专利名称：一种杀植物寄生线虫的坚强芽胞杆菌及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种坚强芽胞杆菌及其制备方法与应用，尤其是涉及一种具杀植物寄生线虫活性的坚强芽胞杆菌及其制备方法与应用。
背景技术：
植物寄生线虫是一类重要植物病原物，在世界范围内严重危害农林业生产。据估计，植物寄生线虫每年给全世界农林业生产造成的损失高达1200亿美元以上。由于植物寄生线虫个体微小，危害隐蔽，且大多生活在植物体内或土壤中，因此防治极为困难。而根结线虫(Meloidogyne spp.)是植物寄生线虫中危害范围最广,造成农业损失最严重的一类线虫，它可以寄生大约1700多种植物，危害范围遍布全世界。
目前防治植物寄生线虫的方法主要有三种化学防治、农业措施及抗性品种选育等，化学防治的方法存在浪费大，选择性差，污染环境，灭生性强，破坏土壤生物区系等弊端，农业措施防治效果不佳，而抗性品种的筛选过程比较困难，这些防治线虫的方法存在着各种各样的弊端，效果都不太理想，使得线虫危害日益严重。因此科学家们都致力于寻求线虫天敌来防治根结线虫。目前已发现的线虫天敌大多数是真菌，其次还有细菌、病毒、捕食性线虫、立克次氏体、昆虫和原生动物等。植物寄生线虫生防细菌是近些年来兴起的研究热点，除早期的穿刺巴氏杆菌iPasteuriapenetrans)外，近年发现的苏云金芽胞杆菌(Bacillus、坚强芽胞杆菌 ijiacillus /i/SMAs)、假单胞菌 iPseudomonasspp.)等，它们在线虫生物防治中有巨大的应用潜力，逐渐为人们所认识，并对其进行了广泛而深入的研究。近年来，坚强芽胞杆菌杀线虫活性逐渐被发现并不断得到肯定，成为一种最具应用潜力的线虫生物防治资源。Keren-Zur等(2000)从土壤中分离得一株坚强芽胞杆菌，并被开发成了杀线虫可湿性粉剂BioNem。Mendoza等(2008)报道坚强芽胞杆菌发酵液上清(去除细胞后)对多种线虫体外作用表现出极高毒杀活性，不仅有麻痹和致死作用，而且能显著降低南方根结线虫卵孵化率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种杀植物寄生线虫的坚强芽胞杆菌及其制备方法与应用。本发明解决所述技术问题采用的技术方案是
本发明之杀植物寄生线虫的坚强芽胞杆菌，是湖南师范大学生命科学学院微生物实验室自行分离的坚强芽胞杆菌野生型菌株firmus YBf-10，于2012年6月14日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址中国.武汉.武汉大学)保藏,菌种保藏号CCTCCNO M2012233。本发明之杀植物寄生线虫的坚强芽胞杆菌firmus YBf-IO的分离鉴定采用80°C高温处理南海深海海底淤泥悬液30分钟，使用LB培养基，结合稀释划线分离的方法，从南海深海海底淤泥中直接分离到一株芽胞杆菌，通过革兰氏染色和16S rRNA基因同源性分析等方法鉴定该菌株为属，firmus种,并命名为firmusYBf-10，其 16S rRNA 基因在 Genbank 中的登录号为 JX163119. I。本发明之杀植物寄生线虫的坚强芽胞杆菌的发酵产物对植物寄生线虫有毒力作用。本发明之杀植物寄生线虫的坚强芽胞杆菌的代谢产物，由坚强芽胞杆菌经过常规的液体发酵提取制备，培养基的配方为以重量百分比计，含1%的氯化钠(NaCl )，1%的蛋白胨(tryptone), O. 5% 的酵母膏(yeast extract), pH 为 7· O。本发明之杀植物寄生线虫的坚强芽胞杆菌及其代谢产物，可用于植物寄生线虫尤其是根结线虫的生物防治。抗线虫活性:SaciTrAz1S firmus YBf-IO培养至芽胞成熟,离心取上清，10倍稀释后进行生物测定，发现其对北方根结线虫二龄幼虫有很高的毒力，处理24 h校正死亡率达到50%以上，72 h达到100%。对根结线虫虫卵进行毒力测定表明，作用48 h后能抑制虫卵孵化达到80%以上。通过不同发酵时间培养物生物活性测定表明，该菌株抗线虫活性物质产生于稳定期，并在衰亡期后期积累到最高。