专利名称：食线虫芽孢杆菌胞外侵染性中性蛋白酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种食线虫芽孢杆菌胞外侵染性中性蛋白酶基因及其应用，属于生物技 术领域。
背景技术：
植物寄生线虫具有地域分布广泛、宿主种类多样等特征，并容易使已发生线虫病害 的植物继发真菌或细菌感染，从而给农作物、林木和食用菌带来很大的危害。而我们现 今所依赖的化学防治，由于对环境的破坏以及对人畜安全性的影响，其使用正逐步受到 限制，因此生物防治病原线虫成了植物线虫病害综合治理研究的前言和热点。在线虫侵 染过程中，无论是对于虫体本身还是线虫虫卵来说，其覆盖于表面的体壁或卵壳都是线 虫防止侵染的重要保护结构，而蛋白酶能有效地降解线虫体壁，协助杀线虫生物完成侵 染过程，是线虫侵染的重要毒力因子之一，但目前从杀线虫细菌中获得的可降解线虫体 壁的蛋白酶基因非常有限。因此在食线虫细菌的研究中，新的可降解线虫体壁的中性蛋 白酶基因发现，克隆及其功能研究，不仅能进一步完善食线虫细菌侵染线虫的分子机理， 并可促进线虫生防研究向基因工程方向发展，为线虫生防菌的遗传改良及将侵染性蛋白 酶基因转入农作物构建培育出抗性品种奠定重要基础。
经文献检索，未见与本发明相同的公开报道
发明内容
本发明的目的在于提供一种食线虫芽孢杆菌胞外侵染性中性蛋白酶基因及其应用。 本发明人在开展杀线虫细菌研究中，获得一株对线虫具有强侵染作用的食线虫细菌 新种feci""s /7e历atowV"s B16， feci"〃s / e鹏tocj'c/"s B16，保藏在中国微生物菌种
保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京.中关村；保藏日期2004年4月5
日；保藏号CGMCC No. 1128。
本发明通过分离纯化、性质鉴定、兼并引物设计等技术，在该芽孢杆菌属的细菌中 克隆出了一种新的可降解线虫体壁、且具杀线虫活性的中性蛋白酶基因，提交GenBank， 序列号为AY708654。编码胞外侵染性中性蛋白酶的开放性阅读框架长1566bp，共编码 521个氨基酸残基。其中含有27个氨基酸残基的信号肽，194个氨基酸残基的前肽，成 熟肽具有300个氨基酸残基。
本发明利用^ET30载体系统在大肠杆菌宿主细胞BL21中得到成功异源表达，重组 蛋白大部分是以包涵体形式存在。经镍离子亲和层析柱纯化、SDS-PAGE电泳分析显示， 重组蛋白分子量为42kD，经过复性后其活性达到原来的76. 05°/。，该重组蛋白酶对线虫 /^/7agre"〃s. re力Vi〃s的半致死率为1. 70 ii g mr'24h—'，对线虫^xnsa/ 力e〗e/7c/ 〃s 《Wop力j7^的半致死率为2.28y g m厂'24h—'。同时利用该蛋白酶处理纯化的线虫体壁， 在解剖显微镜下观察到大量的不完整的线虫体壁碎片，证实胞外侵染性中性蛋白酶对线 虫体壁的降解作用以及杀线虫活性。
本发明通过分析验证实验，证实来源于杀线虫芽胞杆菌的胞外侵染性中性蛋白酶基 因及其编码产物能有效降解线虫体壁、并具有杀线虫活性。故该基因用来研究蛋白酶在 侵染线虫过程中的生化本质，并作为获得高效生防菌株的靶基因。
附表胞外中性蛋白酶纯化过程中各酶液及异源表达重组蛋白的酶活和对线虫的毒杀作用
对线虫对线虫
蛋白酶液样品蛋白酶活性(U ml—')/Wj'""s的半致死
率(P g mr'24h,死率(Ugmr24h—1)
卿(SD)
培养上清液88.53.09(1.6)7.87(1.9)
粗酶液106. 92. 13(1.8)2. 56(2. 1)
