专利名称：一种坚强芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种坚强芽孢杆菌以及使用这种杆菌通过立体选择性环氧化顺丙烯磷酸制备手性药物磷霉素的方法。
磷霉素[(-)-1R，2S-环氧丙基磷酸，(-)-1R，2S-epoxypropylphosphonicacid，Fosfomycin，FoM]是一种抑制细菌细胞壁合成的临床常用的重要广谱抗生素，1969年由Hendlin等人自弗氏链霉菌中发现[1]。它与丙酮酰转移酶共价结合，导致该酶不可逆失活，抑制N-乙酰胞壁酸的合成[2]。磷霉素与其他抗生素无交叉耐药性，因而在临床上可用于耐药性金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌及沙门氏菌等引起的感染，如败血症、脑膜炎、肺炎及尿道、肠道、皮肤软组织等的感染。
由于磷霉素的结构简单，目前工业上以化学全合成进行生产，得到磷霉素的外消旋体，经化学拆分，得到磷霉素，由顺丙烯磷酸(cis-propenylphosphonic acid，PPOH)到磷霉素的实际收率低于32％[3]。由于右旋磷霉素完全废弃，加之需要大量的化学拆分试剂，造成资源浪费和环境污染。
利用微生物可以将磷霉素合成的中间体顺丙烯磷酸直接环氧化为磷霉素(
图1)，该反应为立体有择性反应，不存在化学拆分的问题，且条件温和，污染较少，所得产品的光学纯度较高。表1列出相关文献的研究结果。利用微生物环氧化顺丙烯磷酸产生磷霉素的过程如下所示
表1.微生物立体选择性环氧化顺丙烯磷酸产生磷霉素的文献
由于存在底物或产物抑制作用，目前达到的最高水平是细菌在底物浓度达到0.5％(g/ml，下同)时，转化率40％，产物浓度2.1mg/mL[4]；真菌在顺丙烯磷酸浓度为0.3％时，其转化率为40％，最高产物浓度1.15mg/mL[7]。
本发明的一个目的是提供一种坚强芽孢杆菌，这种杆菌可以通过立体选择性环氧化顺丙烯磷酸制备手性药物磷霉素。
本发明的另一个目的是提供一种使用本发明的坚强芽孢杆菌通过立体选择性环氧化顺丙烯磷酸制备手性药物磷霉素的方法。
我们由土样中筛选到了8株细菌，皆可将顺丙烯磷酸立体选择性环氧化为磷霉素。其中一株坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)，编号S101。因而，本发明发现了一种新的可以将顺丙烯磷酸立体选择性环氧化为磷霉素的微生物坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)，编号为S101。该菌株采自北京香山土壤中，经富集培养，筛选得到。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址中国，北京，中关村，邮政编码100080)，保藏编号为CGMCC No.0495，名称为坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)S101。
该菌株具有如下特征细胞杆状，革兰氏阳性，大小为0.75×2.0～3.75μm，产生中生近端生的椭圆状芽孢，孢囊不膨大。细胞内无聚-β-羟基丁酸盐(PHB)颗粒。不产生乙酰甲基甲醇(V-P反应阴性)，VP液最终pH7.2。接触酶阳性，氧化酶阳性。卵磷脂酶阴性，还原硝酸盐。在7％NaCl中生长但pH5.7时不生长，在厌氧培养基中不生长，营专营好氧生活。从葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸。水解淀粉，石蕊牛奶呈还原反应。
该菌株具有如下转化特点1.底物耐受性好，以PPOH为碳源(3％～5％)生长良好，但没有转化；2.该菌产磷霉素的量随着底物浓度的增加而增加，但转化率下降，在底物浓度1.0％时，产率15％；3.产物浓度高，在底物浓度0.5％时，产物浓度达2.65mg/mL；该菌种对于底物的纯度要求不高，明显优于本研究组曾经筛选到的青霉菌。
生长、保藏培养基菌株在琼脂牛肉汁斜面上生长良好。
本发明还提供了一种使用本发明的坚强芽孢杆菌通过立体选择性环氧化顺丙烯磷酸制备手性药物磷霉素的方法，该方法包括培养本发明的坚强芽孢杆菌，并从培养上清液中分离手性药物磷霉素的步骤。
用于本发明的转化培养基可以是含有适当的碳源，氮源和顺丙烯磷酸的培养基，例如，可以是含有甘油，蛋白胨，牛肉浸膏，矾酸钠，氯化钴和顺丙烯磷酸的培养基，该菌株可以完成将顺丙烯磷酸立体选择性转化为磷霉素。
在上述培养基中甘油可被其他碳源所代替，如蔗糖、可溶性淀粉、甘露糖等。甘油的最佳用量为培养基总体积的1％～7％(重量/体积)。
可以完成该转化反应的蛋白胨有鱼蛋白胨、牛肉蛋白胨、大豆蛋白胨和玉米浆等。最佳为胰蛋白胨和聚胨。蛋白胨的最佳用量为培养基总体积的1％～5％(重量/体积)。
牛肉浸膏可被酵母膏等替代，牛肉浸膏的最佳用量为培养基总体积的0.3％～3％(重量/体积)。
硫酸镁可被各种钠盐、钾盐、镁盐、钡盐、钙盐、铝盐所代替；矾酸钠和氯化钴可被相应的盐所代替。
pH对转化的影响pH6～9皆可进行转化，pH7～8为最适值。
温度对转化的影响该反应在20℃～40℃的范围内皆可进行，最适温度28℃。
培养时间转化培养4天～5天开始产生磷霉素，5天～7天达到最高水平。
底物在培养基中的浓度优选为0.05-2(重量/体积)％。
实施例实施例一、磷霉素的制备1、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)S101，在牛肉汁琼脂斜面上28℃培养24h。
