专利名称：一种鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交鱼的分子标记方法
技术领域：
本发明属于分子标记技术领域，涉及一种鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交鱼的分子标记方法，是对不同种罗非鱼的鉴别。
背景技术：
罗非鱼(Tilapia)原产于非洲，是世界性养殖品种，该鱼上世纪50年代引入我国，得到了较快发展，现中国已是世界上最大的罗非鱼生产国和出口国。目前，我国主要养殖的罗非鱼品种有尼罗罗非鱼ipreochromis nilo ticus)，奥利亚罗非鱼ifireochromis aureus)和奥尼杂交罗非鱼，其中奥尼罗非鱼是尼罗罗非鱼(早)和奥利亚罗非鱼(古) 的杂交1代，具有雄性率高、生长快、抗病力强等优点，但它的雄性率和养殖性能与亲本的种质纯度密切相关。由于罗非鱼品种间很容易杂交，且杂种可育，杂交种形态又与亲本很相似，传统的形态辨别方法又很难准确辨别纯种和杂交种。因此，很容易造成罗非鱼种质混杂，导致优良经济性状退化，这也是目前制约我国罗非鱼良种保护和养殖发展的突出问题。尼罗罗非鱼，奥利亚罗非鱼及其它们杂交鱼鉴别方面，学者们曾利用同工酶技术、 RAPD技术、微卫星标记技术等建立了区别它们的生化和分子遗传标记。然而，同工酶是基因表达产物，但检测位点有限，对亲缘关系较近或遗传基础复杂的品种不容易区分；RAPD方法虽然是从基因水平鉴别不同品种，但RAPD方法对反应条件的变化很敏感，许多反应因素稍微有差异就会导致扩增带型发生改变，稳定性和重复性较差，从而限制了其应用。微卫星标记又称简单序列重复标记(SSR)与同工酶、RAPD、RFLP等技术相比，具有多态性频率高、 检测容易、重复性好、共显性的孟德尔式遗传等优点，被广泛用于品种及亲子鉴定等研究， 但应用微卫星标记进行多重PCR来快速、准确地鉴别不同罗非鱼品种的研究还未见报道。 采用特异微卫星标记技术进行多重PCR分析尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼以及它们的杂交鱼的遗传特性，可以建立快速、准确鉴别不同罗非鱼品种的方法。
发明内容
发明目的
本发明的目的是提供一种鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交鱼的分子标记方法，有助于快速、准确鉴别不同种罗非鱼，在罗非鱼保种、选育和养殖生产中有极大的应用价值。技术方案
一种鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交鱼的分子标记方法，其特征在于，采用以下提取步骤
(1)选用3对特异微卫星引物组合进行多重PCR反应，其中这3对特异微卫星引物如
下
CCCTCTGTTTCCATCTCA ； GATACCTGTCCATACCTCCTC ；
3GCTCGCTCCAGAAAAATCAC ； GTCAAAAAGGCATGGCAAAG ； CTGCACTTTTACTGAGGG ； TGGGAGATTAACAGAATAACA
(2)从待测罗非鱼采样血液或鳍条，采用DNA提取法提取基因组DNA；
(3)用步骤(2)的基因组DNA为模板，步骤(1)所选的3对微卫星引物组合进行多重 PCR扩增；
(4)对步骤(3)的PCR产物用8.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果。(5)根据多重PCR的电泳检测结果，鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及它们的杂交
佳.ο步骤(3)中，在进行PCR扩增时，PCR反应总体积为15 yL，其中含IOX反应缓冲液 1.5 μ L, Mg2+ 2 mmol/L, dNTP 200ymol/L, 3 对上下游引物各 0· 2 μ mol/L，Taq 酶 0. 4U, DNA 50 ng 100 ng，用灭菌双蒸馏水补足体积。步骤(3)中，PCR反应条件为94 "C 3 min ；94 "C 20 s，52 °C退火 20s，72 "C 20s, 25 30个循环；72°C延伸5 min。本发明具体如下步骤实现
(1)选用3对特异微卫星标记引物组合进行多重PCR反应。(2)从待测罗非鱼采样血液或鳍条，采用DNA提取法提取基因组DNA。(3)用步骤(2)的基因组DNA为模板，步骤(1)所选的3对微卫星引物组合进行多重PCR扩增。(4)对步骤(3)的PCR产物用8. 0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果。(5)根据多重PCR的电泳检测结果，就能鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及它们的杂交鱼在引物GM017扩增产物区，尼罗罗非鱼条带1条或2条，片段大小在144 148bp 左右；奥利亚罗非鱼条带1条，片段大小在160bp左右；杂交鱼条带都为2条，其中1条片段大小在144 148bp左右，另1条片段大小在160bp左右。在引物UNH948扩增产物区，尼罗罗非鱼条带1条或2条，片段大小在170 178bp左右；奥利亚罗非鱼条带1或2条，片段大小在196 202bp左右；杂交鱼条带都为2条，其中1条片段大小在170 178bp左右， 另1条片段大小在196 202bp左右。在引物GM440扩增产物区，尼罗罗非鱼条带1条或 2条，片段大小在262 266bp左右；奥利亚罗非鱼条带1条，片段大小在290bp左右；杂交鱼条带都为2条，其中1条片段大小在262 266bp左右，另1条片段大小在290bp左右。本发明中所选的3对微卫星引物在尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交鱼中PCR 扩增反应稳定、扩增片段清楚、不同种罗非鱼扩增片段差别明显，且这3对微卫星引物退火温度相近，每对引物扩增片段相差在20bp以上，在同一体系多重PCR反应中相互不影响各自的PCR扩增产物。这3对特异微卫星引物其中这3对特异微卫星引物如下
