，(ii)所述缀合物中的所述配体识别基因组中的所述基因，并且所述配体与所述靶结合，(iii)诱导I型拓扑异构酶-介导的DNA裂解并抑制所述基因的表达。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述靶基因的序列在其附近包括拓扑异构酶抑制剂的位点。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述至少一种拓扑异构酶抑制剂选自嵌入剂，如吲哚并咔唑及其衍生物、非-嵌入剂，如喜树碱及其衍生物，小沟配体，如苯并咪唑及其衍生物。
38.根据权利要求35-37任何一项所述的方法，其中所述至少一种配体选自核糖核酸、脱氧核糖核酸、PNA、肽核酸、2′O-烷基核糖核酸、寡氨基磷酸酯、LNA，且当它形成三股螺旋时与TFO相应，当它与小沟结合时与MGB相应，且选自N-甲基吡咯、N-甲基咪唑和N-甲基-3-羟基吡咯和β-丙氨酸的聚酰胺。
39.根据权利要求35-38任何一项所述的方法，其中由包含三螺旋形成性寡核苷酸-拓扑异构酶抑制剂的缀合物导致的裂解针对所述靶基因的各寡嘧啶·寡嘌呤序列，所述靶基因含有2-100个、优选10-30个嘌呤，由I型拓扑异构酶抑制剂诱导的裂解位点在所述靶的寡嘧啶链三股螺旋的3’侧上。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述由拓扑异构酶抑制剂诱导的裂解位点距离三股螺旋末端3-8个核苷酸。
41.根据权利要求35-40任何一项所述的方法，其中所述靶基因的序列存在于一组基因中，特别是参与编程性细胞死亡生长和/或抑制信号的传送的基因中。
全文摘要
本发明涉及式A－B－C的化合物用于制备治疗基因表达所致疾病的药物的用途，其中A是能够同时且特异性识别病理目标基因共有的序列的DNA序列－特异性配体；B是连接臂，所述连接臂与A的3’末端结合；C是I型拓扑异构酶毒物；且所述基因被稳定的I型拓扑异构酶－介导的DNA裂解所抑制。此外，特别是，用于治疗感染性微生物或病毒、代谢疾病和自身免疫疾病。
文档编号A61K31/7088GK1771325SQ200480007155
公开日2006年5月10日 申请日期2004年3月18日 优先权日2003年3月18日
发明者P·B·阿里蒙多, A·布多林, 孙建生, C·贝利, C·埃莱娜, T·加雷斯捷 申请人:国家健康医学研究所, 国家科研中心, 国家自然历史博物馆