一种小鼠组织中结核杆菌dna的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于DNA提取技术领域，尤其设及一种小鼠组织中结核杆菌DNA的提取方 法。
【背景技术】
[0002] 结核标准菌珠H37RV感染小鼠后，要得到小鼠体内（如肺组织）中结核杆菌的载 量，通过提取其模板DNA，用绝对定量方法得出组织中结核杆菌的拷贝数（copynumber)与 组织DNA拷贝数比值。因此，要得到上述结果，必须提取组织总DNA(含小鼠组织DNA和结 核杆菌DNA)。目前所知的方法有肺泡灌洗液提取和制作组织石腊切片用二甲苯、丙酬提取 法和试剂盒提取法。组织石腊切片用二甲苯、丙酬提取法操作繁琐，DNA的提取率较低；试 剂盒提取法：采用市场上购买得到的DNA提取试剂盒，能够进行组织溶解和细胞裂解后提 取DNA，虽然该方法操作简便，但是DNA的提取率较低。
【发明内容】
[0003] 针对现有技术的不足，本发明提供一种小鼠组织中结核杆菌DNA的提取方法。所 述提取方法DNA的提取率高、操作简便。
[0004] 本发明的技术方案如下：一种小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，包括W下 步骤：
[0005] 步骤（1)将小鼠肺组织匀浆离屯、后弃上清，加入GA缓冲液和蛋白酶K溶液后， 50~56°C水浴3~12h，进行组织溶解得到细胞悬液；
[000引步骤似细胞悬液中加入抑为8的TES缓冲液和5%的SDS溶液后，先置于溫水 浴中40min，再置于沸水浴60min，最后在冰上放置5min，得到混悬液；
[0007] 步骤（3)在混悬液中加入pH4. 8的醋酸钢溶液和0. 05mol/L的葡萄糖溶液，冰上 放置10~20min;然后加入苯酪/氯仿/异戊醇溶液提取，离屯、后取上层水相，上层水相 中加入氯仿/异戊醇溶液提取，离屯、后，取上层水相，加入乙醇，充分震荡后，一20°C沉淀 30min，离屯、得到沉淀物，沉淀物即为总DNA，总DNA包括小鼠DNA和结核杆菌DNA，总DNA进 行QPCR扩增得到小鼠肺组织中结核杆菌DNA的载量。
[0008] 步骤（1)所述GA缓冲液、蛋白酶K溶液来源于细菌基因组DNA提取试剂盒，蛋白 酶K溶液的浓度为2mg/ml，GA缓冲液用于悬浮细胞，并为蛋白酶K提供适合的反应体系。
[0009] TES缓冲液用于裂解细菌的细胞壁，释放DNA，其中含有Tris-HCl、邸TA、SDS和溶 菌酶，溶菌酶的浓度为20mg/mL;SDS是一种蛋白变性剂，破坏蛋白质的高级结构。
[0010] 步骤（2)所述溫水浴的溫度为36~37°C，溶菌酶在该溫度范围下活性最高，从而 裂解小鼠肺组织中结核杆菌细胞壁。
[0011] 步骤（2)沸水浴的目的有两个：第一，在裂解细胞的工作完成后，为了避免溶菌酶 继续反应，产生高溫使得溶菌酶失活。第二，沸水浴条件下，也可使溶菌酶裂解不充分的结 核杆菌细胞壁得到进一步破碎，从而进一步提高DNA得率。
[0012] 步骤（3)所述苯酪/氯仿/异戊醇溶液中苯酪、氯仿和异戊醇体积比为25 :24 :1， 所述氯仿/异戊醇溶液中氯仿和异戊醇的体积比为24 :1。
[0013] 作为优选，本发明提供的方法中所述离屯、条件为120(K)r/min，离屯、lOmin。
[0014] 作为优选，步骤（3)加入乙醇充分震荡后，在低溫条件下可使得DNA更容易沉淀， 且可保护DNA不被降解。
[0015] 提取总DNA后进行QPCR扩增，然后进行琼脂慷凝胶电泳。
[001引 QPCR扩增时本发明根据结核杆菌特有基因设计特有的引物序列；QPCR(实时巧光 定量PCR)扩增采用的引物序列如下：
[0017]前引物：5，_AGAAGGCGTACTCGACCTGA_ 3，
[0018]后引物：5，_CTGAACCGGATCGATGTGTA_ 3，。
[0019]QPCR扩增条件为：94°C预变性3s，94°C变性lmin，52°C退火30s，72°C末次延伸 30s，变性与退火循环35次。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有W下有益效果：本发明提供的提取方法提取率高、操 作简便，得到的DNA的纯度和浓度均较高。
【附图说明】
[0021] 图1为提取不同感染时间的小鼠肺组织DNA后进行QPCR扩增后的电泳图。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
[0023]GA缓冲液和蛋白酶K溶液来源于细菌基因组DNA提取试剂盒，该细菌基因组DNA 提取试剂盒购买于天根生化科技有限公司，目录号为DP302-02;PCR试剂盒购买于TaKaRa 公司；本发明根据结核杆菌特有基因X52471设计引物序列，由上海生工科技公司合成；所 述的小鼠为结核标准菌珠H37RV感染的km小鼠（雌）。
[0024] 实施例1
[002引小鼠肺组织（SOmg)
[0026] I匀浆，10000巧m，Imin
[0027] 弃上清，向沉淀中加入GA(组织溶解液）200y1和蛋白酶K溶液20y1
[002引 |56°(：水浴3.011，得到细胞悬液
[0029] 加TES(细胞裂解液PH为8,含溶菌酶浓度为20mg/ml) 200y1和
[0030] 5 % (W/V)SDS(沉淀剂）120y1
[0031]I36°C水浴 40min,沸水浴 60min，冰上放置 5min，
[00础得到混悬液
[0033]加 500y1PH4. 8 的NaAc(醋酸钢）和 100y1 0. 05mol/LG(葡萄糖）
[0034] I颠倒混匀，冰上放置15min分装成两管
[003引每管加入600y1苯酪/氯仿/异戊醇（25 :24:1)
[0036]I颠倒混匀，12000;rpm，IOmin
[0037] 取上层水相至新的离屯、管
[0038] i
[0039] 加入等体积的氯仿/异戊醇（24 :1)
[0040]I 12000巧m，IOmim
[0041] 取上层水相至另一离屯、管
[0042] i
[0043] 加入Iml无水乙醇充分震荡，一20°C沉淀30min
[0044]I 12000;rpm，IOmin
[004引 倒去上清惊干3~5min,得到总DNA，加入50yITE溶解DNA，将总DNA进行QPCR 扩增，然后进行凝胶电泳。
[004引实施例2
[0047] 小鼠肺组织（SOmg)
[0048]I 匀浆，10000巧m，Imin
[0