·抗线虫活性物质的属性研究将firmus YBf-IO发酵上清80°C处理30min，发现其对线虫毒力无明显变化，通过饱和硫酸铵沉淀上清中蛋白，该蛋白对线虫无明显毒力，但是去蛋白后的上清对线虫仍然具有与未经处理上清相似的杀线虫活性，表明坚强芽胞杆菌产生的杀线虫活性物质是一种非蛋白类的小分子化合物。Bacillus firmus YBf-IO使用常规培养基发酵后的产物，在防治线虫上有极佳的防治效果，能很好地抑制线虫在植株根部及土壤中的生长、繁殖。Bacillus firmus YBf-IO产生的杀虫物质经高温处理后仍具很强的杀虫毒力，这种非蛋白物质结构稳定，在土壤中药效时间长，能持续高效维持杀虫毒力，是也ci77w5· firmus YBf-IO开发为生物农药的一个重要优势。此外，芽胞杆菌抗逆性强，有很强的生态适应性，能在土壤中自行繁殖并代谢产生杀线虫活性物质，利用该菌株开发线虫生防制剂，具有其它线虫生防制剂无法比拟的优势。微生物菌种保藏情况说明
坚强芽胞杆菌野生型菌株(feci77心firmus YBf-ΙΟ)，于2012年6月14日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址中国.武汉.武汉大学)保藏,菌种保藏号CCTCC NO:M2012233。
图I是菌株firmus YBf-IO在LB培养基上48 h后的菌落形态 图2是菌株firmus YBf-IO的革兰染色 图3是发酵上清在不同作用时间对北方根结线虫二龄幼虫的致死率 图4是发酵液对虫卵孵化的抑制作用 ^blBacillus firmus YBf-IO在不同培养阶段发酵上清对北方根结线虫二龄幼虫的毒力 图6是Bacillus firmus YBf-IO菌株发酵上清中不同成分对北方根结线虫二龄幼虫毒力图；A、发酵上清蛋白；B、高温处理上清；C、去蛋白上清；D、发酵上清；图7是盆栽试验各处理组的病情指数比较 图8是盆栽试验各处理组的防治效果比较图。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。实施例I
本实施例包括坚强芽胞杆菌野生型菌株feci77心firmus YBf-IO的分离及革兰氏染色，以下为具体实施过程从南海南部岛礁附近，海拔-812米，东经115° 29. 4,北纬09° 51. 76处采集海底淤泥，在实验室用无菌水悬浮，加热至80°C，用接种环蘸取悬液在LB固体培养基(酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，琼脂粉20 g，溶于I L单蒸水中，121°C，20 min条件湿热灭菌)上稀释划线分离，28°C条件下培养48 h，从平板上挑取疑似单菌落 再次稀释划线于LB平板上，28°C条件下培养48 h，将重复分离纯化到的疑似单菌落接种到LB液体培养基摇瓶中，28°C，180 rpm，培养36 h，先用双蒸水配置50%的甘油(水甘油体积比=1 I )，将菌种接种到LB培养基中，培养12小时，然后菌液甘油(50%的甘油)体积比I : I混合之后保藏，-80°C冰箱中保藏。将从LB平板上分离纯化到的疑似菌落转接到LB固体平板培养48 h，观察菌落形态；疑似菌落转接到LB液体培养基中28°C，180 rpm，培养36 h后，进行革兰染色观察。革兰氏染色过程
1)取菌液少许，涂片并固定；
2)结晶紫染色Imin，水洗并用吸水纸吸干；
3)碘液媒染Imin，水洗并吸干；
4)用体积百分比为95%的酒精脱色，直到酒精不出现紫色时即停止(大约O.5 min)，立即水洗，并吸干；
5)番红复染3min左右，水洗并吸干；
6)在光学显微镜油镜头下观察菌体形状与颜色。图I是菌株feci77心firmus YBf-IO在LB培养基上48 h后的菌落形态图，表现为圆形，直径f 3 _不等，白色，不透明，表面光滑，边缘整齐平展，中间隆起。
图2是菌株firmus YBf-IO的革兰染色图，表现为阳性，长杆状，有芽胞。实施例2
