专利名称：一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法
技术领域：
本发明属于鱼类分子标记技术领域，涉及一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法。
背景技术：
罗非鱼(Tilapia)原产于非洲，该鱼上世纪50年代引入我国，得到了较快发展，现在我国已是世界上最大的罗非鱼生产国和出口国。我国主要养殖的罗非鱼品种有尼罗罗非鱼iOreochromis niloticus),奥利亚罗非鱼iOreochromis aureus)和奥尼杂交罗非鱼等。由于不同品种的罗非鱼有很大的形态特征重叠，这使形态上鉴别不同罗非鱼品种非常困难。另外，罗非鱼品种间很容易杂交，且杂种可育，杂交种形态又与亲本很相似，因此，很容易造成罗非鱼种质混杂，导致优良经济性状退化，这也是目前制约我国罗非鱼养殖业发展的突出问题。运用分子标记技术在DNA水平上寻找不同罗非鱼品种的差异，可以快速、准 确鉴别不同罗非鱼品种，为罗非鱼的品种鉴定、种质保护等提供依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法，有助于快速、准确鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼，在罗非鱼种质鉴定、保种和选育中有极大的应用价值。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法，包括以下步骤
(1)采集待鉴别的罗非鱼的血液、鳍条或其他组织样品，采用DNA提取法提取基因组
DNA ；
(2)用步骤(I)获得的基因组DNA为模板，进行PCR扩增；
(3 )对步骤(2 )的PCR扩增产物进行电泳检测；
(4)根据PCR的电泳检测结果，鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼杂交鱼尼罗罗非鱼电泳检测结果有I条178bp的条带，奥利亚罗非鱼有I条187bp的条带，尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼的杂交鱼有2条条带，分别为178bp和187bp。步骤(2)中，PCR扩增采用的正义引物序列为5' AATAAAACAGTTGATGGTGA 3'，反义引物为5' AAATGAAGAAACGCCCTCTT 3' ACR体系总体积20 μ ，其中含IOX反应缓冲液 2 μ L, Mg2+ 2 mmol/L, dNTP 200 μ mol/L,上下游引物各 O. 2 μ mol/L，Taq 酶 O. 5U，DNA模板100 ng 200 ng,用灭菌双蒸懼水补足体积。PCR反应条件为94O 2min ；94°C50s，50°C退火 50s，72°C 50min，30 个循环；72°C 延伸 5 min，4°C保存。步骤(3)中，电泳检测的方法可采用8. 0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果。本发明的有益效果运用本发明所述的方法，可以在分子水平快速准确地同时将奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼区别开来。
图I为奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其两者的杂交鱼PCR电泳检测结果，
其中M :分子量标准
1-8 :奥尼罗非鱼
9-14 :尼罗罗非鱼(早)X奥利亚罗非鱼(古)
15-20 :尼罗罗非鱼( ) X奥利亚罗非鱼(早)
21-28 :尼罗罗非鱼； 图2为待检奥利亚罗非鱼PCR电泳检测结果，
其中M :分子量标准 1-36 :待检奥尼罗非鱼
37-39 :尼罗罗非鱼(早)X奥利亚罗非鱼( );
图3为待检尼罗罗非鱼PCR电泳检测结果，
其中M :分子量标准 1-36 :待检尼罗罗非鱼
37-39 :尼罗罗非鱼(早)X奥利亚罗非鱼( )。
具体实施例方式下列实施例中基因组DNA参照文献提取(萨姆布鲁克J，拉塞尔D W著.分子克隆试验指南[Μ]. 3版.黄培堂，王嘉玺，朱厚础，等，译.北京科学出版社，2002 :463-471)。实施例I
种类确定的奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼各8尾，尼罗罗非鱼 X奥利亚罗非鱼早杂交鱼6尾，尼罗罗非鱼早X奥利亚罗非鱼 杂交鱼6尾，从中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴渔场采得。每尾鱼取30 μ L血细胞抽提基因组DNA，分别以提取得到的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，正义引物序列为5' AATAAAACAGTTGATGGTGA 3'，反义引物为AAATGAAGAAACGCCCTCTT 3;，PCR反应体系总体积为20 μ L，其中含10X反应缓冲液2 μ LjMgCl2 2 mmol/L, dNTP 200 μ mol/L,上下游引物各 O. 2 μ mol/L，Taq 酶 O. 5U，DNA100 ng，用灭菌双蒸馏水补足体积。