抗淋巴瘤基因家族特异性核酸疫苗组合物的制作方法

专利名称：抗淋巴瘤基因家族特异性核酸疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明抗淋巴瘤基因家族特异性核酸疫苗组合物涉及抗肿瘤核酸疫苗，特别是涉及B细胞表面免疫球蛋白基因家族的复合核酸疫苗组合物，其制备方法及其在治疗淋巴系统肿瘤特别是非霍奇金B细胞淋巴瘤，B细胞白血病和各种自身免疫性疾病中的应用。
背景技术：
淋巴细胞克隆比例失衡功能异常是自身免疫病和肿瘤发病的重要病因。已有许多证据表明，某些肿瘤特别是某些血液系统肿瘤很难用传统的放射和/或化学方法治愈，而应用抗肿瘤免疫疗法则有可能通过主动免疫，激活机体的特异性免疫反应，在手术和放、化疗的基础上，进一步杀伤残存的瘤细胞最终达到治愈肿瘤的目的。例如，对于某些已经接受传统的抗肿瘤治疗后消退或缓解的实体瘤(如乳腺癌等)，抗肿瘤免疫治疗是一种清除微小残存病灶的有效方法。
然而，抗肿瘤治疗的在实践中遇到的一个主要障碍是目前尚未弄清大多数肿瘤的肿瘤相关抗原，从而难于选择和确定适当的免疫原。通常的免疫接种治疗存在反应低下，缺乏足够的特异性等问题。淋巴系统肿瘤，特别是非霍奇金淋巴瘤，与许多其他未知相关抗原的肿瘤不同，肿瘤细胞表面都有免疫球蛋白(Ig)或T细胞受体(TCR)分子的表达，这就为淋巴系统肿瘤的免疫治疗提供了条件。
免疫球蛋白分子的基本特征是具有识别特异性抗原的可变区(T细胞受体属于免疫球蛋白超家族，情况类似)。将一种免疫球蛋白可变区与其他免疫球蛋白可变区区分开的特征即为抗体的“个体型”。在抗原的分类和命名中，可变区个体型被称为“独特型”抗原。如同其他蛋白质抗原一样，免疫球蛋白可变区的独特型具有免疫源性，而且各自都能够引发抗独特型免疫反应(即产生针对个别独特型或一组独特型特异的细胞或体液免疫反应)。抗原性质是由各种肽的三维构象限定的，独特型抗原上的一些氨基酸链(短肽)组成的抗原决定簇或者称为T细胞配体(epitope)，决定了独特型的抗原性质。
免疫球蛋白的可变区分别由重链(VH)和轻链(VL)基因片段以及它们各自的多变区(D)和结合区(J)基因片段编码，可有多种不同的组合，从而在免疫球蛋白可变区上产生不同的独特型。B淋巴细胞表面免疫球蛋白各自都是不同的。淋巴系统的肿瘤来源于淋巴细胞，和淋巴细胞一样表面有免疫球蛋白。免疫球蛋白可变区构成的所谓独特型抗原，可作为淋巴瘤细胞的免疫原，引发机体的抗淋巴瘤细胞免疫反应，达到治疗目的。淋巴瘤特异性独特型抗原作为肿瘤特异性抗原可以刺激免疫系统，通过抗原呈递细胞(APC)将独特型抗原修饰的抗原决定簇短肽呈递给细胞毒T细胞，细胞毒T细胞就可以识别并且杀伤肿瘤细胞。
核酸(DNA)疫苗是免疫治疗的一项新进展，是直接将表达载体的裸DNA注射体内表达相应的抗原而产生免疫反应，独特型抗原的表达基因也可以制备成为核酸疫苗。然而，迄今已报道的几乎所有基于Ig/TCR可变区的核酸(DNA)疫苗都是按照患者个体化的原则设计并制备的，需要针对每一个特定的淋巴瘤个体制备其特定的免疫治疗剂，从而给这类疫苗的生产及其在治疗人类淋巴瘤中的应用带来极大的困难和限制。如果能够在分子水平上进一步明确区分独特型抗原的某些共有抗原决定簇，了解其在个体或人群间的不同组合和变化规律，就有可能设计并制备出适合于某个特定的Ig/TCR独特型群体的，或在某个群体的成员间存在交叉反应性的所谓“通用”疫苗，从而可在对淋巴瘤病人的独特型抗原结构进行大致分组的前提下，有针对性的选择并使用这样的“通用”疫苗。
本发明人在过去长期从事抗淋巴瘤免疫治疗实践的基础上，深入地分析并比较了淋巴瘤细胞表面Ig可变区独特型的抗原结构和抗原决定簇所在的位置。结果令人惊奇地发现，大部分独特型抗原决定簇并不是象通常所认为的位于免疫球蛋白可变区上的互补决定区(CDR)，而是位于免疫球蛋白重链可变区(IgHv)的框架区域内。在继后的研究中，发明人发现淋巴系统肿瘤和正常淋巴细胞的免疫球蛋白可变区的框架区有高度同源性。依据免疫球蛋白的同源性，可以把人类机体内的各种各样的B淋巴细胞群分成免疫球蛋白重链可变区IgHv1-IgHv7 7个基因家族(Lefranc，M.-P.et al.，IMGT，The international ImMunoGeneTicsdatabase，Nucleic Acids Research，29207-209，2001)，淋巴系统肿瘤的IgHv具有同一IgHv基因家族的共同特征。因此本申请人相信并且用实验证实，可以依据IgHv1-IgHv7基因片段的框架区DNA片段为基础，制备适用于某一特定人群的IgHv基因家族特异性核酸疫苗，用以诱发机体的免疫反应，抑制或者杀灭肿瘤性淋巴细胞或者特定某一淋巴细胞家族，治疗淋巴系统肿瘤或者自身免疫病。
发明目的本发明的一个目的是提供一种用于治疗治疗淋巴系统肿瘤或者自身免疫病的核酸(DNA)疫苗组合物，特征在于，所说的疫苗基本上是由携带免疫球蛋白重链可变区(IgHv)基因片段的重组表达载体，以及免疫学上可接受的赋形剂和佐剂组成的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的免疫球蛋白重链可变区基因片段包括编码免疫球蛋白可变区IgHv1-IgHv7的7个基因家族的特定基因片段。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的免疫球蛋白重链可变区基因片段编码属于同一基因家族的B淋巴细胞表面独特型上共有的抗原决定簇。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的免疫球蛋白重链可变区基因片段主要位于免疫球蛋白重链可变区的框架区编码基因内。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的免疫球蛋白重链可变区基因片段是与细胞生长因子或淋巴因子基因序列融合的。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的细胞生长因子是粒细胞-巨噬细胞生长因子，并且所说的淋巴因子是白介素-2。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的B淋巴细胞表面独特型共有抗原决定簇基因序列与细胞生长因子或淋巴因子基因序列之间可以有一个接头序列。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的免疫球蛋白重链可变区基因片段与细胞生长因子或淋巴因子基因融合后表达的蛋白具有如下SEQ ID NO1-SEQID NO14所示的氨基酸序列(以单字母表示)，其中字母X代表任意一个氨基酸，圆点..代表可插入的无关的氨基酸，其中与GM-CSF基因重组后表达形成的融合蛋白的序列包括SEQ ID NO1-7，与IL-2基因重组后形成的融合蛋白序列包括SEQ ID NO8-14。
发明的另一个目的是提供如上限定的疫苗组合物在治疗B淋巴细胞肿瘤和自身免疫病中的应用，其中所说自身免疫疾病包括但不只限于系统性红斑狼疮、自身免疫性血小板减少性紫癜及多发性硬化症等。
附图简要说明

图1显示携带IgHv1(FR)基因片段的重组质粒的酶切鉴定。其中泳道M是分子量标记物；泳道1是IgHv1(FR)/pcDNA3.0；泳道2是IgHv1(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0；泳道3是IgHv1(FR)-IL-2/pcDNA3.0；泳道4是pcDNA3.0。
图2显示携带IgHv3(FR)基因片段的重组质粒的酶切鉴定。其中泳道M是分子量标记物；泳道1是IgHv3(FR)/pcDNA3.0；泳道2是IgHv3(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0；泳道3是IgHv3(FR)-IL-2/pcDNA3.0；泳道4是pcDNA3.0。
图3显示接受本发明的DNA疫苗后不同时间内，被免疫小鼠血清中抗Namalwa细胞抗体的滴度变化。
图4显示接受本发明的DNA疫苗后不同时间内，被免疫小鼠血清中抗正常IgHv3基因家族淋巴细胞抗体的滴度变化。