本实施例为利用分离菌株获取16S rRNA基因，构建系统发育树，具体实施过程'Bacillus firmus YBf-IO菌株过夜活化培养，1%(V/V)接种量接种至新鲜LB培养基(Sambrook et al.，1989)，培养至OD6tltl =0. 3，离心收集细胞，按照 TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit ver. 2.0 操作方法提取基因组DNA。以该基因组DNA为模板，采用细菌16S rRNA通用引物(27f:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ；1492r ACGGCTACCTTGTTACGACTT)扩增。PCR 反应体系为(25
^ L) :10X 扩增缓冲液(含Mg2+L 5mmol/L) 2. 5 M L, dNTP O. 5 J1L,引物浓度各 O. 2 μ
L，模板DNA O. I M L，Taq DNA聚合酶O. I μ L，加双蒸水至25 M L ;扩增条件94°C预变性 4min，94°C变性 30 s，57°C退火 I min，72°C延伸 I. 5 min, 30 个循环，72°C延伸 8 min。PCR扩增的16S rDNA经琼脂糖凝胶电泳检测，采用DNA纯化试剂盒按照操作说明进行纯化。并克隆到T-载体上,转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞,选取阳性克隆,在Invitrogen公司进行测序。 将测序得到的16S rRNADNA序列在GenBank中进行BLAST比对分析，选取相近的典型芽胞杆菌16S rDNA序列，利用Clustal X v2. O进行比对分析，并构建系统进化树。序列表中是分离菌株16S rRNA基因序列，根据分离菌株16S rRNA基因利用Clustal_x和Mega 4两个软件构建的系统发育树，显示Bacillus firmus YBf-IO与BaciIlusfirmus亲源关系较近,序列同源性为100% (Bootstrap值=99%),形成一个簇群，表明从海底游泥中直接分离得到的菌株属于种Baci I lusfirmus，傲一步命名大Bacillusfirmus YBf-10，提交到GenBank数据库中获得的登陆号为JX163119. I。实施例3
本实施例具体实施过程
(I)菌株培养及生物测定样品制备采用LB培养基(pH 7.0) 綠BaciIIus firmusYBf-IO菌株，36 h后芽胞完全成熟。期间分时段取样2 mL，直至芽胞完全成熟。将每一时
段所取样品，测定OD6c 值绘制生长曲线，并离心去芽胞收集上清。用0.2 滤膜过滤后
保存备作生物测定样品。(2)北方根结线虫二龄幼虫的获得取被北方根结线虫(Meloidogyne hap I a)(温室人工培养繁殖)严重感染的番茄根，用自来水冲洗干净表面泥沙后，用尖头镊子从根上取下卵块，O. 5%(V/W) NaClO对卵块表面消毒约5 min，再用无菌水反复冲洗干净。25°C孵化4 d，即可得到大量初孵二龄幼虫，用作毒力测定。(3)生物测定对根结线虫幼虫毒力测定参照Masler (2007)方法在96孔酶标板中进行，每孔挑入40头北方根结线虫初孵活跃的二龄幼虫，10 μ L上清样品，I μ g/mL
间苯二酚5 μ L, 2. 5 μ g/mL制霉菌素5 μ L，每孔补充水至100 U L。每个处理设4个
重复，同时采用LB培养基作对照。25°C作用4 d，分别在4小时，8小时，12小时，24小时，48小时，60小时，72小时在解剖镜下观察计数，统计每孔死亡虫数，计算校正死亡率校正死亡率=处理死亡率/ (I-对照死亡率)X 100%。(4)对线虫虫卵孵化的影响。取分离好的虫卵，用蒸馏水洗干净表面，6 mg/mL的硫酸链霉素处理I h表面消毒，然后用无菌水反复冲洗干净。取3 mL发酵上清样品，加入约100颗虫卵，用LB培养基作对照，25°C作用48 h后，取出虫卵用无菌水冲洗干净，将虫卵放于无菌水中孵化，分别于第3、6和9天统计孵化出的幼虫数量，与对照比较，计算孵化率。