专利名称：控制拟南芥茎粗的特异性基因的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种控制拟南芥茎粗性状的基因。
新中国成立以来，小麦品种大体经历了5次更换。许多研究表明，品种更换的过程同时也是品种茎加粗的过程。尤其60年代以来，矮秆、半矮秆小麦品种的选育和利用，明显增强了品种的产量潜力。可以用各种物理或化学(烯效唑、甲基磺酸乙酯(EMS)、多效唑等)的方法处理植株，使植株茎粗。如适当浓度的烯效唑能促进发芽，使植株的茎变粗，增加生物量，提高可溶性糖、淀粉、叶绿素的含量，降低可溶性蛋白和游离氨基酸的含量。但是单纯依靠育种，速度比较慢。
近几年，开展了一些关于茎粗相关功能基因的研究。如苹果属显性茎粗主基因Dw的RAPD分子标记(张开春等，农业生物技术学报，1999年第7卷第2期Vol.7 No.2 1999)；半矮秆春小麦茎粗基因Rht1和Rht2的相关研究，小麦Rht8茎粗基因的遗传(向平，国外作物育种1996)等。从这些背景资料可以看出，植株茎粗相关功能基因在作物生产中的重要性显而易见，具有控制这一性状的功能基因在生产上的用途是广阔的。
本发明的技术方案如下拟南芥中没有内源的标签因子，T-DNA整合成为主要的插入诱变方法。拟南芥已经通过T-DNA标签得到了成千上万的突变体。经过TAIL-PCR(ThermalAsymmetric Interlaced PCR，Yaoguang Liu et al，1998，Plant Molecular BiologyReporter 16175-181，热不对称交错多聚酶链式反应)技术扩增并测定标签插入位点的两端序列，用Blast2.0软件将测定序列和拟南芥的全基因组序列比较，找出突变位点，种植突变体，通过表型分析以及各种不同的环境条件的筛选，在大量突变体当中筛选到了该突变体为控制拟南芥茎粗性状的基因。T-DNA插入了拟南芥第四染色体的第5502902碱基处，插入了基因AT4g31670的尾端。AT4g31670基因的cDNA序列见序列表1(SEQ ID No.1)，AT4g31670基因编码的蛋白质序列见序列表2(SEQ ID No.2)。
一、材料拟南芥生态型(Columbia)；质粒pSKI015(Weigel，D.，et al 2000)；各种常用抗生素；根癌土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)为GV3101。
二、方法1.植物生长和转化拟南芥在温室中22℃生长，每天光照16小时，黑暗8小时。含有pSKI015的农杆菌GV3101，先用PCR反应鉴定质粒中的四个CaMV35S增强子完整存在(Weigel，D.，et al 2000)。
我们采用的Ti质粒是pSKI015，质粒中的T-DNA区域含有BAR基因，赋予除草剂抗性。还含有在原核系统中用来筛选的Amp抗性基因，在T-DNA右边缘附近有串联的4个35S增强子，有可能在插入拟南芥基因组后增强侧翼或附近某个基因的表达，从而获得某种功能，做为插入基因失活的一个额外的补充。
转化拟南芥的方法主要采用农杆菌介导的转化方法。十多年前科学家发明了种子浸染转化法，后来采用农杆菌培养侵染植物茎尖成整株植物进行真空抽滤，这些方法都代替了以前组织培养和植物再生方法，缩短了组织培养的步骤。我们实验使用的转化方法是花浸法(flaral dip)，比真空抽滤更为简便，转化效率也不会降低，野生的拟南芥(Columbia)长到一定阶段，有一些未成熟的花苞，将已开的花剪掉，做为待转化植物。带有pSKI015的农杆菌经鉴定后28℃摇到稳定期(0.06≈2.0)离心后重新悬浮在浸染培养基中。浸染培养基中必不可少的提高转化效率的是蔗糖和Surfactant两种物质。将含有大量未开花苞的拟南芥倒置在农杆菌的浸染培养基的浸泡液中十五分钟，然后暗培养一定时间后继续开花，结籽，将种子收集，其中就有转基因株系。