PCR反应条件为94°C 2min ；94°C 50s，50°C退火50s，72°C 50min，30个循环；72°C延伸5 min，4°C保存。PCR反应结束后，产物用8. 0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果。如图I所示，电泳检测发现，奥利亚罗非鱼都只有一条187bp的条带；尼罗罗非鱼都只有一条178bp的条带；尼罗罗非鱼 X奥利亚罗非鱼早杂交鱼6尾和尼罗罗非鱼早X奥利亚罗非鱼 杂交鱼6尾都有两条条带，一条为178bp，另一条为187bp，由电泳图谱可将奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼以及奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼的杂交罗非鱼区别开来。实施例2
待检奥利亚罗非鱼36尾，以尼罗罗非鱼 X奥利亚罗非鱼早杂交鱼3尾作为对照，从中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴渔场采得。剪取每尾鱼尾鳍并抽提基因组DNA，采用如实施例I所述的方法进行PCR扩增。PCR反应结束后，产物用8. O %的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果。电泳检测发现，如图2所示，36尾尼奥利亚罗非鱼都只一条187bp的条带，3尾尼罗罗非鱼 X奥利亚罗非鱼早杂交鱼有两条条带，一条为178bp,另一条为187bp。根据电泳结果可判定所检测的36尾鱼均为奥利亚罗非鱼。实施例3
待检尼罗罗非鱼36尾，以尼罗罗非鱼 X奥利亚罗非鱼早杂交鱼3尾作为对照，从中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴渔场采得。剪取每尾鱼尾鳍并抽提基因组DNA，采用如实施例I所述的方法进行PCR扩增。PCR反应结束后，产物用8. 0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果。电泳检测发现，如图3所示，36尾尼罗罗非鱼中34尾鱼有一条178bp的条带，2尾鱼有两条条带，一条为178bp，另一条为 187bp，与尼罗罗非鱼 X奥利亚罗非鱼早杂交鱼条带相同。根据电泳检测结果可判定所检测的36尾鱼中，34尾为尼罗罗非鱼，2尾为杂交罗非鱼。
权利要求
1.一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)采集待鉴别的罗非鱼样品，提取基因组DNA； (2)用步骤(I)获得的基因组DNA为模板，进行PCR扩增； (3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物进行电泳检测； (4)根据步骤(3)的电泳检测结果，鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼杂交鱼尼罗罗非鱼电泳检测结果有I条178bp的条带，奥利亚罗非鱼有I条187bp的条带，尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼的杂交鱼有2条条带，分别为178bp和187bp。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，PCR扩增采用的正义引物序列为5' AATAAAACAGTTGATGGTGA 3'，反义引物为5' ^ AAATGAAGAAACGCCCTCTT3' ο
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，PCR体系总体积20μ ，其中含 IOX 反应缓冲液 2 μ L，Mg2+ 2 mmol/L，dNTP 200 μ mol/L，上下游引物各(λ 2 μ mol/L, Taq酶O. 5U, DNA模板100 ng 200 ng,用灭菌双蒸懼水补足体积。
全文摘要
本发明公布了一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法，包括以下步骤(1)采集待鉴别的罗非鱼样品，提取基因组DNA；(2)用步骤(1)获得的基因组DNA为模板，进行PCR扩增；(3)对步骤(2)的PCR扩增产物进行电泳检测；(4)根据PCR的电泳检测结果，鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼杂交鱼尼罗罗非鱼电泳检测结果有1条178bp的条带，奥利亚罗非鱼有1条187bp的条带，尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼的杂交鱼有2条条带，分别为178bp和187bp。本发明有助于快速、准确鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼，在罗非鱼种质鉴定、保种和选育中有极大的应用价值。
文档编号C12Q1/68GK102864241SQ20121038434
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者李建林, 俞菊华, 唐永凯, 李红霞, 徐跑 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心