专利名称：从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离间充质干细胞的方法，尤其是从脂肪组织中分离间充质干细 胞的方法。
背景技术：
自从2001年发现脂肪来源干细胞以来，由于其具有数量巨大，获得方式相对简单 的特点，所以在临床应用上有极大的优势和广阔的前景。脂肪干细胞的研究是目前干细胞 研究以及干细胞治疗的一个热点，相关的临床治疗和临床试验正在进行当中。研究人员不 仅证明了其具有分化成各种中胚层细胞(包括脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞以及骨骼肌 细胞)的能力，而且经过较为复杂诱导过程还能够被诱导成为胰岛细胞、神经细胞、肝细胞 等其它胚层的细胞。随着研究的不断深入，其在临床上的应用价值越来越受到人们的关注。随着研究人员对脂肪干细胞应用于临床的探索不断进行，各种关于其分离以及体 外培养的方法被报道出来。但是对于脂肪干细胞分离的具体方法以及一些细节并没有一个 公认的严格的规范。作为一种将要应用于临床细胞治疗的细胞产品，应当具有如下特点(1)组织获得简单。(2)分离方法尽量简单，尽量少的添加外源物质，并且能够获得足量细胞。(3)操作过程可控性强，具有很高的可重复性。(4)对细胞本身的损伤达到最小。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种利用小量的脂肪组织获得大量的状态良 好、保持很好的多向分化能力的从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法。本发明的技术路线如下(1)脂肪组织的获得、储存与运输20-500ml脂肪组织由专业的医院或者美容院 通过肿胀法吸脂手术获得/利用其他手术获得的脂肪组织废弃物10-200g ；取得的脂肪组 织放入生物运输袋/灭菌试剂瓶(无菌条件下)，可以在4-20°C (最好在4°C )储存48小 时(最好在4小时之内处理)，运输过程中维持在4°C环境下。(2)初步去除红细胞脂肪抽取物静止放置待分层后，小心移除下层液体；用 D-Hanks液洗涤多次至洗出液清亮。手术获得的脂肪组织，首先尽量剪碎成约Imm3大小组织块，然后用D-Hanks液洗 涤多次至洗出液清亮。(3)消化脂肪抽取物加入以D-Hanks液配制的一型胶原酶至终浓度 0. 01-2g/100ml，37°C下 20-400 转 /min 震荡消化 15-120 分钟。(4)脂肪干细胞的获得将消化后产物在4°C、离心力450g条件下离心5min;脂肪 干细胞培养基重悬，以100 μ m孔径滤膜过滤去除杂质最终获得脂肪干细胞。
(5)再次去除红细胞，利用反复洗涤，以及红细胞裂解的方式再次去除红细胞。(6)脂肪干细胞计数、活性检测和培养取100 μ 1分离的细胞以细胞计数板进行 细胞计数；同时取出100 μ 1细胞通过苔盼蓝染色的方法进行活细胞计数。按照两个计数的 结果按照3*104/cm2的密度接种于T-75培养瓶中，37°C、CO2浓度5%、湿度100%条件下进
行培养。本发明的有益效果是能够利用小量的脂肪组织获得大量的状态良好、保持很好 的多向分化能力的脂肪干细胞，并且操作方法简单易行、可重复性强。
图1是采用本发明的方法得到的脂肪干细胞。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明本发明的从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法，包括如下步骤(1)脂肪组织的获得脂肪组织为专业的医院或者美容院通过肿胀法吸脂手术获 得的废弃物，在无菌条件下，4-20°C储存小于48小时；(2)初步去除红细胞脂肪抽取物静止放置待分层后，小心移除下层液体，用 D-Hanks液洗涤多次至洗出液清亮；(3)消化脂肪抽取物加入以D-Hanks液配制的一型胶原酶至0. 01_2g/100ml， 37°CT 20-400 转 /min 震荡消化 15-120 分钟；(4)脂肪干细胞的获得将消化后产物在4°C、离心力450g条件下离心5min，脂肪 干细胞培养基重悬，以100 μ m孔径滤膜过滤去除杂质最终获得脂肪干细胞；(5)再次去除红细胞，利用反复洗涤和红细胞裂解的方式再次去除红细胞；(6)脂肪干细胞计数、活性检测和培养取100 μ 1分离的细胞以细胞计数板进行 细胞计数；同时取出100 μ 1细胞通过苔盼蓝染色的方法进行活细胞计数，根据两个计数的 结果按照3*104/cm2的密度接种于T-75培养瓶中，37°C、CO2浓度5%、湿度100%条件下进 行培养。