CCCTCTGTTTCCATCTCA ； GATACCTGTCCATACCTCCTC ； GCTCGCTCCAGAAAAATCAC ； GTCAAAAAGGCATGGCAAAG ； CTGCACTTTTACTGAGGG ； TGGGAGATTAACAGAATAACA
本发明中PCR反应总体积为15 μ L，其中含IOX反应缓冲液1. 5 μ L, Mg2+ 2 mmol/ L, dNTP 200 μ mol/L, 3 对上下游引物各 0. 2 μ mol/L, Taq 酶 0. 4U, DNA 50 ng 100 ng,用灭菌双蒸馏水补足体积。本发明中扩增PCR反应均在PCR仪上完成。PCR反应条件为94 V 3 min ；94 V 20 s, 52 °C退火 20s, 72 "C 20s，25 30 个循环；72°C延伸 5 min。有益效果
与现有技术相比，本申请采用特异微卫星标记技术进行多重PCR分析尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼以及它们的杂交鱼的遗传特性，反应稳定，重复性好，可以准确地将纯种尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼和它们的杂交后代鉴别开。本申请一次可同时检测多个微卫星位点，减少了检测时间和降低了检测成本。
图1尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其它们的杂交鱼多重PCR电泳检测结果，其中 M 分子量标准
1-13 尼罗罗非鱼 14-20 奥尼罗非鱼 21-28 尼奥罗非鱼 29-40 奥利亚罗非鱼
具体实施例方式
实施例1
本发明一种鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交鱼的分子标记方法采用以下技术步骤
尼罗罗非鱼13尾从中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴渔场采得。从每尾鱼的尾静脉采血0. 5!1^，取3(^1^血细胞抽提基因组0嫩。以尼罗罗非鱼的基因组DNA为模板， 用引物GM017, UNH948和GM440 3对引物对进行多重PCR扩增，PCR反应总体积为15 μ L， 其中含IOX反应缓冲液1. 5 μ L, MgCl2 2 mmol/L, dNTP 200ymol/L, 3对上下游引物各0. 2μπιο1/1，7^《酶0. 4U，DNA 80 ng，用灭菌双蒸馏水补足体积。PCR反应条件为94 °C 3 min ；94 "C 30 s，52 °C退火 30s, 72 "C 30s，25 个循环；72°C延伸 8 min。PCR 反应结束后，产物用8. 0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果。电泳检测发现，在引物GM017扩增产物区，尼罗罗非鱼条带1条或2条，片段大小在 144 148bp ；在引物UNH948扩增产物区，尼罗罗非鱼条带1条或2条，片段大小在170 184bp ；在引物GM440扩增产物区，尼罗罗非鱼条带1条或2条，片段大小在262 ^6bp。其中这3对特异微卫星引物如下 CCCTCTGTTTCCATCTCA ； GATACCTGTCCATACCTCCTC； GCTCGCTCCAGAAAAATCAC ； GTCAAAAAGGCATGGCAAAG ； CTGCACTTTTACTGAGGG ； TGGGAGATTAACAGAATAACA。实施例2
本发明一种鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交鱼的分子标记方法采用以下技术步骤
奥尼杂交罗非鱼(尼罗罗非鱼早X奥利亚罗非鱼￠)8尾从中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴渔场采得。每尾鱼取0. Ig尾鳍鳍条，抽提基因组DNA。以奥尼杂交罗非鱼的基因组DNA为模板，用引物GMO17，UNH948和GM440 3对引物对进行多重PCR扩增，PCR反应总体积为15 μ L，其中含IOX反应缓冲液1. 5 μ L5MgCl2 2 mmol/L,dNTP 200ymol/ L, 3对上下游引物各0. 2μπιο1/1，7^《酶0. 4U，DNA 50 ng，用灭菌双蒸馏水补足体积。PCR 反应条件为94 "C 3 min ；94 "C 30 s，52 °C退火 30s，72 "C 30s，30 个循环；72°C延伸 8 min。PCR反应结束后，产物用8.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果。电泳检测发现，在引物GM017扩增产物区，奥尼杂交鱼条带都为2 条，其中1条片段大小在144 148bp左右，另1条片段大小在160bp左右。在引物UNH948 扩增产物区，奥尼杂交鱼条带都为2条，其中1条片段大小在170 178bp左右，另1条片段大小在196 202bp左右。在引物GM440扩增产物区，奥尼杂交鱼条带都为2条，其中1 条片段大小在262 266bp左右，另1条片段大小在290bp左右。其中这3对特异微卫星引物如下 CCCTCTGTTTCCATCTCA ； GATACCTGTCCATACCTCCTC； GCTCGCTCCAGAAAAATCAC ； GTCAAAAAGGCATGGCAAAG ； CTGCACTTTTACTGAGGG ； TGGGAGATTAACAGAATAACA。实施例3