离子柱收集137.01. 72(2. 7)2. 35(1. 3)
中性蛋白酶250. 51. 69(2. 1)2. 26(2. 3)
表达重组中性蛋白 酶1.70(1.4)2.28(1.2)
190. 5BSA250.0一_
本发明具有安全性高、环境无污染、杀虫效佳等优点。
图1为本发明基因所编码的胞外侵染性中性蛋白酶的纯化与SDS-PAGE分析。 A为粗酶液经过阳离子层析的结果。其中只有洗脱峰具有蛋白酶活和杀线虫活性； B为疏水层析结果。其中洗脱峰1具有蛋白酶活和杀线虫活性； C为洗脱峰1组分进行SDS-PAGE分析，显示得到电泳纯的目的蛋白，即胞外侵染 性中性蛋白酶。
图2为本发明编码的胞外侵染性中性蛋白酶在大肠杆菌BL21中异源表达后进行 SDS-PAGE电泳。M泳道代表蛋白分子量标准；泳道1代表具有重组表达质粒的大肠 杆菌菌株用IPTG诱导4小时；泳道2代表异源表达的目的蛋白经过Ni-NTA亲合 柱纯化；泳道3、 4代表纯化后的重组蛋白酶经过复性。
图3 : a为本发明基因编码的胞外侵染性中性蛋白酶2.50ng ml—'处理线虫
尸.re力'w'"52天的作用。 b为本发明基因编码的胞外侵染性中性蛋白酶2.50u g m1—1处理线虫
尸.re力'w'iAs2. 5天的作用。 c为本发明基因在大肠杆菌BL21中异源表达的重组蛋白酶2. 50u g mr处理线虫 尸.re力Vi"s 3天的作用。 d为本发明基因在大肠杆菌BL21中异源表达的重组蛋白酶2.50ug mr处理线虫 尸.re力Vks 3. 5天的作用。 e为阴性对照。
具体实施例方式
实施例一胞外侵染性中性蛋白酶的纯化
I、蛋白样品的处理
1. 取杀线虫芽胞杆菌单菌落接种到500mlYPD液体培养基中，37。C200rpm培养3 天。
2. 将500ml发酵培养物于5000rpm/min离心10分钟，取上清液，并检测培养上清 液的蛋白酶活性及其杀线虫活性，结果显示培养上清液的蛋白酶活性为88. 5U m1—1，对线虫尸.re力Vi"s的半致死率为3. 09 y g mr'24h—'，对线虫A "Vc^^7iA 的半致死率为7.87ng ml—'24h—'(见附表)。
3. 按40%-70%饱和度加入硫酸铵，于4。C静置2小时，然后8000rpm/min离心30 分钟，弃上清。
4. 用50函磷酸缓冲液(39ml的50mM磷酸二氢钠加61ml的50mM磷酸氢二钠，pH 为6. 0)重新溶解，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋(MW: 8， 000-14000Da) 于10倍的50mM磷酸缓冲液中透析至其电导小于2 ms/cm，即得粗酶液。检测粗 酶液的蛋白酶活性与杀线虫活性，发现粗酶液的酶活为106.9Uml—1，对线虫尸. re力Vi"s的半致死率为2. 13 u g m广24h—\对线虫5. ^^oa^7"s的半致死率 为2. 56y g mr24h—1 (见附表)。
II、电泳纯的目标蛋白酶的纯化
1. 将以上得到的10ml粗酶液上HiTrap SP FF柱，并用10mM PBS(pH 6.0)平衡洗 脱，然后用含0.5 mo1/ L NaCl平衡缓冲液直线梯度洗脱，检测洗脱峰成分的蛋 白酶活性及杀线虫活性；
2. 将活性样品加入2 M(NH4)2S04并调至pH7.0,上HiPiVM 16/10 Phenyl FF柱， 用平衡缓冲液(IO mM PBS;1 M (NH》2S(\ pH 7. 0)冲洗，再用含1-0 M (NH4)2S04 平衡缓冲液洗脱，收集5 ml具有蛋白酶活性和杀线虫活性的洗脱液成分。