发明的详细描述淋巴细胞克隆比例失衡和功能异常是肿瘤和自身免疫病发病的重要原因。例如Borgato等人的研究(参见Borgato L，Puccetti A.and Beri R.et al.，J.Rheumatol.29(9)1914，2002)表明，系统性红斑狼疮(SLE)和多发性硬化症等自身免疫病病人常常出现T和B细胞的免疫平衡失调，导致寡克隆T细胞增殖；肿瘤的恶性细胞因逃逸免疫监视和抑制，而出现单克隆恶性细胞增殖。因此，如果能够确定免疫网络中各种淋巴细胞之间的相互关系，利用细胞毒T细胞(CTL)调节和控制淋巴细胞克隆的异常增殖，便有可能为自身免疫病和B细胞恶性肿瘤的治疗提供一条新的途径。为此，我们需要首先要正确识别正常和异常的多种淋巴细胞克隆，并证实某一个CTL克隆对另外的淋巴细胞克隆的调节作用。了解机体如何调节和控制特异性免疫应答反应，Jerne曾提出免疫反应的独特型调节假说，认为当某抗原物质刺激特异性B或T淋巴细胞发生增殖反应后，同时也诱导了独特型和抗独特型免疫网络应答，激活T细胞和B细胞相互之间一系列级联反应，以抑制被活化的淋巴细胞克隆的过度增殖，并保持机体整个免疫系统平衡(Jerne，n.k.，Ann.Immunol.(Paris)125c，373-89，1974；Perelson，A.S.Immune Network Theory.Immunol.Rev.，110，5-36，1989)。
我们在有关淋巴细胞相互作用的研究中发现，淋巴细胞的不同克隆有可能通过表面受体的特异性抗原肽彼此识别，并有可能借助特异性CTL抑制具有不同T细胞表位的B淋巴细胞克隆的增殖，正常机体内存在一个可识别B细胞表面独特型抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)群体(张野坪、朱平和石永进等，TCRβ抗原决定簇DNA疫苗诱导抗淋巴瘤免疫反应的分子机理，中华血液学杂志，9233，2002；林宁晶、朱平和张野坪，用基因组DNA制备独特型抗淋巴瘤核酸疫苗的实验研究，中国实验血液学杂志，2；234，2000)。现已明确，B淋巴细胞表面的免疫球蛋白(Ig)的独特型分子标记也是B细胞淋巴瘤的肿瘤特异性抗原，而独特型则是由独特位(idiotope)组成的。这些独特位分子上的抗原决定簇(T细胞表位)可以作为CTL免疫反应的靶位，抑制该恶性B淋巴细胞克隆的过度增殖。一般认为，独特位位于Ig的互补决定区(CDR区)内(Brown，Blood，11807a，2002)，因此通常将抗淋巴瘤免疫治疗的靶位确定在CDR区。由于CDR区是不同淋巴细胞所特有的，所以须为每例淋巴瘤患者制备个体化的独特型疫苗。
然而，我们的研究结果表明，Ig/TCR可变区抗原决定簇并不都在CDR区内(林宁晶、朱平和张野坪，用基因组DNA制备独特型抗淋巴瘤核酸疫苗的实验研究，中国实验血液学杂志2；234，2002)。我们将免疫球蛋白的可变区片段人为切割成含有不同抗原决定簇的片段，然后借助不同的实验方法分析它们诱发抗淋巴瘤免疫反应的能力。结果发现，切除CDR区的片段同样也可以诱发抗淋巴瘤的体液和细胞免疫反应。另一方面，我们进一步组合不同正常人来源的胚系IgHv基因并以肌肉注射途径输入小鼠体内，结果显示，如果这些胚系基因与淋巴瘤具有相同的框架区，即使它们的CDR区不同，也同样能够诱发抗淋巴瘤免疫反应(ZhuPing，Lin Ningjing and Zhang Xin，Blood，2002(sup.)2273；林宁晶，朱平，张新等，中华医学杂志；82(11)766-770。2002)。
以上结果提示，免疫球蛋白的框架区(FR)在淋巴细胞相互作用的抗独特型免疫网络中可能起着重要的作用。据此，我们比较并分析了数百例淋巴系统肿瘤的IgHv基因的序列特征(朱平，急性淋巴细胞白血病恶性克隆的免疫球蛋白基因特征分析，中华医学杂志，910，2001；刘英朱平胡亚美。急性B淋巴细胞白血病免疫球蛋白重链可变区基因的分子特征中华血液学杂志，258，2004)，并与正常IgHv1-HV77个基因家族的56种标准序列(Lefranc，MP，IMGT，Theinternational ImMunoGeneTics database.Nucleic Acids Research，29207-209，2001)进行了比较。然后利用人类白细胞抗原(HLA)结合肽计算机分析系统(美国NIH BIMAS和德国SYFPEITHI)，分析并预测IgHv基因编码的抗原性。结果在B细胞IgHv不同基因家族的编码基因上找到12个高亲和力的抗原九肽序列，其中11个序列分别定位于七个免疫球蛋白家族(IgHv1-HV7)的框架区内。在此基础上，我们体外合成了这些框架区共有的九肽序列，并用这些短肽与作为于抗原肽指示细胞的T2细胞共孵育。结果显示，这些九肽可显著地提高T2细胞表面MHC分子的表达水平，从而证实这些九肽是B细胞IgHv特定基因家族表面Ig分子上的重要的抗原决定簇(T细胞表位)。
同时，为了确定正常淋巴细胞群中是否有识别这些抗原九肽的淋巴细胞，我们用荧光HLA/九肽四聚体方法检测，发现正常人外周血中存在少量对所说的九肽特异的CTL细胞(CD8+T细胞)。用该九肽3次刺激培养的正常人淋巴细胞3周后，肽特异性CTL细胞数量可增加至其淋巴细胞总数的80％左右(刘英 朱平 胡亚美。免疫球蛋白重链框架区的抗原九肽诱导特异性细胞毒T细胞增殖中华医学杂志，84(2)；97；2004)。这些研究结果进一步提示，机体内很可能天然存在可与表达特定IgHv框架区抗原肽(九肽)的B细胞克隆相互作用的CTL细胞。既然根据基因序列特征可以将B淋巴细胞克隆分为七个家族，便有可能制备相应的IgHv家族特异性表达载体并以其作为核酸疫苗，用核酸疫苗诱发抗淋巴细胞反应的策略来控制有某一病理性标志的B细胞克隆的增殖，用于临床治疗淋巴系统肿瘤的微小残留病灶或者用于抑制各种自身免疫性疾病增殖的B细胞。
我们从自行制备的脐带血免疫球蛋白基因文库810个IgHv/Bluescript克隆中得到一系列长度差异较大的基因片段，测序后利用生物信息资源分析预测其重链可变区的T细胞表位，从中选择一些包含了绝大多数T细胞表位的IgHv基因，并分别将以框架区(FR)为主的IgHv(FR)基因片段及IgHv(FR)与GM-CSF或IL-2基因连接后形成的融合基因克隆到真核表达载体pcDNA3.0中。最终获得编码融合蛋白的14个序列，序列如下与GM-CSF形成融合蛋白的序列包括
Anti-B1CSFQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTXXX..XXWVRQAPGQRLEWMGXXXXXXXXX.XYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGGGSGGGGSAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMIASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE(SEQ ID NO1)Anti-B2CSFQVTLKESGPXLVKPTETLTLTCTVSGFSLSXXXXXVSWIRQPPGKALEWLAXXXXXXX..XYSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARGGGGSGGGGSAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMIASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE(SEQ ID NO2)Anti-B3CSFVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFXXXX..XXXXRQAPGKGLEWVSXISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAXGGGGSGGGGSAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMIASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE(SEQ ID NO3)Anti-B4CSFQVQLQESGPGLVKPPGTLSLTCAVSGGSISSXXX..WSWVRQPPGKGLEWIGXIYXSGST.XYNPSLKSRVTISVDXSKNQFSLKLSSVTAADTAVYXCARGGGGSGGGGSAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMIASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE(SEQ ID NO4)Anti-B5CSFEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYW..IGWVRQMPGKGLEWMGIIXXXXXXT..XYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGGGSGGGGSAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLL
NLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMIASHYKQHCPPTPETSCATQI ITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE(SEQ ID NO5)Anti-B6CSFQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAA..WNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYN.DYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGGGGSGGGGSAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMIASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE(SEQ ID NO6)Anti-B7CSFQVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTXXX..MNWVRQAPGQGLEWMGWXNTXTGNP..TYAQGFT.GRFVFSLDTSVSTAYLQIXSLKAEDTAVYYCARGGGGSGGGGSAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMIASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE(SEQ ID NO7)与IL-2形成融合蛋白序列Anti-B1IL-2QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTXXX..XXWVRQAPGQRLEWMGXXXXXXXXX.XYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO8)Anti-B2IL-2QVTLKESGPXLVKPTETLTLTCTVSGFSLSXXXXXVSWIRQPPGKALEWLAXXXXXXX..XYSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARGGGGSGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO9)Anti-B3IL-2
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以上结构式中，字母X代表任何氨基酸，并且圆点..是可以被插入的任何氨基酸。
我们以脂质体转染法将所得到的重组表达载体转染COS细胞，并以酶联免疫吸附法(ELISA)确定GM-CSF或IL-2的表达。然后，使用间接免疫荧光法和细胞因子分泌检测法检测这些重组DNA在小鼠体内诱发的抗同一基因家族的淋巴瘤之免疫反应的能力，以证实本发明的家族特异性核酸疫苗的实际可应用性。
结果证实，应用免疫球蛋白重链不同可变区中的框架区基因制备基因家族特异性抗淋巴瘤核酸疫苗，并且接种动物后，可在动物体内诱发明显的特异性抗淋巴瘤免疫反应。免疫后产生的抗体可识别同一基因家族淋巴瘤细胞表面的天然抗原决定簇，但不识别其他基因家族淋巴瘤细胞表面的天然抗原决定簇，也不识别K562细胞，从而提示所产生的抗体是基因家族特异性的，即这些重组DNA分子可在动物体内诱导产生抗属于同一基因家族的淋巴瘤细胞的特异性抗体。另外，由于作为本发明特异性抗淋巴瘤核酸疫苗的重组表达载体中还融合了细胞因子的基因序列，所以可利用这些细胞因子的提供的辅助活性，刺激被免疫动物的细胞因子γ干扰素(IFN-γ)的分泌，进一步增强其所诱发的特异性免疫反应(刘辉、朱平、林宁晶，家族特异性抗淋巴瘤核酸疫苗的构建及表达的研究，中华医学杂志2004，8448-53)。
如上所述，我们发现大部分独特型抗原决定簇并不是象以前人们通常所认为的那样，位于免疫球蛋白可变区上的互补决定区(CDR)，而是位于免疫球蛋白重链可变区(IgHv)的框架区域内。在继后的研究中，我们发现淋巴系统肿瘤和正常淋巴细胞的免疫球蛋白可变区的框架区高度同源。依据免疫球蛋白基因的同源性，可以把人类机体内的各种各样的淋巴细胞群分成IgHv1-IgHv77个基因家族。淋巴系统肿瘤的IgHv具有同一IgHv基因家族的共同特征。因此以IgHv1-IgHv7基因片段的框架区DNA片段为基础，制备适用于某一特定人群的IgHv家族特异性核酸疫苗，用以诱发机体的免疫反应，抑制或者杀灭肿瘤性淋巴细胞或者特定某一淋巴细胞家族，治疗淋巴系统肿瘤或者自身免疫病。
本发明的一个目的是提供如上限定的疫苗组合物在治疗B淋巴细胞肿瘤和自身免疫病中的应用。其中所说自身免疫疾病包括但不只限于系统性红斑狼疮、自身免疫性血小板减少性紫癜及多发性硬化症等。因此，本发明的目的是提供一种用于治疗B细胞淋巴瘤的DNA复合疫苗，特征在于所说的疫苗是由携带B淋巴细胞表面独特型共有抗原决定簇基因序列的重组表达载体，以及免疫学上可接受的赋形剂和佐剂组成的。
可按照本领域技术人员熟知的DNA操作技术(例如参见Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbour，1989)完成重组载体的构建、蛋白质产物的表达、表达产物的纯化和鉴定等操作。例如，可从已建立的基因文库中筛选并分离免疫球蛋白重链可变区基因片段，同时从已知携带细胞因子(hGM-CSF或hIL-2)基因的起始质粒中分割出所需的核苷酸片段，然后将它们连接到用同样酶切的真核表达载体(如质粒pcDNA3.0)上，得到可用作免疫原的重组DNA。然后单独用所说的重组DNA或与适当的辅助制剂一起接种动物(如小鼠)，以在被接种动物体内诱发特异性抗淋巴瘤免疫反应。
基于上述实验室基础研究，我们成功地制备了一系列分别针对B淋巴细胞表面抗原的7个IgHv基因家族的特异性核酸序列并将其克隆到适当的表达载体中，以其作为DNA疫苗，用于诱发抗淋巴细胞反应，以控制具有特定病理性标志的B细胞亚群的增殖，临床治疗淋巴系统肿瘤的微小残留病或者各种自身免疫性疾病。为了提高疫苗的免疫效果，我们同时还在所说的重组载体中加入某种细胞因子[例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或白介素2(IL-2)]的编码序列，制成所谓的复合DNA疫苗。使用我们的复合DNA疫苗转染COS细胞的体外实验和接种模型动物(小鼠)的体内实验都清楚地表明，本发明的复合DNA疫苗可有效刺激细胞因子(GM-CSF或IL-2)的产生与分泌，并可强有力地诱发模型动物的特异性细胞和体液抗淋巴瘤免疫反应。
可按照制药工业中已知的方法(如参见Remington’s PharmaceuticalScience.15th ed.，Mack Publishing Company，1980)，将如上制备并纯化的重组核酸制剂与一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂或稀释剂按适当的比例混合，并按已知方法除菌后制成本发明的复合疫苗组合物。
根据给药途径的不同，可将本发明的疫苗组合物配制成适于肌肉内、静脉内、体腔内(如胸腔、腹腔、脊髓腔、颅内及关节囊内)、组织内、皮内或皮下给药的可注射的溶液剂或乳剂或悬浮剂。