每个处理设4个重复。图3是发酵上清在不同作用时间对北方根结线虫二龄幼虫的致死率图。结果表明，该菌株对北方根结线虫二龄幼虫毒力很高，作用24 h后校正死亡率超过50%，作用48 h后校正死亡率超过70%，作用72 h后校正死亡率达到100%。图4是发酵液对虫卵孵化的抑制作用图。结果表明firmus YBf-IO菌株发酵上清能显著抑制虫卵的孵化。孵化3 d，对照孵化率达到26%，处理约为6%，孵化抑制率为76. 9% ;孵化6 d，对照孵化率达到70%以上，处理约为11%，孵化抑制率为84. 2% ;孵化9 d，对照孵化率达到90%以上，而处理仅为31%，孵化抑制率为65. 6%。
图5 IBeicillus firmus YBf-IO在不同培养阶段发酵上清对北方根结线虫二龄幼虫的毒力图。结果表明firmus YBf-IO菌株合成杀线虫活性物质主要是在其稳定期进行的。Bacillus firmus YBf-IO菌株从稳定期(约12 h)开始表现出明显毒力，而且在整个稳定期期毒力持续增加，直到进入衰亡期后毒力达到最高。图6是Bacillus firmus YBf-IO菌株发酵上清中不同成分对北方根结线虫二龄幼虫毒力图。图中A是发酵上清蛋白；B是高温处理上清；C是去蛋白上清；D是发酵上清。结果表明，坚强芽胞杆菌产生的杀线虫活性物质不是蛋白质。培养液上清经高温处理后校正死亡率为92. 5%，毒力略有降低，而从上清中分离的蛋白校正死亡率仅为3. 57%，无明显毒力，上清去蛋白后校正死亡率为97. 63%，毒力与原始发酵液上清(校正死亡率为98. 25%)基本相当。实施例4
本实施例具体实施过程 (I)菌株培养及盆栽试验样品制备采用LB培养基(pH 7.0) 綠BaciIIus firmusYBf-IO菌株，36 h后芽胞完全成熟后，将发酵液分成两部分，一部分发酵液高速离心分成上清和沉淀两部分，上清直接做盆栽试验，沉淀用与离心前发酵液等体积的LB培养基重新悬浮后用来做盆栽试验；另一部分的发酵液直接用来做盆栽试验。(2)番茄盆栽试验采用灌根处理法，试验前28-35天，在育苗盘中经消毒处理的土壤中培育番茄苗。番茄苗长至四片真叶时，挑选长势一致的番茄苗，然后移栽至装满经110°c热力消毒IOh的沙土壤的花盆中，置于室温工作台上，每星期施可溶性复合肥一次，每天用喷雾器喷水一次，保持土壤肥力和湿度。移栽一个星期后，供试番茄生长稳定后，沿番茄基部松土接线虫，每株接种1000头。接虫第五天后，第一次用的芽胞产生后0D_=2. 8的 Baci Ilus firmus YBf-10 菌株的上清(I OmL 和 20mL )、沉淀(I OmL 和 20mL )、发酵液(IOmL和20mL)和LB培养基(20mL)灌根，每个处理设3次重复。15天后，第二次用的芽胞产生后0D6(I(I=3. 8的firmus YBf-IO菌株，同第一次的方法进行灌根。20天后，记录盆中土壤中线虫数，清洗番茄根，记录番茄根上的虫卵数、番茄的株高、根长。(3)番茄盆栽试验的数据处理按照下面的公式计算增长率、病情指数和防治效果，用邓肯式新复极差法比较各处理间的株高、根长和植株鲜重增长率及病情方面的差异。株高增长率=[(处理株高-对照株高)/对照株高]X 100%
地上部植株鲜重增长率=[(处理鲜重-对照鲜重)]/对照鲜重X100%
根长增长率=[(处理根长-对照根长)/对照根长]X100%
病情指数=[Σ (每各病级植株数X该级代表数值)/ (总株数Χ4) ] X 100%
防治效果=[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]X100%
图7和图8是盆栽试验各处理组的病情指数和防治效果比较图，图中CK是用20mL的LB培养基灌根处理番茄盆栽，Al和A2分别用IOmL和20mL的Bacillus firmus YBf-IO发酵液上清液灌根处理番茄盆栽，BI和B2分别用IOmL和20mL的feci77心firmus YBf-IO发酵液沉淀灌根处理番茄盆栽，Cl和C2分别用IOmL和20mL热Bacillus firmus YBf-IO发酵液灌根处理番茄盆栽，数据分析表明各给药组病情指数比对照组要低，各给药组的防治效果比对照组的要高。衰I是Bacillus firmus YBf-IO对番茄地上部分株高、根长增长率的影响，各给药组的株高和根长的增长呈现极显著的效果。表I Bacillus firmus YBf-IO对番茄地上部分株高、根长增长率的影响