3. 将具有蛋白酶活性和杀线虫活性的洗脱液组分进行SDS-PAGE分析，得到电泳纯 的侵染性中性蛋白酶，其分子量约40 kDa (见图l)。
4.检测纯化后的胞外侵染性中性蛋白酶的酶活与杀线虫活性，结果显示纯化的胞 外侵染性中性蛋白酶的酶活为250.5U ml—1,对线虫尸.re力'w'"s的半致死率为 L69y g mr'24h、对线虫A ;^A^/ W"s的半致死率为2. 26 P g m1—1241^ (见附 表)。
实施例二胞外侵染性中性蛋白酶基因克隆 I、引物设计
将从食线虫芽胞杆菌中纯化得到的电泳纯的侵染性中性丝氨酸蛋白酶经过电转移 到PVDF膜后，送中国医学科学研究院基础医学研究所进行N-末端氨基酸检测，测序结 果为AAATGTGTTL。将该蛋白酶N末端序列在GeneBank数据库进行BLAST,与来自 feci""s. a/^A^'^ye/^^'e/7s的叩r序列有90%的同源性，序列号为GI: 143248。由 此选取启始密码与终止密码附近同源性较高的片段设计兼并引物，上游 GGGGGATTTATGTGGGTTT和下游TACAATCCG(A) ACT(A)GCATTCCA用于中性蛋白酶基因扩增。 II、基因克隆
1. 提取杀线虫细菌的基因组DNA
2. 以基因组DNA为模板，以上设计的简并引物为扩增引物，扩增目的蛋白酶基因。。 PCR扩增共进行35个循环，条件为95t:变性l min , 55 。C退火l min , 72 。C 延伸1.5 min ，最后72 。C保温10 min
3. PCR后将目的片段进行琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收
4. 将回收的PCR产物与pMD18-T vector进行连接
5. ￡DH 5a感受态的制备
6. 连接产物的转化和重组子的蓝白斑筛选 III、质粒测序及序列分析
测序结果用看图软件Chromas校读、经初步分析排除错误碱基。 胞外侵染性中性蛋白酶基因的开放性阅读框架全长1566个碱基，编码一个521个 氨基酸残基的蛋白质，其中含有27个氨基酸残基的信号肽(编码序列为l-81bp)， 194 个氨基酸残基的前肽(编码序列为82-663bp)，成熟肽具有300个氨基酸残基(编码序列 为664-1563bp)，而成熟肽的起始10个氨基酸序列与蛋白质N末端测序获得结果完全一 致。该基因登记GeneBank，接受号为AY 708654。用本序列在GeneBank数据库进行BLAST, 与5.柳^oJi^/e/acie/w的叩r的基因序列有94%的同源性，同时与几种其他细菌产生 的叩r基因序列有82%-98%的同源性。
实施例三胞外侵染性中性蛋白酶基因表达
I、重组表达质粒的构建
根据胞外侵染性中丝蛋白酶基因设计上下游分别含有AfcoI和X力oI的一对引物
5， -CCATGGCCGCTCAACCGGAACAG， ； 5， - CTCGAGCAATCCAACTGCATTCCAGGC-3， PCR后 将扩增得到的DNA片段进行回收、酶切，并与大肠杆菌表达载体pET30a连接、转化 大肠杆菌感受态细胞DH5a ，筛选得到中性蛋白酶的表达重组质粒。
II、 蛋白诱导表达及SDS-PAGE:
1. 将重组质粒转化表达宿主菌BL21，以含质粒^ET30a的BL21为对照菌株作诱导表 达。
2. 分别挑取转化菌落接种到2 ml含50 ug/ml kanamycin的LB培养基中，37 。C下 培养14 16 h。