为了制备适于胃肠道外途径给药的可注射溶液剂，例如可以使用无菌蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠或葡萄糖溶液，或低浓度(如1-100mM)磷酸盐缓冲盐水(PBS)、以及含有乙醇、多元醇(如乙二醇、丙二醇及液态聚乙二醇等)的溶剂或分散介质作为载体或稀释剂。在任何情况下，所说的可注射制剂均应是无菌和可流动并适于通过注射器注射给药的。另外，在生产、运输和储存条件下，所说的制剂还必须是稳定的，并能够对抗细菌和真菌等微生物的污染。必要时，可加入抗氧化剂(如抗坏血酸)、抗生素(如青霉素和链霉素或其他抗微生物剂)及防腐剂(如苯甲酸钠、三氯叔丁醇、度米酚、山梨酸等)，以及稳定剂和用于维持分散剂中所需颗粒大小的表面活性剂。
根据使用目的的不同，本发明的药物组合物除含有作为基本活性成分的重组核酸外，还可含有一种或多种具有相同、相似或不同生物学活性，并对基本活性成分表现有辅助或协同作用，但彼此又互不拮抗的天然或合成的其他药物成份或其混合物。
根据本发明，所说的其他活性成分包括但不只限于天然来源的抗肿瘤剂(如氮芥、环磷酰胺、氨甲喋呤、长春新碱、紫杉醇、柔红霉素等)，以及免疫调节剂(干扰素、胸腺肽、肿瘤坏死因子等)。
本发明的再一个目的涉及所说的疫苗组合物在预防或治疗淋巴瘤或自身免疫病中的应用。其中所说的血管生成相关疾病包括但不只限于系统性红斑狼疮、自身免疫性血小板减少性紫癜及多发性硬化症。
下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。在不违背本发明的精神和原则前提下，对发明个别技术步骤进行的任何改动和改变都将落入本发明待批权利要求范围内。
实施例实施例1免疫球蛋白重链可变区基因片段的克隆和生物信息学资源分析本实施例以IgHv3和IgHv1为例，说明正常脐带血免疫球蛋白重链可变区基因片段的克隆和生物信息学资源分析。
按常规方法从本实验室建立的人脐带血免疫球蛋白基因文库(包括810个IgHv3/pBluescript克隆)中克隆得到长度均400-500bp的IgHv基因片段。然后通过生物信息资源分析从中选择6个长度差异较大的IgHv3/pBluescript阳性克隆并测序，结果显示所得到的片段属于IgHv3基因家族，并且主要差异位于CDR3区。同样方式利用计算机分析系统也从含有IgHv1家族6个片段的IgHv1/pcDNA3克隆(林宁晶，朱平，张野坪等，组合免疫球蛋白基因疫苗诱发小鼠抗淋巴瘤体液免疫反应，中华医学杂志，82766-770，2002)中选择所需的最适片段。
通过计算机翻译软件(参见http//www.expasy.ch/tools/DNA.html)将所得到的IgHv1、IgHv3重链可变区的核酸序列翻译为氨基酸序列。与已知的胚系重链可变区(参见http/www.ncbi.nil.gov/Ig blast)进行序列比较后，区分出4个框架区(FR)和3个超变区(CDR)。然后利用计算机评分系统(RammenseHG，Bachmann J.SYFPEITHYdatabase for MHC ligands and peptide motifs.Immunogenetics，50213-219，1999)预测所获得的IgHv1、IgHv3编码序列上的位点限制性T细胞表位(积21分以上即定为T细胞表位)，确定T细胞表位分布并选择有代表性的序列用于表达载体的构建。
实施例2分别携带IgHv1或IgHv3基因序列的真核表达载体的构建本实施例举例描述分别携带IgHv1或IgHv3基因序列的真核表达载体的构建。
(1)我们从人类脐带血获得的一些IgHv1、IgHv3序列，根据T细胞表位预测结果，从中各选取1个在多种HLA型别均具有较高积分T细胞表位的序列为模板，经PCR扩增后分别得到IgHv1(SEQID NO15)和IgHv3框架区基因(SEQ IDNO16)片段。
IgHv1ATGGACTGGACCTGGAGCATCCTTTTCTTGGTGGCAGCAGCAACAGGTGCCCACTCCCAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAGCTATGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAATGGTAACACAAAATATTCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGATAG(SEQ ID NO15)IgHv3ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTATAAAAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTG
GTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGACTTAG(SEQ ID NO16)其中所使用的上游引物分别在IgHv1、IgHv3的引导区内，并且在其5’端分别包括了Kozak序列和Knp I酶切位点；下游引物则分别设计在其FR3区，并且5’端设计了能适应3种不同读框的终止密码子及EcoRI的酶切位点。引物序列如下VH1上游引物5’-TATAGGTACCACCATGGACTGGACCTGGAG-3’(SEQ ID NO17)VH1下游引物5′-TTAAGAATTCCTATCTCGCACAGTAATACACAGCCGT-3′(SEQ ID NO18)VH3上游引物5′-TATAGGTACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTG-3’(SEQ ID NO19)VH3下游引物5′-TTAAGAATTCCTAAGTCGCACAGTAATACACGGCCGT-3′(SEQ ID NO20)在含有1.5mmol/L MgCl2、1×PCR缓冲液(Promega)、0.1mmol/L 4×dNTP(Promega)、0.25μmol/L引物、50-100ng模板DNA和1.25IU TaqDNA聚合酶的25μl反应体系中按下述条件进行聚合酶链反应(PCR)94℃预加热5分钟，然后接30个热循环(94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒)，最后72℃延伸7分钟。
以10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)方法分离并鉴定PCR产物。用苯酚/氯仿/异丙醇(50∶49∶1)提取并用1/10体积3M NaAc(Ph5.2)和2.5体积无水乙醇沉淀DNA(-20℃，1小时)，得到的所需片段(SEQ ID NO15和SEQ ID NO16)长度分别为大约350bp左右。
(2)经KpnI和EcoRI酶切鉴定后，在T4DNA连接酶(1.5单位)存在下使所得到的DNA片段按正确方向分别克隆到真核表达载体pcDNA3.0中。然后用此连接反应混合物(5μl)转化感受态大肠杆菌DH5α细胞。在含有Xgel和IPTG的琼脂板上37℃保温过夜后，挑选白色菌落并重新悬浮于2ml含氨苄青霉素的LB培养基中，再次37℃培养过夜。然后使用已知的细胞裂解液经高速离心和乙醇沉淀小量制备质粒DNA。经进一步酶切(KpnI和EcoRI双酶切以及EcoRI单酶切)鉴定筛选阳性克隆并对筛选的阳性克隆进行测序分析，证实所得到的重组质粒载体(pcDNA3.0/IgHv1和pcDNA3.0/IgHv3)中分别携带了IgHv1和IgHv3框架区基因片段，并且其中不含有属于CDR3区的核甘酸序列。
实施例3分别携带IgHv1或IgHv3与细胞因子之融合基因的真核表达载体的构建本实施例举例描述分别携带IgHv1或IgHv3与细胞因子之融合基因的真核达载体的构建。
(1)使用特殊设计的寡核甘酸引物，以常规PCR方法分别扩增得到带有3’端接头序列的IgHv1和IgHv3框架区基因片段。其中所使用的上游引物分别相同于上述的VH1和VH3上游引物(SEQ ID NO17和SEQ ID NO19)，下游引物则分别设计在其各自的FR3区域内，并且5’侧还包括了作为接头的有10个高亲水性和低电荷氨基酸的编码序列。其中，下游引物的核甘酸序列如下VH1(FR)下游引物5’-AGAGCCTCCGCCACCGGATCCGCCACCTCTCGCACAGTAATACACAGCCGT-3’(SEQ ID NO21)VH3(FR)下游引物5’-AGAGCCTCCGCCACCGGATCCGCCACCAGTCGCACAGTAATACACGGCCGT-3’(SEQ ID NO22)使用实施例2(1)中所述的同样反应条件，经PCR扩增并纯化得到带有3’端接头序列的IgHv1和IgHv3框架区基因片段(约380bp)。