2.转基因植物的筛选和PCR检测转化植物的子代用抗生素等标记筛选出来。我们使用的是除草剂PPT，采用一定浓度的PPT(100mg/ml)加入培养基中，使不含有T-DNA插入的种子不萌发或不生长，而含有T-DNA插入的种子因为含有完整的BAR基因而正常生长起来。在这些植物中，T-DNA插入一般为单倍体，是隐性突变，所以表型一般不易发现。
用CATB法提取植物叶片的总DNA，利用pSKI015载体上BAR基因的引物进行PCR检测5’引物5’-TCGACTCTAGCGAATTCCTC-3’，3’引物5’-ATAGGCGTCTCGCATATCTC-3’；并用拟南芥中COP1的引物同时进行PCR作为正对照5’引物5’-TGACTATGCTCTGTTTCAGCT-3’，3’引物5’-TTAGTAAACCAAGGAAACACCA-3’反应条件为94℃ 50s，60℃ 60s，72℃ 90s，35个循环，PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
3.T-DNA插入侧翼序列的扩增和测序我们采用TAIL-PCR方法，即热不对称性交错PCR(Thermal Asymmetry InterlacePCR)，TAIL-PCR包含三轮连续的半嵌套式插入序列特异引物和一个小的可退火在附近侧翼序列上的随机引物，很容易扩增出插入位点侧翼序列，这种方法不需要在PCR之前进行很多复杂的操作，而且产生高纯度的特异产物，可以直接用作杂交探针和测序模板，即具有高效、灵敏、简便、特异的优点。
将确定含有BAR基因的植株用TAIL-PCR扩增T-DNA插入侧翼序列(Liu，1995)，所用的三个特异引物是根据T-DNA的左边缘附近的序列设计的，分别为DL15’-GACAACATGTCGAGGCTCAGCAGG-3’；DL25’-TGGACGTGAATGTAGACACGTCGA-3’；DL35’-GCTTTCGCCTATAAATACGACGG-3’。
所用的随机简并引物有两个AD25’-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3’；AD2-25’-NGTGCA(G/C)(A/T)GTNT(A/T)GAA-3’。
大量扩增第三轮PCR产物，用低熔点琼脂糖将每条条带进行回收，加两倍体积的水在65℃温浴使胶块熔化，用酚、氯仿各抽提一遍。再用2-2.5倍体积乙醇和1/10体积醋酸钠(NaAC)沉淀。12,000转，离心20分钟后沉淀，用70％、100％乙醇各洗一遍，抽干。溶于水中，定量后可用来测序。
还可将第三轮PCR产物直接与pBS产生的T-vector用T4-DNA连接酶连接，筛选出有插入的阳性克隆。提质粒测序。
4.序列的比对和分析得到大量的插入位点侧翼序列，就需要进行序列分析，首先用BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)与数据库中的序列进行比对，到EMBL或Gene bank中比对出匹配的序列，从而确定T-DNA插入位点究竟在哪条染色体的什么部位，附近的开放读码框架ORF，已经翻译出蛋白质的可能功能，与已知蛋白的同源比较等等，由此得到我们寻找的控制拟南芥茎粗性状的基因AT4g31670突变的突变体。
5.表型分析种植突变体，同时种植野生型拟南芥为对照。如附
图1和附图2所示，图1为拟南芥突变体植株在开花期和结荚期的形态照片；图2为野生拟南芥在开花期和结荚期的形态照片。由图中可以看出，突变体植株在开花期和结荚期与野生型比较，表现出明显的茎杆变粗侧枝单边的表型特征。
受基因AT4g31670的功能启示，我们得到一种控制植株茎粗的方法，包括将AT4g31670基因在转基因植物中过量表达。
本发明采用农杆菌介导的方法，将农杆菌的T-DNA插入到拟南芥的基因组DNA当中，从而产生插入突变体。转化植物的种子在含有PPT(100mg/ml)的MS培养基上进行筛选。用CATB法提取植物叶片的总DNA，利用pSKI015载体上BAR基因的引物进行PCR。将确定含有BAR基因的植株用TAIL-PCR扩增T-DNA插入侧翼序列。大量扩增第三轮PCR产物用低熔点琼脂糖将每条条带进行回收。测序后进行BLAST的比对与分析，由此找到T-DNA的插入位点，发现该T-DNA的插入点恰好是在茎粗基因的DNA序列上，位于拟南芥第四染色体的长臂上。它的功能与植物细胞的发育、分化与程序性细胞死亡以及信号转导，细胞周期调控等均有着密切的关系。