步骤(1)中，将取得的脂肪组织放入生物运输袋或灭菌试剂瓶储存。步骤(1)中，在无菌条件下，4°C储存小于4小时，运输过程中维持在4°C环境下。一种从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法，包括如下步骤(1)脂肪组织的获得脂肪组织为手术中获得的脂肪组织废弃物，在无菌条件下， 4-20°C储存小于48小时；(2)初步去除红细胞手术获得的脂肪组织，首先尽量剪碎成约Imm3大小组织块， 然后用D-Hanks液洗涤多次至洗出液清亮；(3)消化脂肪抽取物加入以D-Hanks液配制的一型胶原酶至0. 01_2g/100ml， 37°CT 20-400 转 /min 震荡消化 15-120 分钟；(4)脂肪干细胞的获得将消化后产物在4°C、离心力450g条件下离心5min，脂肪 干细胞培养基重悬，以100 μ m孔径滤膜过滤去除杂质最终获得脂肪干细胞；(5)再次去除红细胞，利用反复洗涤和红细胞裂解的方式再次去除红细胞；
(6)脂肪干细胞计数、活性检测和培养取100 μ 1分离的细胞以细胞计数板进行 细胞计数；同时取出100 μ 1细胞通过苔盼蓝染色的方法进行活细胞计数，按照两个计数的 结果按照3*104/cm2的密度接种于T-75培养瓶中，37°C、CO2浓度5%、100%湿度条件下进
行培养。步骤(1)中，将取得的脂肪组织放入生物运输袋或灭菌试剂瓶储存。步骤(1)中，在无菌条件下，4°C储存小于4小时，运输过程中维持在4°C环境下。实施例1从医院获得一份膨胀抽脂的产物共180ml，使用生物运输袋在抽脂后4°C、2小时 之内运送到实验室，在无菌状态下进行处理1.以37°C温育的D-Hanks液反复清洗至清洗液无色，保证红细胞清洗干净。2.加入以D-Hanks液配制的一型胶原酶至终浓度0. lg/100ml，37°C下100转/min 震荡消化1小时3.将消化后产物在4°C、450g条件下离心5min ；IOml脂肪干细胞培养基重悬，以 100 μ m孔径滤膜过滤去除杂质最终获得脂肪干细胞。4.将脂肪干细胞悬浮液和红细胞裂解液以1 1混合孵育2分钟，4°C、离心力 450g条件下离心5min，利用脂肪干细胞培养基重悬脂肪干细胞。5.取100 μ 1分离的细胞以细胞计数板进行细胞计数；同时取出100 μ 1细胞通过 苔盼蓝染色的方法进行活细胞计数结果显示一共得到大约1. 2*107个细胞，细胞的活率在 95%以上。6.将细胞按照3*104/cm2的密度接种于T-75培养瓶中，37°C、CO2浓度5%、湿度 100%条件下进行培养。培养2天后显微镜下观察，细胞状态良好，如图1。7.分离获得脂肪干细胞经诱导分化检测证实，可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、成 肌细胞、成软骨细胞，具有多向分化潜能。实施例2脂肪组织为手术中获得的脂肪组织废弃物180g，使用灭菌试剂瓶，在无菌条件下， 4°C、2小时之内运送到实验室，在无菌状态下进行处理1.首先尽量剪碎成约Imm3大小组织块，以37°C温育的D-Hanks液反复清洗至清 洗液无色，保证红细胞清洗干净。2.加入以D-Hanks液配制的一型胶原酶至终浓度0. 2g/100ml，37°C下100转/min 震荡消化1小时3.将消化后产物在4°C、450g条件下离心5min ；IOml脂肪干细胞培养基重悬，以 100 μ m孔径滤膜过滤去除杂质最终获得脂肪干细胞。4.将脂肪干细胞悬浮液和红细胞裂解液以1 1混合孵育2分钟，4°C、离心力 450g条件下离心5min，利用脂肪干细胞培养基重悬脂肪干细胞。5.取100 μ 1分离的细胞以细胞计数板进行细胞计数；同时取出100 μ 1细胞通过 苔盼蓝染色的方法进行活细胞计数结果显示一共得到大约1. 2*107个细胞，细胞的活率在 95%以上。6.将细胞按照3*104/cm2的密度接种于T-75培养瓶中，37°C、CO2浓度5%、湿度 100%条件下进行培养。培养2天后显微镜下观察，细胞状态良好，如图1。