(2)另一方面，可以使用携带巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或白介素2(IL-2)的任何已知质粒载体例如重组质粒p-hGM-CSF和pc-hIL-2(由北京大学医学部免疫教研室惠赠)作为模板，同样按上述反应条件分别扩增得到3’端带有10个氨基酸接头的hGM-CSF基因(418bp)和hIL-2基因(429bp)。其中所使用的上游引物(分别为SEQ ID NO23和SEQ ID NO25)的5’端包括有作为接头的10个连续的高亲水性和低电荷氨基酸(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly Gly-Gly-Gly-Ser)的编码序列；下游引物(分别为SEQ ID NO24和SEQ ID NO26)的5’端则包括可适应3种不同读框的终止密码子及EcoRI酶切位点。为此目的设计的上游和下游引物的序列如下hGM-CSF扩增上游引物5’-GGTGGCGGTGGATCCGGTGGCGGAGGCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCA-3’(SEQID NO23)hGM-CSF扩增下游引物5’-TTAAGAATTCCTAACTCCTGGACTGGCTCCCAGC-3’(SEQ ID NO24)hIL-2扩增上游引物5’-GGTGGCGGTGGATCCGGTGGCGGGAGGCTCTGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAG-3’(SEQ ID NO25)hIL-2扩增下游引物5’-TTAAGAATTCCTAAGTTAGTGTTGAGATGC-3’(SEQ ID NO26)(3)取本实施例步骤(1)中得到的IgHv1和IgHv3框架区基因片段各1μl，分别与本实施例步骤(2)中得到的hGM-CSF和hIL-2基因片段各1μl充分混匀，在DNA聚合酶(Klenow片段)存在下，按下述条件使用PCR仪进行退火连接反应，以实现携带接头序列的两片段间的连接94℃变性10分钟，然后按每30秒温度下降10℃的速率逐渐退火，直至温度下降到30℃。然后向退火产物中加入Klenow片段1单位、0.1mmol/L 4×dNTP、1×PCR缓冲液和去离子水(20μl)，并于室温下保温30分钟。然后于75℃水浴中保温10分钟以将聚合酶灭活。
按前述PCR反应条件，以如此得到的连接反应产物(1μl)作为模板进行PCR扩增反应。其中分别使用VH1上游引物(SEQ ID NO17)和VH3上游引物(SEQ IDNO19)[参见步骤(1)]作为上游引物，并使用hGM-CSF扩增下游引物(SEQ IDNO24)和hIL-2扩增下游引物(SEQ ID NO26)[参见步骤(2)]作为下游引物。分离并纯化扩增产物后，分别得到长度约800bp的IgHv1(FR)-GM-CSF(SEQ ID NO27)、IgHv3(FR)-GM-CSF(SEQ ID NO28)、IgHv1(FR)-IL-2、IgHv3(FR)-IL-2融合基因片段(图1和图2)。
(4)上述PCR反应产物经用核酸内切酶KpnI和EcoRI酶切鉴定后，定向连接到表达载体pcDNA3.0中。然后用此连接反应混合物(5μl)转化感受态大肠杆菌DH5α细胞。在含有Xgel和IPTG的琼脂板上37℃保温过夜后，挑选白色菌落并重新悬浮于2ml含氨苄青霉素的LB培养基中，并于37℃下培养过夜。然后使用质粒提取试剂盒培养增殖的宿主菌中大量制备质粒DNA。经进一步酶切(KpnI和EcoRI双酶切以及EcoRI单酶切)鉴定筛选阳性克隆并对筛选的阳性克隆进行测序分析，证实所得到的重组质粒载体(-GM-CSF/pcDNA3.0、IgHv(FR)-IL-pcDNA3.0/2)中分别携带有IgHv1(FR)-GM-CSF或IgHv1(FR)-IL-2，或者IgHv3(FR)-GM-CSF或IgHv3-IL-2融合基因(参见图1和图2)。
IgHv1-GM-CSF融合基因序列。
ATGGACTGGACCTGGAGCATCCTTTTCTTGGTGGCAGCAGCAACAGGTGCCCACTCCCAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAGCTATGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAATGGTAACACAAAATATTCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGTGGCGGTGGATCCGGTGGCGGAGGCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATAGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGT(SEQ ID NO27)IgHvV3-GM-CSF融合基因序列ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTATAAAAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGACTGGTGGCGGTGGATCCGGTGGCGGAGGCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATAGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGT(SEQ I D NO28)实施例4IgHv(FR)与细胞因子的融合基因的体外表达借助质脂体介导的瞬时转染法，用如上得到的重组表达载体瞬时转染COS1细胞，以观察所说的融合基因的体外表达。按照每孔2×105个细胞的密度将COS1细胞接种于6孔培养板的各孔中(2ml/孔)，于二氧化碳孵箱中37℃培养24小时后每孔中贴壁细胞数达到约60％。然后按每孔2μg向各孔中分别加入如上制备的重组体DNAIgHv1(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0、IgHv1(FR)-IL-2/pcDNA3.0、IgHv3(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0和IgHv3(FR)-IL-2/pcDNA3.0(每种样品各设两复孔)，并以空pcDNA3.0质粒作为阴性对照。其中转染试剂对DNA的比例为3∶1(V/W)。转染24小时后，收集培养物上清，并以酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清中细胞因子GM-CSF或IL-2的表达水平。结果如下列表1所示。
表1 DNA复合疫苗转染COS细胞后GM-CSF或IL-2的体外表达
由表1所示的结果可以看出，重组质粒DNA IgHv1(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0和IgHv3(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0的hGM-CSF表达水平高于阴性对照组(pcDNA3.0空质粒)达200倍以上；重组质粒DNA IgHv1(FR)-IL-2/pcDNA3.0和IgHv3(FR)-IL-2/pcDNA3.0的hIL-2表达水平高于阴性对照组(pcDNA3.0空质粒)达200倍以上。这些结果表明，本发明的重组质粒DNA IgHv1(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0和IgHv3(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0可在体外以高水平表达并分泌hGM-CSF；而IgHv1(FR)-IL-2/pcDNA3.0和IgHv3(FR)-IL-2/pcDNA3.0则可于体外的高水平表达hIL-2。