序列表1(SEQ ID No.1)1 ATGCATGAGG TTGGTTTTCC GTTGGATCTC TCTGTCTTCA CTCGCCTTAT AGCGACTCTA61 TTTTTCCTCG CCGTTGGTGT TTTTTACTTT CTCAAAAACA CCGCCGCTAA GTACTTCGAC121 ATCGGAGCCG CCGCCGCCGG AGGTTTCGAC AGGGACTTCA TGGCGGTTGA TGCTGAGGAT181 TGCTCTGTCT GTGGGAATTT TTCCACCAAG AAATGCTCCC GCTGCAAATC CGTTCGATAC241 TGCTCAGCAG AGTGCCAAAG GTCAGATTGG AGTTCGGGTC ATCAAAGAAA CTGCAGGGAT301 TATGGGATTA CTACATTAAC ACCATCTGCA AAGAATGGCT TAAGGTTCAG AGCTTCTCCA361 TTCGGGGATA GTTCTGCGTC TAGTATTGCA CTGATTTCCG AACGGGGCCA AAACAAGAGT421 AGTCTCAAGC CAAGAGAAGT TCTTTTTCCA TATGAAGAAT TTGTTGAATA TTTTAACTGG481 GACAATCCAG AATTGGCTCC CTGTGGGCTC ATGAATTGTG GAAATAGTTG TTTCGCCAAT541 GTGATTCTAC AATGCCTTTC CTGGACACGT CCTCTTGTTG CATATCTGCT GGAGAAAGGC601 CACAAGAGAG AATGTATGCG CAACGATTGG TGCTTCCTCT GTGAATTTCA AACCCATGTT661 GAGAGAGCGA GTCAAAGTCG GTTCCCTTTT TCACCAATGA ACATTATTTC ACGGTTAACT721 AATATTGGTG GAACTCTTGG ATATGGAAGA CAGGAGGATG CTCATGAGTT CATGAGGTAT781 GCGATTGATA TGATGCAGTC TGTTTGCCTT GATGAATTCG GTGGAGAAAA AATAGTGCCT841 CCTCGTTCAC AAGAAACAAC ACTTATTCAG TATATATTTG GAGGTCTCCT TCAATCACAG901 GTTCAATGTA CTGTTTGCAA TCATGTTTCT GACCAATATG AAAATATGAT GGATCTAATC961 GTTGAGATGC ATGGGGATGC GGGGTCTTTG GAGGAATGTC TTGATCAATT TACAGCCGAA1021 GAGTGGCTTC ATGGAGATAA TATGTACAAA TGTGATAGGT GTAGTGACTA TGTAAAAGCA1081 TGTAAGCGTC TTACGATTCG ACGCGCTCCA AATATTCTTA CTATTGCCTT AAAAAGATAT1141 CAGGGAGGAA GATACGGAAA ATTGAACAAA AGAATAAGTT TTCCCGAGAC ATTGGATCTT1201 AATCCTTACA TGAGTGAAGG CGGAGATGGA TCAGATGTAT ATAAACTCTA TGCAGTGATT1261 GTCCATTTAG ATATGCTGAA TGCATCATTC TTCGGCCATT ACATATGCTA CATTAAGGAT1321 TTTTGCGGAA ACTGGTATAG AATAGATGAT TCCGAGATAG AAAGTGTTGA ATTAGAAGAT1381 