本发明一种鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交鱼的分子标记方法采用以下技术步骤
奥利亚罗非鱼12尾，尼奥杂交罗非鱼(尼罗罗非鱼$ X奥利亚罗非鱼早)7尾从中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴渔场采得。每尾鱼取30 μ L血细胞抽提基因组 DNA。以这些基因组DNA为模板，用引物GMO17，UNH948和GM440 3对引物对进行多重PCR 扩增，PCR反应总体积为15 μ L，其中含IOX反应缓冲液1. 5 μ L，MgCl2 2 mmol/L, dNTP 200 μ mol/L, 3对上下游引物各0. 2 μ mol/L，Taq酶0. 4U，DNA 70 ng，用灭菌双蒸馏水补足体积。PCR反应条件为94 "C 3 min ；94 "C 30 s，52 °C退火30s，72 "C 30s，沘个循环；72°C延伸8 min。PCR反应结束后，产物用8. 0 %的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果。电泳检测发现，在引物GM017扩增产物区，奥利亚罗非鱼条带1条，片段大小在160bp左右；尼奥杂交鱼条带都为2条，其中1条片段大小在 144 148bp左右，另1条片段大小在160bp。在引物UNH948扩增产物区，奥利亚罗非鱼条带1或2条，片段大小在196 202bp左右；尼奥杂交鱼条带都为2条，其中1条片段大小在170 178bp左右，另1条片段大小在196 202bp左右。在引物GM440扩增产物区，奥利亚罗非鱼条带1条，片段大小在290bp左右；尼奥杂交鱼条带都为2条，其中1条片段大小在262 266bp左右，另1条片段大小在290bp左右。其中这3对特异微卫星引物如下 CCCTCTGTTTCCATCTCA ； GATACCTGTCCATACCTCCTC； GCTCGCTCCAGAAAAATCAC ； GTCAAAAAGGCATGGCAAAG ； CTGCACTTTTACTGAGGG ； TGGGAGATTAACAGAATAACA。
权利要求
1.一种鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交鱼的分子标记方法，其特征在于，采用以下提取步骤(1)选用3对特异微卫星引物组合进行多重PCR反应，其中这3对特异微卫星引物如下CCCTCTGTTTCCATCTCA ； GATACCTGTCCATACCTCCTC； GCTCGCTCCAGAAAAATCAC ； GTCAAAAAGGCATGGCAAAG ； CTGCACTTTTACTGAGGG ； TGGGAGATTAACAGAATAACA(2)从待测罗非鱼采样血液或鳍条，采用DNA提取法提取基因组DNA；(3)用步骤(2)的基因组DNA为模板，步骤(1)所选的3对微卫星引物组合进行多重 PCR扩增；(4)对步骤(3)的PCR产物用8.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果；(5)根据多重PCR的电泳检测结果，鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及它们的杂交鱼。
2.根据权利要求1所述的鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交鱼的分子标记方法，其特征在于，步骤(3)中，在进行PCR扩增时，PCR反应总体积为15 yL，其中含IOX反应缓冲液 1.5 μ L, Mg2+ 2 mmol/L, dNTP 200ymol/L, 3 对上下游引物各 0. 2 μ mol/L， Taq酶0. 4U，DNA 50 ng 100 ng，用灭菌双蒸馏水补足体积。
3.根据权利要求1所述的鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交鱼的分子标记方法，其特征在于，步骤(3)中，PCR反应条件为94 V 3 min ；94 V 20 s，52 °C退火20s， 72 "C 20s，25 30 个循环；72°C延伸 5 min。
全文摘要
本发明涉及一种鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交鱼的分子标记方法，其特征是选用3对特异微卫星标记引物组合，从待测罗非鱼采样血液或鳍条，提取基因组DNA，对待测罗非鱼基因组DNA进行多重PCR扩增，PCR产物用8.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果。根据多重PCR的电泳检测结果，可鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及它们的杂交鱼。本发明可快速、有效地鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交鱼。
文档编号C12Q1/68GK102226220SQ20111016311
公开日2011年10月26日 申请日期2011年6月17日 优先权日2011年6月17日
发明者俞菊华, 唐永凯, 徐跑, 李建林, 李红霞 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心