3. 以5 %的接种量接至新鲜的相同培养基中，至6ft。。为0.5 0.7时加入l mmo1/ L 的异丙基硫代-e-Z^半乳糖苷(IPTG)诱导4 h。
4. 离心收集菌体，采用SDS-PAGE分析表达产物(分离胶浓度12 %，浓縮胶浓度4 %)。 电泳分析可看到异源表达的目标重组蛋白酶为42kDa，且主要以包涵体形式表达
(见图2，泳道l)。
III、 包涵体的分离和纯化
1. 将离心收集的菌体用50 mmol/L的Tris-HC1缓冲液(pH7.5)洗涤2次。
2. 将菌体悬浮于溶液A (50 mmo1/ L Tris-HCl， 20画1/ L DTT， lramol/L EDTA， pH7. 5)中，冰浴超声破碎15 min， 10 000 rtm离心15 min收集沉淀。
3. 用溶液B (2 mo1/L尿素，1% TritonX-100， 50 mmo1/L Tris-HC1， 20咖ol/L DTT， 1腸1/ L EDTA， pH7. 5)洗涤包涵体2次。
4. 将包涵体在变性缓冲液(8 mo1/ L尿素，50 mmo1/ L Tris-HC1， 20 mrao1/ L DTT， pH8.0)中室温溶解2 h，离心后将上清液通过0.2um的纤维素滤膜除去 不溶物。
5. 将样品上l mL的Ni-NTA亲合柱，用pH6. 3的变性缓冲液洗涤2次，共计10个柱 体积后，用pH4. 5的变性缓冲液洗脱。纯化后的重组表达蛋白进行SDS-PAGE电 泳(见图2，泳道2)。
IV、 包涵体蛋白的复性
1. 将上述纯化得到的纯化酶液分别调节pH为4.0、 6.0和9.0，用变性缓冲液调蛋 白浓度为2 mg/ mL。
2. 用复性缓冲液(50腿o1/ L甘氨酸，2咖o1/ L DTT， 10 %甘油，150腿o1/ L NaCl， 50画1/ L H3P04， 3 ,1/ L GSH， 0.3 ,1/ L GSSG)稀释50倍。
3. 静置12h后，将pH为4.0和9.0的复性液调为pH6.0，然后测活性。为避免在稀 释过程中产生大量沉淀而影响复性效果，上述操作均应在低温(〈5。C)下进行。
4. 将复性后的蛋白酶进行SDS-PAGE电泳检测复性情况，发现原有的包涵体部分溶 解(见图2，泳道3、 4)。
5. 检测复性后的重组蛋白酶的酶活及其杀线虫活性，结果显示在大肠杆菌中异源
表达的中性蛋白酶经过复性后其活性达到原来的76.05%，对线虫尸.re力'w》s 的半致死率为l. 70ug ml—'241"r'，对线虫A ;^7叩力W"s的半致死率为2. 28ug mlH1 (见附表)。
实施例四蛋白酶活性及杀线虫活性测定
I 、蛋白酶活性测定
1. 取125u 1的待测酶液与125 u 1 10. 5%的Casein混合，置于37 'C水浴中孵育 20 min。
2. 未被降解的底物用250u 1的10y。的TCA(三氯醋酸)来沉淀，并12000rpm5min离 心。
3. 取500 ul的上清与2.5ml的Na2C03、 500^1的福林酚试剂混合，3(TC水浴 15min。
4. 于680nm下测定该混合物的吸收光值。阴性对照通过酶液与底物不经水浴直接 用TCA沉淀获得。
II、杀线虫活性测定
1. 无菌的1.5 ml Eppendorf管中加入150 ul待测酶溶液，再加入一定数量
(50-60条)用无菌水洗涤干净的线虫，26 t:孵化8-72小时，隔一定时间用 显微镜观察线虫体壁的分解和线虫的死亡情况。对照分别用50 mM的磷酸盐缓 冲液和加热失活的粗酶样品
