专利名称：一种尼罗罗非鱼性别差异性分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种尼罗罗非鱼性别差异性分子标记及其应用，尤其是一种筛选尼罗 罗非鱼雄鱼的分子标记，属于基因工程技术领域。
背景技术：
罗非鱼(Tilapia)原产于非洲，因形似鲫鱼故又称非洲鲫鱼，隶属于鲈形目、鲈形 亚目、丽鱼科Cichlidae、罗非鱼属Tilapia(亦称丽鲷科，丽鲷属)。经统计，该属有700多 种(林振亮，黄江康.广东省罗非鱼产业发展分析.广东科技.2004，7:25-27)。由于生长 迅速、繁殖力强、食性杂，同时具有抗病性、适应力强等特点，现已成为世界主要淡水养殖鱼 类，在我国南方大部分地区和北方某些地区是重要的水产养殖对象，是仅次于鲤科(Carps) 和鲑科(Salmonids)的世界上第三大养殖品种(巩育军，郭先霞，李瑞伟.罗非鱼营养成分 研究进展.中国食物与营养.2009，11 :50-52)，也是联合国粮农组织(FAO)推广养殖的品 种。罗非鱼养殖效益高，国内外市场相对稳定，仅我国现在年产量就达70多万吨，是我国水 产养殖业中重要的出口创汇品种。商品鱼生产养殖过程中，最关键的问题是提高鱼的生长速度和规格。而在罗非鱼 中，普遍存在雄性比雌性个体生长快40% -50%的现象。另外，罗非鱼成熟早、繁殖周期短、 繁殖力强，雌雄混合养殖时易繁殖过剩，导致密度过大，个体过小，严重影响了成品鱼的质 量与产量，同时还将增加养殖成本(万松良，雷晓中，万珊.罗非鱼性别三系配套技术研究 进展.水产科学.2009，28 (9) :547-550)。但如果采用培育全雄鱼的方法就可以解决以上 问题，提高成品鱼质量和产量。目前培育全雄的方法主要分为非遗传手段和遗传手段两类。非遗传手段控制为了优化罗非鱼的养殖种群，现多采用在饲料中添加雄性激素 的方法处理罗非鱼鱼苗，诱导遗传上的雌鱼转换为功能上的雄鱼。激素诱导虽然可以产生 较高的雄性率，但是也明显存在局限性，可能造成雄性激素在鱼体内积蓄，并且污染水体环 境，因此人们一直担心此类产品对人体健康不利，很多国家已经禁止在饲料中添加激素类 物质。遗传手段控制我国现在主要推广养殖的是奥尼鱼，它是奥利亚罗非鱼的雄鱼 (ZZ)与尼罗罗非鱼的雌鱼(XX)杂交的后代(XZ)。由于这两种鱼不同的性别决定机制，XZ 后代的雄性率可达92-95%，能有效地控制繁殖力，再加上其杂种优势，使得这种鱼具有生 长速度快，适应性强，食性广，群体产量高、出肉率高、食味鲜美，而且池塘产仔少等诸多优 点ο奥尼杂交鱼的亲鱼是以雌性尼罗罗非鱼作母本、雄性奥利亚罗非鱼作父本，如果 雌雄鉴别不准确，则雄性比率必然不高。另外同种罗非鱼交配的产卵率、受精率和出苗率都 比杂交鱼高，即使混入极少量的奥利亚罗非鱼母本或尼罗罗非鱼父本，都会导致两种罗非 鱼的种内繁殖，严重影响子代雄性率。为了获得优质的奥尼罗非鱼苗种，就必须把好亲鱼选 择的雌雄筛选关。因此研究罗非鱼的性别决定机制，实现性别控制就成了解决罗非鱼商品 化养殖问题的当务之急。
研究表明尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼遗传性别决定类型分别为XX/XY型和ZW/ZZ 型。对不同遗传型的有丝分裂中期相染色体进行荧光染色实验，可以看出X与Y染色体、 Z与W染色体之间都存在形态差异，显示这两对染色体之间都存在基因或碱基序列上的差 异。但荧光染色法很难大规模地使用于育苗生产。分子标记方法简便易行，可在短时间内对大量样本进行分析。但到目前为止，罗非 鱼稳定的分子标记依然很缺乏，国内外尚没有报道用于区分罗非鱼性别的稳定分子标记， 更没有用于筛选雄鱼的分子标记，对罗非鱼的性别控制机制也了解甚少。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种尼罗罗非鱼性别差异性分子标记及其应用。尼罗罗非鱼性别差异性分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。上述尼罗罗非鱼性别差异性分子标记的PCR引物，正义引物序列如SEQ ID NO. 2 所示，反义引物如SEQ ID NO. 3所示。一种利用上述尼罗罗非鱼性别差异性分子标记检测尼罗罗非鱼性别的方法，步骤 如下1)提取尼罗罗非鱼的基因组DNA ；2)以尼罗罗非鱼的基因组DNA为模板进行PCR扩增，正义引物序列如SEQ ID NO. 2 所示，反义引物如SEQ ID NO. 3所示；3)对步骤2)制得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示 被测样品具有SEQ ID NO :1序列时，则该被测样为尼罗罗非鱼雄鱼。所述步骤2)中PCR扩增条件如下95 0C, 5min ；进行 35 个循环的 94 °C 30sec,60. 5°C 30sec,72°C Imin ；72°C 延伸 7min。有益效果1、本发明所述的分子标记为尼罗罗非鱼雄鱼特异性基因，为超雄性罗非鱼的选育 提供简便稳定的分子标记。2、本发明所述的SCAR引物用于预测尼罗罗非鱼的性别，为鉴定亲鱼以提高和稳 定奥尼鱼雄性率，提供简便稳定的分子标记，解决罗非鱼全雄控制分子标记辅助育种的关 键技术。3、本发明从分子水平探索不同罗非鱼的性别特征，探索建立雄性罗非鱼鉴别技 术，在生产方面具有重要应用价值。4、本发明利用RAPD技术及其他包括蛋白分析等相关技术，对目前养殖上重要的 尼罗和奥利亚罗非鱼进行雌、雄性间分子差异分析，并将获得的RAPD标记转化为稳定的 SCAR标记。