蚕剂I用药量(mL) I地上部分株高增长率(％)I根长增长率(％)
LB 培养基(CK)20 ±4·44Ε0±9· OlG—
发酵液上清10^2.96±5.43C18.95±3.60D—
发酵液上清20》5·19±3·95Β51. 39±9· OlB—
发酵液沉淀10二 7.41±3.95F10.81±12.62F—
发酵液沉淀20i3.33±2.96D16·25±3·60Ε—
原发 SI 液10~^9·26±3·95Α48.68±3.60C—·
原发酵液|20|39·26±2·47Α|62·21±5·41Α
表2是各试验组番茄根上虫卵数、土壤里线虫数，结果显示，各给药组番茄根上虫卵数
和土壤里线虫数相对对照组有极显著的下降，无论是feci77i/5· firmus YBf-IO的发酵液、
发酵液上清还是发酵液的沉淀对线虫都有极显著的防治效果。(菌发酵后，发酵液里面含有
一些物质，如蛋白质和小分子，这些是溶解在发酵液里面的，沉淀是发酵液离心之后的菌体
和芽胞。)
表2各试验组番茄根上虫卵数、土壤里线虫数
WW~I给药量(mL)I根上虫卵数降低率(％)I 土壤里线虫数降低率(％)
LB 培养基(CK) 20_—0±12· 97A_—0±11· 35A_
液上清一 10—68.78±1.81D—53·57±5·28Β
液上清一20一76.47±2.41F— 73. 27± 19. 83E
液沉淀一10一21·87±8·95Β— 70. 48± 11. 13D
液沉淀一20一53.24±5.93C— 62. 99±22· 39C
慕哀酵液一10—72·70±4·42Ε—75.18±7.99F
蛋衷酵液!20I—86. 43±2· 41G|—78. 18±4· 71G
权利要求
1.一种杀植物寄生线虫的坚强芽胞杆菌，其特征在于，为坚强芽胞杆菌野生型菌株Bacillus firmus YBf-10，中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC NO: M2012233。
2.一种如权利要求I所述的杀植物寄生线虫的坚强芽胞杆菌的代谢产物，其特征在予，洛BaciIIus firmus YBf-IO在培养细菌的常规培养基中发酵，本培养基的配方为以重量百分比计，含1%的氯化钠，1%的蛋白胨，O. 5%的酵母膏，pH为7. O。
3.—种如权利要求I所述的杀植物寄生线虫的坚强芽胞杆菌或如权利要求2所述的杀植物寄生线虫的坚强芽胞杆菌的代谢产物，在植物寄生线虫生物防治方面的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物寄生线虫为根结线虫。
全文摘要
一种杀植物寄生线虫的坚强芽胞杆菌及其制备方法与应用，本发明之杀植物寄生线虫的坚强芽胞杆菌为坚强芽胞杆菌野生型菌株BacillusfirmusYBf-10，于2012年6月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号CCTCCNOM2012233。本发明还包括杀植物寄生线虫的坚强芽胞杆菌的制备方法与应用。BacillusfirmusYBf-10在普通细菌培养基中发酵制备其代谢产物，运用于杀根结线虫，作用于二龄幼虫，处理24h校正死亡率达到50%以上，72h达到100%；作用于根结线虫虫卵48h后能抑制虫卵孵化达到80%以上。
文档编号C12R1/07GK102876611SQ20121038478
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月12日 优先权日2012年10月12日
发明者余子全, 夏立秋, 熊静, 罗辉, 张超, 胡胜标 申请人:湖南师范大学