实施例5重组DNA复合疫苗体内诱导特异性抗体生成活性将20只6-8周令的健康Balb/c小鼠随机分为五组，每组4只。预先在动物双侧股四头肌内注射0.25％盐酸布比卡因(每侧50μl)，3天后分组并于第0、2、4周经小鼠背部皮下接种(100μg/次)下列重组DNA第1组为IgHv3(FR)/pcDNA3.0；第2组为IgHv3(FR)-IL-2/pcDNA3.0；第3组为pcDNA3.0空质粒载体；第4组为DNA IgHv1(FR)/pcDNA3.0；第5组为IgHv1(FR)-IL-2/pcDNA3.0。分别于第0、2、4、6和8周经眼眶内采血并分离血清进行抗体检测。
为了以常规的间接免疫荧光法进行抗体特异性检测，将属于IgHv1家族的淋巴瘤Namalwa细胞、属于IgHv3家族的正常B淋巴瘤细胞、属于非IgHv1和非IgHv3家族的淋巴瘤Daudi细胞以及红白血病K562细胞，按5×105个/ml的细胞密度涂片并用丙酮固定。以得自五组动物的抗血清(经适当稀释后)作为第一抗体，并以FITC标记的兔抗小鼠免疫球蛋白作为第二抗体。在细胞涂片上加样后，于荧光显微镜下读片。实验中所使用的阴性对照组包括(1)以免疫前小鼠血清(40倍稀释)为第一抗体；(2)用磷酸盐缓冲盐水(PBS)代替第一和第二抗体；(3)仅以PBS溶液代替第一抗体。观察结果如下列表2以及图3和图4所示。
表2 五组小鼠接受重组DNA复合疫苗后不同时间的血清抗体滴度
注“-”表示阴性由表2和图3可以看出，IgHv1(FR)-IL-2/pcDNA3.0组动物于免疫接种疫苗后2周即检测到抗IgHv1家族Namalwa淋巴瘤细胞抗体，IgHv1(FR)组仅在免疫后第4周检测到相应抗体，而IgHv3(FR)/pcDNA3.0、IgHv3(FR)-IL-2/pcDNA3.0和pcDNA3.0组则在观察期间内始终没有出现阳性抗体反应。
另外，由表2和图4可以看出，IgHv3(FR)-IL-2/pcDNA3.0免疫组动物于接种疫苗后2周即检测到抗IgHv3家族正常淋巴系细胞的抗体，IgHv3(FR)组仅在免疫后第4周检测到相应抗体，而IgHv1(FR)/pcDNA3.0、IgHv1(FR)-IL-2/pcDNA3.0和pcDNA3.0组则在观察期间内始终没有出现阳性抗体反应。
将第一组[IgHv3(FR)组]和第2组[IgHv3(FR)-IL-2组]，以及第4组[IgHv1(FR)组]和第5组[IgHv1(FR)-IL-2组]小鼠免疫后6周的血清抗体滴度取负对数进行t检验，结果显示，第2组抗体滴度明显高于第一组，而第5组明显高于第4组(P＜0.05)。
上述这些结果清楚地显示，接受本发明DNA复合疫苗动物的抗血清可识别同一基因家族淋巴瘤细胞表面的天然抗原决定簇，而不识别其他基因家族淋巴瘤细胞表面的天然抗原决定簇，所以可以认定被免疫动物体内产生的抗体是基因家族特异性的。
实施例6重组DNA复合疫苗体内诱导T淋巴细胞介导的细胞毒活性将20只6-8周令的健康Balb/c小鼠随机分为五组，每组4只。四组动物分别经肌肉(股四头肌)内接种(100μg/只)下列质粒DNA第1组为IgHv3(FR)/pcDNA3.0；第2组为IgHv3(FR)-IL-2/pcDNA3.0；第3组为pcDNA3.0空质粒载体；第4组为DNA IgHv1(FR)/pcDNA3.0；第5组为IgHv1(FR)-IL-2/pcDNA3.0。免疫接种后第10周处死动物，分离脾脏并制备脾淋巴细胞悬液。然后以已知的TMM法检测被免疫动物的效应细胞对靶细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性(百分杀伤率)。其中。其中以丝裂霉素C处理的CEM细胞作为刺激细胞。将刺激细胞与小鼠脾淋巴细胞按1∶100的细胞数比例充分混合并于5％CO2孵箱中37℃保温5天后，收获未贴壁生长的细胞作为效应细胞(E)，并以CEM细胞作为靶细胞(T)，其中E/T比例为20∶1。将混合的细胞于37℃下保温12小时后，对细胞进行噻唑蓝染色并测定细胞培养物的光密度(OD值)。然后按下列公式计算效应细胞对靶细胞的百分杀伤率
(％)杀伤率＝[1-(OD)E+T-ODE]×100％结果可见，五组动物脾淋巴细胞介导的细胞毒活性(％)分别为48.12％(IgHv3(FR)/pcDNA3.0)、52.66％(IgHv3(FR)-IL-2/pcDNA3.0)、36.67％(pcDNA3.0空质粒载体)、45.54(DNA IgHv1(FR)/pcDNA3.0)、55.03％(IgHv1(FR)-IL-2/pcDNA3.0)。这些结果表明，与只接种空载体质粒的动物相比，接受本发明的重组DNA复合疫苗的实验组(第1和2，以及4和5组)动物均表现有明显提高了的体外细胞毒活性。而且，与只携带IgHv(FR)基因序列的重组体相比，携带IgHv(FR)与细胞因子(IL-2)之融合基因的重组DNA可诱导更强的T淋巴细胞细胞毒活性。
序列表<110>北京大学第一医院<120>抗淋巴瘤基因家族特异性复合核酸疫苗<140>
<141>
<160>21<210>1<211>238<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>IgHv1(FR)与hGM-CSF的融合蛋白质序列。
<400>1QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT XXX..XXWVR QAPGQRLEWM GXXXXXXXXX .XYSQKFQGRVTITRDTSAS TAYMELSSLR SEDTAVYYCA RGGGGSGGGG SAPARSPSPS TQPWEHVNAI QEARRLLNLSRDTAAEMNET VEVISEMFDL QEPTCLQTRL ELYKQGLRGS LTKLKGPLTM IASHYKQHCP PTPETSCATQIITFESFKEN LKDFLLVIPF DCWEPVQE<210>2<211>237<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>IgHv2(FR)与hGM-CSF的融合蛋白质序列。
<400>2QVTLKESGPX LVKPTETLTL TCTVSGFSLS XXXXXVSWIR QPPGKALEWL AXXXXXXX.. XYSTSLKSRLTISKDTSKSQ VVLTMTNMDP VDTATYYCAR GGGGSGGGGS APARSPSPST QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR
DTAAEMNETV EVISEMFDLQ EPTCLQTRLE LYKQGLRGSL TKLKGPLTMI ASHYKQHCPP TPETSCATQIITFESFKENL KDFLLVIPFD CWEPVQE<210>3<211>236<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>IgHv3(FR)与hGM-CSF的融合蛋白质序列。
<400>3VQLVESGGGL VKPGGSLRLS CAASGFTFXX XX..XXXXRQ APGKGLEWVS XISSSSSYIY YADSVKGRFTISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCAXG GGGSGGGGSA PARSPSPSTQ PWEHVNAIQE ARRLLNLSRDTAAEMNETVE VISEMFDLQE PTCLQTRLEL YKQGLRGSLT KLKGPLTMIA SHYKQHCPPT PETSCATQIITFESFKENLK DFLLVIPFDC WEPVQE<210>4<211>238<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>IgHv4(FR)与hGM-CSF的融合蛋白质序列。
<400>4QVQLQESGPG LVKPPGTLSL TCAVSGGSIS SXXX..WSWV RQPPGKGLEW IGXIYXSGST .XYNPSLKSRVTISVDXSKN QFSLKLSSVT AADTAVYXCA RGGGGSGGGG SAPARSPSPS TQPWEHVNAI QEARRLLNLSRDTAAEMNET VEVISEMFDL QEPTCLQTRL ELYKQGLRGS LTKLKGPLTM IASHYKQHCP PTPETSCATQIITFESFKEN LKDFLLVIPF DCWEPVQE<210>5<211>239<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>IgHv5(FR)与hGM-CSF的融合蛋白质序列。