图1尼罗罗非鱼雌雄个体基因组电泳检测；其中泳道1、IKbp DNA Marker，泳道2、雄鱼基因组，泳道3、雌鱼基因组；
图2RAPD-PCR结果电泳检测；其中泳道1、DL2000DNA Marker，泳道2、雌鱼，泳道3、雄鱼；图3尼罗罗非鱼雄性特异性SCAR引物在大量样品中检测情况；其中中间泳道为DL2000 DNA Marker，其左侧为雌鱼，右侧为雄鱼；图4尼罗罗非鱼雄性特异性SCAR引物在大量样品中检测情况；其中中间泳道为DL2000 DNA Marker，其左侧为雌鱼，右侧为雄鱼；
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明的内容做进一步的说明，但本发明所保护范围不 限于此。实施例1 SCAR弓丨物的获得(1)尼罗罗非鱼基因组DNA的提取采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)， 取鱼尾部组织30mg左右提取基因组DNA。的琼脂糖凝胶电泳检测(如图1所示)合格 后，用于RAPD-PCR扩增。(2)性别差异性分子标记的筛选对步骤(1)中提取的基因组DNA利用上海生工生物工程技术服务有限公司商品化 生产的RAPD Primers进行RAPD-PCR扩增.反应条件为95°C，5min；进行 40 个循环的 94°C lmin, 36°C lmin, 72°C 2min ；最后 72°C 延伸 7min。将上述PCR产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，发现其中RAPD Primer S92 (CAGCTCACGA)的RAPD结果中有一条约800bp的雄性特异性条带(如图2所示)。将上述雄性特异性的条带切胶回收、连接T载体、转化，富集培养单克隆，再经过 菌液验证后，委托博尚生物技术有限公司测定该特异性片段的序列，经检测，该基因片段序 列如SEQ ID NO. 1所示。(3) SCAR引物的获得根据测序结果，应用引物设计软件Primer 5. 0针对测序所得片段设计特异性和 稳定性均较高的SCAR引物，委托博尚生物技术有限公司进行引物合成，并命名为ni $ 800， 引物序列如下正义引物5，GCGAATGGTGTTGAAGGCA3，(SEQ ID NO 2)反义引物5，CGACAGGAAATAAAATACTGGATCA3，(SEQ ID NO 3)实施例2(1)尼罗罗非鱼基因组DNA的提取剪取尼罗罗非鱼雌鱼和雄鱼尾鳍30mg左右，雌雄各20尾，采用海洋动物组织基因 组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组DNA。(2) SCAR 引物验证用实施例1获得的引物对步骤(1)提取的基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系为基因组DNA :1μ 1，正义引物1μ 1，反义引物1μ 1，dNTP :2μ 1， 10XPCR Buffer :2· 5μ 1，rTaq :0· 5μ 1，力口 ddH20 补充至 25 μ 1 体系。
PCR 反应条件为95 "C，5min ；进行 35 个循环的 94 "C 30sec，60. 5 "C 30sec, 72 °C Imin ； 72°C 延伸 7min。对扩增产物用的琼脂糖凝胶电泳进行检测。检测到一条约SOObp的特异性条 带在尼罗罗非鱼雄性群体中显现率为70%，而在雌性群体中的全体不出现(如图3和图4 所示)，此标记的有效性和稳定性已在大量样本DNA中进一步验证。
权利要求
尼罗罗非鱼性别差异性分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的尼罗罗非鱼性别差异性分子标记的PCR引物，正义引物序列如 SEQID NO. 2所示，反义引物如SEQ ID NO. 3所示。
3.—种检测尼罗罗非鱼性别的方法，其特征在于，步骤如下1)提取尼罗罗非鱼的基因组DNA；2)以尼罗罗非鱼的基因组DNA为模板进行PCR扩增，正义引物序列如SEQID NO. 2所 示，反义引物如SEQ ID NO. 3所示;3)对步骤2)制得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测 样品具有SEQ ID NO. 1序列时，则该被测样为尼罗罗非鱼雄鱼。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中PCR扩增条件如下 95°C，5min ；进行 35 个循环的 94°C 30sec，60. 5°C 30sec，72°C Imin ；72°C延伸 7min。
全文摘要
本发明涉及一种尼罗罗非鱼性别差异性分子标记及其应用，尤其是一种筛选尼罗罗非鱼超雄鱼的分子标记，属于基因工程技术领域。本发明公开了尼罗罗非鱼性别差异性分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，以及尼罗罗非鱼性别差异性分子标记的PCR引物，正义引物序列如SEQ ID NO.2所示，反义引物如SEQ ID NO.3所示。本发明从分子水平探索不同罗非鱼的性别特征，探索建立雄性罗非鱼鉴别技术，在生产方面具有重要应用价值。
文档编号C12Q1/68GK101984057SQ201010580350
公开日2011年3月9日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者刘增英, 宁萌, 张燕君, 杨永杰, 程娟 申请人:山东大学