2、转化培养基甘油3％，胰蛋白胨1％，聚胨2％，牛肉浸膏0.5％，MgSO4·7H2O 0.15％，Na3VO4·12H2O 0.01％，CoCl2·6H2O 0.05％，蒸馏水，PPOH 0.05％～5％，pH8.0。
3、把步骤1的菌株接入2中，在28℃，280r/min的摇床上培养5天。按照实施例二所示的方法进行生物检测以确定磷霉素的生成并达到了最高值。
4、收集3产生的发酵液，合并离心，弃去菌丝。上清液按2％的量加入活性炭搅拌，抽滤，除去活性炭。上清液通过290阴离子交换树脂柱，蒸馏水洗柱至流出液无色。以0％～3％的NaCl水溶液洗脱。收集活性部分，减压浓缩，浓缩液用硅胶柱干柱减压柱层析(硅胶H)，50％甲醇洗脱，活性部分减压浓缩除去甲醇，水溶液冷冻干燥，得磷霉素粗品(尚有少部分未转化的底物PPOH)。实施例二、磷霉素的检测与鉴定1、生物检测指示菌变形杆菌(Proteus sp.)FI-1，该菌的生长只被磷霉素抑制，右旋磷霉素、PPOH以及实验中的其它物质皆不抑制其生长。菌在牛肉汁加糖的琼脂斜面上37℃培养16h后使用。将由蛋白胨，牛肉膏，酵母膏和洋菜组成的培养基熔融，冷却，接入指示菌，倾倒平皿。
磷霉素检测将10μl样品加于直径8mm的圆形滤纸片上，吹干，贴于含指示菌的培养皿上，28℃，培养16h，磷霉素可产生清晰透明之抑菌圈。抑菌圈的直径与磷霉素浓度的对数在一定范围内成正比，据此可得磷霉素浓度标准曲线。按照此标准曲线可计算磷霉素的浓度。
2、磷霉素的薄层层析[8]
利用如下展开剂系统，可以将磷霉素与底物PPOH区分开来a.正丁醇∶乙酸∶水(3∶1∶1)；b.甲醇∶水∶三乙胺(80∶20∶5)。显色剂a.含0.1％FeCl3·6H2O的80％乙醇水溶液；b.含1％磺基水杨酸的80％乙醇水溶液，先a后b，磷霉素显白色斑点(见
图1)。将展开后的硅胶板置于含指示菌的培养皿上，待浸润后取下，28℃，培养16h，含磷霉素的部分产生抑菌圈。比较样品与标准品的Rf值可确证磷霉素的存在。实施例三、影响转化的因素1、甘油对转化的影响甘油是影响转化的关键因素之一。表2部分显示了甘油的用量与转化的关系。
表2.甘油的量与转化的关系
*φ代表抑菌圈直径，下同2、底物浓度与转化的关系30ml转化培养基，培养5天后，发酵液体积约为25ml，测定磷霉素浓度。结果见表2，在没有PPOH时发酵液中没有磷霉素，该结果也说明磷霉素是由PPOH转化产生的，而不是发酵产生。
表3 PPOH的浓度对转化的影响
参考文献[1]Hendlin D，Stapley EO，Jakson M，et al.Science，1969，166122～123[2]Giancarlo Lancini，Francesco Parenti，Gian Guaiberto Gallo etal.Antibiotics-A Multidisplinary Approach40[3]Glamkowski EJ，Gal G，Purick R，et al.J Org Chem，1972，353510～3512[4]Kazuo Aisaka，Takashi Ohshiro，Takayuki Uwajima.
Appl Microbiol otechnol，1992，36431～435[5]N Itoh，M Kusaka，T Hirota et al.Appl Microbiol Biotechnol，1995，43394～401[6]闫浩林，马莉，徐成.沈阳药科大学学报，1995，6232～39[7]闫浩林，马莉，张秋霞.沈阳药科大学学报，1994，61282～297[8]H Shafer，W J A Vandenheuvel，R Ormond et al.JChromatog，1970，52111～11权利要求
1.一种坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)S101，保藏编号为CGMCC No.0495。
2.一种利用微生物通过立体选择性环氧化顺丙烯磷酸制备手性药物磷霉素的方法，该方法包括培养权利要求1所述的坚强芽孢杆菌，并从培养上清液中分离手性药物磷霉素的步骤。
3.按照权利要求2所述的方法，其中，培养所述的坚强芽孢杆菌时所使用的培养基中含有甘油，蛋白胨，牛肉浸膏，矾酸钠和氯化钴和顺丙烯磷酸。
4.按照权利要求2所述的方法，其中，培养基中甘油的用量为培养基总体积的1％～7％(重量/体积)。
5.按照权利要求2所述的方法，其中，培养基中蛋白胨的用量为培养基总体积的1％～5％(重量/体积)。
6.按照权利要求2所述的方法，其中，牛肉浸膏的用量为培养基总体积的0.3％～3％(重量/体积)。
7.按照权利要求2所述的方法，其中，培养基的pH为7～8。
8.按照权利要求2所述的方法，其中，培养温度为28℃。
9.按照权利要求2所述的方法，其中，底物顺丙烯磷酸在培养基中的浓度为0.05-2(重量/体积)％。
全文摘要
本发明提供了一种坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)S101,保藏编号为CGMCC No.0495。本发明还提供了一种利用微生物通过立体选择性环氧化顺丙烯磷酸制备手性药物磷霉素的方法,该方法包括培养权利要求1所述的坚强芽孢杆菌,并从培养上清液中分离手性药物磷霉素的步骤。
文档编号C12N1/20GK1355292SQ0013251
公开日2002年6月26日 申请日期2000年11月24日 优先权日2000年11月24日
发明者石家骥 申请人:中国科学院微生物研究所