<400>5EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT SYW..IGWVR QMPGKGLEWM GIIXXXXXXT ..XYSPSFQGQVTISADKSI STAYLQWSSL KASDTAMYYC ARGGGGSGGG GSAPARSPSP STQPWEHVNA IQEARRLLNLSRDTAAEMNE TVEVISEMFD LQEPTCLQTR LELYKQGLRG SLTKLKGPLT MIASHYKQHC PPTPETSCATQIITFESFKE NLKDFLLVIP FDCWEPVQE<210>6<211>261<212>氨基酸<213>人工序列
<220>
<223>IgHv6(FR)与hGM-CSF的融合蛋白质序列。
<400>6QVQLQQSGPG LVKPSQTLSL TCAISGDSVS SNSAA..WNW IRQSPSRGLE WLGRTYYRSK WYN.DYAVSVKSRITINPDT SKNQFSLQLN SVTPEDTAVY YCARGGGGSG GGGSAPARSP SPSTQPWEHV NAIQEARRLLNLSRDTAAEM NETVEVISEM FDLQEPTCLQ TRLELYKQGL RGSLTKLKGP LTMIASHYKQ HCPPTPETSCATQIITFESF KENLKDFLLV IPFDCWEPVQ E<210>7<211>240<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>IgHv7(FR)与hGM-CSF的融合蛋白质序列。
<400>7QVQLVQSGSE LKKPGASVKV SCKASGYTFT XXX..MNWVR QAPGQGLEWM GWXNTXTGNP ..TYAQGFT.
GRFVFSLDTS VSTAYLQIXS LKAEDTAVYY CARGGGGSGG GGSAPARSPS PSTQPWEHVN AIQEARRLLNLSRDTAAEMN ETVEVISEMF DLQEPTCLQT RLELYKQGLR GSLTKLKGPL TMIASHYKQH CPPTPETSCATQIITFESFK ENLKDFLLVI PFDCWEPVQE<210>8<211>244<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>IgHv1(FR)与hIL-2的融合蛋白质序列。
<400>8QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT XXX..XXWVR QAPGQRLEWM GXXXXXXXXX .XYSQKFQGRVTITRDTSAS TAYMELSSLR SEDTAVYYCA RGGGGSGGGG SAPTSSSTKK TQLQLEHLLL DLQMILNGINNYKNPKLTRM LTFKFYMPKK ATELKHLQCL EEELKPLEEV LNLAQSKNFH LRPRDLISNI NVIVLELKGSETTFMCEYAD ETATIVEFLN RWITFCQSII STLT<210>9<211>243<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IgHv2(FR)与hIL-2的融合蛋白质序列。
<400>9QVTLKESGPX LVKPTETLTL TCTVSGFSLS XXXXXVSWIR QPPGKALEWL AXXXXXXX.. XYSTSLKSRLTISKDTSKSQ VVLTMTNMDP VDTATYYCAR GGGGSGGGGS APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINNYKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE
TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT<210>10<211>243<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IgHv3(FR)与hIL-2的融合蛋白质序列。
<400>10XVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFX XXX..XXXXR QAPGKGLEWV SXISSSSSYI YYADSVKGRFTISRDNAKNS LYLQMNSLRA EDTAVYYCAX GGGGSGGGGS APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINNYKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSETTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT<210>11<211>244<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>IgHv4(FR)与hIL-2的融合蛋白质序列。
<400>11QVQLQESGPG LVKPPGTLSL TCAVSGGSIS SXXX..WSWV RQPPGKGLEW IGXIYXSGST .XYNPSLKSRVTISVDXSKN QFSLKLSSVT AADTAVYXCA RGGGGSGGGG SAPTSSSTKK TQLQLEHLLL DLQMILNGINNYKNPKLTRM LTFKFYMPKK ATELKHLQCL EEELKPLEEV LNLAQSKNFH LRPRDLISNI NVIVLELKGSETTFMCEYAD ETATIVEFLN RWITFCQSII STLT<210>12<211>245<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>IgHv5(FR)与hIL-2的融合蛋白质序列。
<400>12EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT SYW..IGWVR QMPGKGLEWM GIIXXXXXXT ..XYSPSFQGQVTISADKSI STAYLQWSSL KASDTAMYYC ARGGGGSGGG GSAPTSSSTK KTQLQLEHLL LDLQMILNGINNYKNPKLTR MLTFKFYMPK KATELKHLQC LEEELKPLEE VLNLAQSKNF HLRPRDLISN INVIVLELKGSETTFMCEYA DETATIVEFL NRWITFCQSI ISTLT<210>13<211>247<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IgHv6(FR)与hIL-2的融合蛋白质序列。
<400>13QVQLQQSGPG LVKPSQTLSL TCAISGDSVS SNSAA..WNW IRQSPSRGLE WLGRTYYRSK WYN.DYAVSVKSRITINPDT SKNQFSLQLN SVTPEDTAVY YCARGGGGSG GGGSAPTSSS TKKTQLQLEH LLLDLQMILNGINNYKNPKL TRMLTFKFYM PKKATELKHL QCLEEELKPL EEVLNLAQSK NFHLRPRDLI SNINVIVLELKGSETTFMCE YADETATIVE FLNRWITFCQ SIISTLT<210>14<211>246<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>IgHv7(FR)与hIL-2的融合蛋白质序列。
<400>14QVQLVQSGSE LKKPGASVKV SCKASGYTFT XXX..MNWVR QAPGQGLEWM GWXNTXTGNP ..TYAQGFT.