GTCCTTTCTC AAAGAGCTTA TATGCTCCTC TACAGCAGGA TTCAAGCTCG GTCGTCATCT1441 TCATGTCTTA GATCAGAAGT TAAAGACGAG AAGAAAACAG ACACATTGGA CACAGAATCT1501 TGCGTAAAAG AGTTAGTTGA GAGTTCAATG GTAGGAGCTA TTGAAAGCAG AAGCAGCACC1561 CATGCGACCA TTGAAGACCC TGTATGCGAG CAATCACCAT CACCATCGCC ATCACCATCA1621 CCATCACCAT CGCCATCACC ATCACCATCA GTATTGGCCT CTGAATGTTG TAGTGAGGTT1681 GAAAGGATTG ATACATTGGA TTCCGAGTCC AACTCTTCGA TTGATGACTC TGCAACAGAT1741 CATCAAGAGG ATGTAGCAAA TGGGAACAAA GATCCAGAGG TAAAATATCA GGCTGCCGAT1801 TCTTGGTCAG ACCCTACAAC TTCAACTCCA TTGGTCTGTA CAAAATCCAA ACCTCCGGTG1861 AGAGATATGG ACACCAAGAT GATCGACGCT CAGTGA序列表2(SEQ ID No.2)MHEVGFPLDL SVFTRLIATL FFLAVGVFYF LKNTAAKYFD IGAAAAGGFD RDFMAVDAEDCSVCGNFSTK KCSRCKSVRY CSAECQRSDW SSGHQRNCRD YGITTLTPSA KNGLRFRASPFGDSSASSIA LISERGQNKS SLKPREVLFP YEEFVEYFNW DNPELAPCGL MNCGNSCFANVILQCLSWTR PLVAYLLEKG HKRECMRNDW CFLCEFQTHV ERASQSRFPF SPMNIISRLTNIGGTLGYGR QEDAHEFMRY AIDMMQSVCL DEFGGEKIVP PRSQETTLIQ YIFGGLLQSQVQCTVCNHVS DQYENMMDLI VEMHGDAGSL EECLDQFTAE EWLHGDNMYK CDRCSDYVKACKRLTIRRAP NILTIALKRY QGGRYGKLNK RISFPETLDL NPYMSEGGDG SDVYKLYAVIVHLDMLNASF FGHYICYIKD FCGNWYRIDD SEIESVELED VLSQRAYMLL YSRIQARSSSSCLRSEVKDE KKTDTLDTES CVKELVESSM VGAIESRSST HATIEDPVCE QSPSPSPSPSPSPSPSPSPS VLASECCSEV ERIDTLDSES NSSIDDSATD HQEDVANGNK DPEVKYQAADSWSDPTTSTP LVCTKSKPPV RDMDTKMIDA Q*
权利要求
1.一种多核苷酸，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一种蛋白质，具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所示的多核苷酸，其为控制拟南芥茎粗性状的基因。
4.一种控制植株茎粗的方法，包括将权利要求1所述的多核苷酸在转基因植物中过量表达。
全文摘要
本发明公开了一种控制拟南芥茎粗性状的特异性基因AT4g31670的cDNA序列;基因AT4g31670编码的蛋白质序列;控制植株茎粗的方法,包括将基因AT4g31670在转基因植株中过量表达。
文档编号C07K14/415GK1369502SQ0210015
公开日2002年9月18日 申请日期2002年1月16日 优先权日2002年1月16日
发明者瞿礼嘉, 康定明, 刘铁, 董一宇, 秦跟基, 申云平, 邓兴旺, 顾红雅, 陈章良 申请人:北京大学