2. 将待测蛋白酶液加入纯化的线虫体壁中，每12hr用光学显微镜观察线虫体壁变 化(见图3)，由此再次确定其蛋白酶降解线虫体壁的功能。
根据上述的研究结果，本发明中的基因编码一个可降解线虫体壁、具有杀线虫活性 的胞外侵染性中性蛋白酶。该基因的异源表达产物对线虫尸.re力ViiAS的半致死率为 1.70iig mr24h—'，对线虫及xj^^^AAS的半致死率为2.28ixg mlK且利用该蛋 白酶处理纯化的线虫体壁，可以发现大量线虫体壁被降解的碎片。由于该基因来自细菌， 而细菌又很容易培养，繁殖快。所以该基因能用来研究蛋白酶在侵染线虫过程中的生化 本质，并可作为获得高效生防菌株的靶基因。
中性蛋白酶序列.txt
SEQUENCE LISTING
<110> 云南大学
<120>食线虫芽胞杆菌胞外侵染性中性蛋白酶基因及其应用 <130> 1 <160> 1
<170〉 Patentln version 3. 1
<210> 1
<211> 1566
<212> 腿
〈213〉 Bacillus neaiatocida 〈220〉
〈221〉开放性阅读框架
<222〉 (1)..(1563) <223>
〈220〉
<221>信号肽 〈222〉 (1). . (81) <223〉
<220>
<221> 前肽
〈222> (82).. (663)
<223〉
<220>
<221> 成熟肽
<222> (664).. (1563)
<223>
<300〉
中性蛋白酶序列.txt
<308〉 GenBank/AY708654 <309〉 2006-08-15 〈313> (1)..(1563)
<400〉 1 gtgggtttaggt犯gELaatl:gtctgttgctgtcgccgctt cctttatgagtttaaccatc60
agtcttccgggtgttC3ggCcgctgagaatcctc3gctt3 aag33犯cctgacgaacttt120
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cgggacctttacggctctcaagacgctgcaagcgtagaag cggcctggaatgcagUgga1560
ttgtaa156权利要求
1、一种食线虫芽孢杆菌胞外侵染性中性蛋白酶基因，其特征在于该基因全长1566bp DNA序列，共编码521个氨基酸残基，其中包括27个氨基酸残基的信号肽，194个氨基酸残基的前肽，以及300个氨基酸残基成熟肽。
2、 权利要求1所述食线虫芽孢杆菌胞外侵染性中性蛋白酶基因的应用，其特征在 于该基因能用来研究蛋白酶在侵染线虫过程中的生化本质，并作为获得高效生防菌株的 靶基因。
全文摘要
本发明涉及一种食线虫芽孢杆菌胞外侵染性中性蛋白酶基因及其应用，属于生物技术领域。该基因是从食线虫芽孢杆菌G4中得到，全长1566bp DNA序列，共编码521个氨基酸残基。其中含有27个氨基酸残基的信号肽，194个氨基酸残基的前肽，成熟肽具有300个氨基酸残基。该基因编码的蛋白酶具有解线虫体壁、杀线虫活性；在大肠杆菌BL21中异源表达的重组蛋白也具有蛋白酶活性和杀线虫活性。该胞外侵染性中性蛋白酶基因是食线虫芽孢杆菌侵染线虫过程中的一个重要的毒性因子。该基因用来研究蛋白酶在侵染线虫过程中的生化本质，并作为获得高效生防菌株的靶基因。本发明具有安全性高、环境无污染、杀虫效果佳等优点。
文档编号C12N9/52GK101113455SQ20071006591
公开日2008年1月30日 申请日期2007年5月29日 优先权日2007年5月29日
发明者张克勤, 牛秋红, 黄晓玮 申请人:云南大学