GRFVFSLDTS VSTAYLQIXS LKAEDTAVYY CARGGGGSGG GGSAPTSSST KKTQLQLEHL LLDLQMILNGINNYKNPKLT RMLTFKFYMP KKATELKHLQ CLEEELKPLE EVLNLAQSKN FHLRPRDLIS NINVIVLELKGSETTFMCEY ADETATIVEF LNRWITFCQS IISTLT<210>15<211>354<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IgHv1重链可变区的核酸序列。
<400>15ATGGACTGGA CCTGGAGCAT CCTTTTCTTG GTGGCAGCAG CAACAGGTGC CCACTCCCAG GTTCAGCTGGTGCAGTCTGG AGCTGAGGTG AAGAAGCCTG GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGTTACACCTTTACCAGC TATGGTATCA GCTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT GGGATGGATCAGCGCTTACA ATGGTAACAC AAAATATTCA CAGAAGTTCC AGGGCAGAGT CACCATTACC AGGGACACATCCGCGAGCAC AGCCTACATG GAGCTGAGCA GCCTGAGATC TGAAGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG ATAG<210>16<211>354<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IgHv3重链可变区的核酸序列。
<400>16ATGGAGTTTG GGCTGAGCTG GGTTTTCCTT GTTGCTATTA TAAAAGGTGT CCAGTGTCAG GTGCAGCTGGTGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTCAAGCCTG GAGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCACCTTCAGTGAC TACTACATGA GCTGGATCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT TTCATACATTAGTAGTAGTG GTAGTACCAT ATACTACGCA GACTCTGTGA AGGGCCGATT CACCATCTCC AGGGACAACGCCAAGAACTC ACTGTATCTG CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAC TTAG
<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计的PCR扩增的引物。
<400>17TATAGGTACC ACCATGGACT GGACCTGGAG<210>18<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计的PCR扩增的引物。
<400>18TTAAGAATTC CTATCTCGCA CAGTAATACA CAGCCGT<210>19<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计的PCR扩增的引物。
<400>19TATAGGTACC ACCATGGAGT TTGGGCTGAG CTG<210>20<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计的PCR扩增的引物。
<400>20TTAAGAATTC CTAAGTCGCA CAGTAATACA CGGCCGT<210>21<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计的PCR扩增的引物。
<400>21AGAGCCTCCG CCACCGGATC CGCCACCTCT CGCACAGTAA TACACAGCCG T
<210>22<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计的PCR扩增的引物。
<400>22AGAGCCTCCG CCACCGGATC CGCCACCAGT CGCACAGTAA TACACGGCCG T<210>23<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计的PCR扩增的引物。
<400>23GGTGGCGGTG GATCCGGTGG CGGAGGCTCT GCACCCGCCC GCTCGCCCAG CCCCA<210>24<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计的PCR扩增的引物。
<400>24TTAAGAATTC CTAACTCCTG GACTGGCTCC CAGC<210>25<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计的PCR扩增的引物。
<400>25GGTGGCGGTG GATCCGGTGG CGGGAGGCTC TGCACCTACT TCAAGTTCTA CAAAG<210>26<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计的PCR扩增的引物。
<400>26
TTAAGAATTC CTAAGTTAGT GTTGAGATGC<210>27<211>613<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IgHv1-GM-CSF融合基因序列。
<400>27ATGGACTGGA CCTGGAGCAT CCTTTTCTTG GTGGCAGCAG CAACAGGTGC CCACTCCCAG GTTCAGCTGGTGCAGTCTGG AGCTGAGGTG AAGAAGCCTG GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGTTACACCTTTACCAGC TATGGTATCA GCTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT GGGATGGATCAGCGCTTACA ATGGTAACAC AAAATATTCA CAGAAGTTCC AGGGCAGAGT CACCATTACC AGGGACACATCCGCGAGCAC AGCCTACATG GAGCTGAGCA GCCTGAGATC TGAAGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAGAGGTGGCGGT GGATCCGGTG GCGGAGGCTC TGCACCCGCC CGCTCGCCCA GCCCCAGCAC GCAGCCCTGGGAGCATGTGA ATGCCATCCA GGAGGCCCGG CGTCTCCTGA ACCTGAGTAG AGACACTGCT GCTGAGATGAATGAAACAGT AGAAGTCATC TCAGAAATGT TTGACCTCCA GGAGCCGACC TGCCTACAGA CCCGCCTGGAGCTGTACAAG CAGGGCCTGC GGGGCAGCCT CACCAAGCTC AAGGGCCCCT TGACCATGAT AGCCAGCCACTACAAGCAGC ACTGCCCTCC AACCCCGGAA ACTTCCTGTG CAACCCAGAT TATCACCTTT GAAAGTTTCAAAGAGAACCT GAAGGACTTT CTGCTTGTCA TCCCCTTTGA CTGCTGGGAG CCAGT CCAGGAGT<210>28<211>764<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IgHv3-hGM-CSF融合基因序列。
<400>28ATGGAGTTTG GGCTGAGCTG GGTTTTCCTT GTTGCTATTA TAAAAGGTGT CCAGTGTCAG GTGCAGCTGGTGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTCAAGCCTG GAGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCACCTTCAGTGAC TACTACATGA GCTGGATCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT TTCATACATTAGTAGTAGTG GTAGTACCAT ATACTACGCA GACTCTGTGA AGGGCCGATT CACCATCTCC AGGGACAACGCCAAGAACTC ACTGTATCTG CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGACTGGTGGCGGT GGATCCGGTG GCGGAGGCTC TGCACCCGCC CGCTCGCCCA GCCCCAGCAC GCAGCCCTGGGAGCATGTGA ATGCCATCCA GGAGGCCCGG CGTCTCCTGA ACCTGAGTAG AGACACTGCT GCTGAGATGAATGAAACAGT AGAAGTCATC TCAGAAATGT TTGACCTCCA GGAGCCGACC TGCCTACAGA CCCGCCTGGAGCTGTACAAG CAGGGCCTGC GGGGCAGCCT CACCAAGCTC AAGGGCCCCT TGACCATGAT AGCCAGCCACTACAAGCAGC ACTGCCCTCC AACCCCGGAA ACTTCCTGTG CAACCCAGAT TATCACCTTT GAAAGTTTCAAAGAGAACCT GAAGGACTTT CTGCTTGTCA TCCCCTTTGA CTGCTGGGAG CCAGTCCAGG AGT
权利要求
1.抗淋巴瘤基因家族特异性核酸疫苗组合物是用于治疗淋巴系统肿瘤或者自身免疫病的复合核酸(DNA)疫苗组合物，特征在于所说的疫苗基本上是由携带免疫球蛋白重链可变区基因家族特异性片段的重组表达载体，以及免疫学上可接受的赋形剂和佐剂组成的。
2.根据权利要求1的复合核酸疫苗组合物，其中所说的免疫球蛋白重链可变区基因家族特异性片段包括编码免疫球蛋白可变区IgHv1-IgHv7的7个基因家族特异性片段。并且它们分别编码有如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.14的序列。
3.根据权利要求1的复合核酸疫苗组合物，其中所说的免疫球蛋白重链可变区基因片段编码属于同一基因家族的B淋巴细胞表面独特型上共有抗原决定簇。
4.根据权利要求1的复合核酸疫苗组合物，其中所说的免疫球蛋白重链可变区基因家族特异性片段位于编码免疫球蛋白重链可变区的框架区的基因序列内。
5.根据权利要求1的复合核酸疫苗组合物，其中所说的免疫球蛋白重链可变区基因片段是与细胞生长因子或淋巴因子基因序列融合的。
6.根据权利要求1的复合核酸疫苗组合物，所说的细胞生长因子是粒细胞-巨噬细胞生长因子，并且所说的淋巴因子是白介素-2。
7.根据权利要求1的复合核酸疫苗组合物，其中所说的B淋巴细胞表面独特型共有抗原决定簇编码基因序列与细胞生长因子或淋巴因子基因序列之间可以有一个接头序列。
全文摘要
本发明抗淋巴瘤基因家族特异性核酸疫苗组合物涉及抗肿瘤核酸疫苗，特别是涉及B细胞表面免疫球蛋白基因家族的复合核酸疫苗组合物，其制备方法及其在治疗淋巴系统肿瘤特别是非霍奇金B细胞淋巴瘤，B细胞白血病和各种自身免疫性疾病中的应用。
文档编号A61P35/00GK1730100SQ200410070498
公开日2006年2月8日 申请日期2004年8月5日 优先权日2004年8月5日
发明者朱平 申请人:朱平