7.分离获得脂肪干细胞经诱导分化检测证实，可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、成 肌细胞、成软骨细胞，具有多向分化潜能。综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可 以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发 明的范围之内。
权利要求
一种从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)脂肪组织的获得脂肪组织为专业的医院或者美容院通过肿胀法吸脂手术获得的废弃物，在无菌条件下，4 20℃储存小于48小时；(2)初步去除红细胞脂肪抽取物静止放置待分层后，小心移除下层液体，用D Hanks液洗涤多次至洗出液清亮；(3)消化脂肪抽取物加入以D Hanks液配制的一型胶原酶至0.01 2g/100ml，37℃下20 400转/min震荡消化15 120分钟；(4)脂肪干细胞的获得将消化后产物在4℃、离心力450g条件下离心5min，脂肪干细胞培养基重悬，以100μm孔径滤膜过滤去除杂质最终获得脂肪干细胞；(5)再次去除红细胞，利用反复洗涤和红细胞裂解的方式再次去除红细胞；(6)脂肪干细胞计数、活性检测和培养取100μl分离的细胞以细胞计数板进行细胞计数；同时取出100μl细胞通过苔盼蓝染色的方法进行活细胞计数，根据两个计数的结果按照3*104/cm2的密度接种于T 75培养瓶中，37℃、CO2浓度5％、湿度100％条件下进行培养。
2.根据权利要求1所述的从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤 (1)中，将取得的脂肪组织放入生物运输袋或灭菌试剂瓶储存。
3.根据权利要求1所述的从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤 (1)中，在无菌条件下，4°C储存小于4小时，运输过程中维持在4°C环境下。
4.一种从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)脂肪组织的获得脂肪组织为手术中获得的脂肪组织废弃物，在无菌条件下， 4-20°C储存小于48小时；(2)初步去除红细胞手术获得的脂肪组织，首先尽量剪碎成约Imm3大小组织块，然后 用D-Hanks液洗涤多次至洗出液清亮；(3)消化脂肪抽取物加入以D-Hanks液配制的一型胶原酶至0.01_2g/100ml，37°C下 20-400转/min震荡消化15-120分钟；(4)脂肪干细胞的获得将消化后产物在4°C、离心力450g条件下离心5min，脂肪干细 胞培养基重悬，以100 μ m孔径滤膜过滤去除杂质最终获得脂肪干细胞；(5)再次去除红细胞，利用反复洗涤和红细胞裂解的方式再次去除红细胞；(6)脂肪干细胞计数、活性检测和培养取100μ 1分离的细胞以细胞计数板进行细胞 计数；同时取出100 μ 1细胞通过苔盼蓝染色的方法进行活细胞计数，按照两个计数的结果 按照3*104/cm2的密度接种于T-75培养瓶中，37°C、CO2浓度5%、100%湿度条件下进行培 养。
5.根据权利要求4所述的从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤 (1)中，将取得的脂肪组织放入生物运输袋或灭菌试剂瓶储存。
6.根据权利要求4所述的从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤 (1)中，在无菌条件下，4°C储存小于4小时，运输过程中维持在4°C环境下。
全文摘要
本发明公开了一种从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法，将脂肪组织放入生物运输袋/灭菌试剂瓶，无菌条件下，经过初步去除红细胞、消化脂肪抽取物、脂肪干细胞的获得、再次去除红细胞和脂肪干细胞计数、活性检测和培养，得到间充质干细胞。本发明能够利用小量的脂肪组织获得大量的状态良好、保持很好的多向分化能力的脂肪干细胞，并且操作方法简单易行、可重复性强。
文档编号C12N5/0775GK101984049SQ20101058053
公开日2011年3月9日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者陈晓波, 韩洪起, 黄家学 申请人:协和干细胞基因工程有限公司