专利名称：一种枯草芽孢杆菌菌株的制作方法
技术领域：
本发明属微生物技术领域，主要是可广谱防治植物不同类型病害及食用菌污染并能促进植物生长的一种细菌菌株。
背景技术：
化学农药是防治植物病害的重要资源，但由于过多、错误使用，有导致农药残毒、环境污染和生态系统破坏之虞。因此，急需寻找一种能替代的、更安全有效的防治方法。尽管很多生防制剂已被证实具有防治作用，但仅有少数几种应用于生产，大部分仍处于研究和探索阶段。而已应用于生产的生防制剂，每种生防制剂一般只能防止少数几种类型的病害，不具有广谱防治能力，促进植物生长的效果不明显。食用菌是我国的一大产业，但生产中食用菌的培养料被木霉菌等丝状真菌污染严重，为了防止污染，生产上主要依靠培养料的高温灭菌和在准备料时添加杀菌剂，这样既增加了成本，又可能在食用菌产品中含有杀菌剂，故有必要寻找一种较安全、有效、经济的方法。然而，尚未见到有用于食用菌的生防制剂的报导。
发明内容
本发明的目的正是为了克服上述现有技术的不足而提供一种可用于防治植物不同类型病害及食用菌污染，并能有效地促进植物生长、生根的枯草芽孢杆菌菌株。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
一种枯草芽孢杆菌菌株，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B9601-Y2，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日2003年6月18日，保藏号CGMCC No.0954。
本发明的B9601-Y2菌落圆形、淡茶褐色、菌落中央颜色略深、隆起、表面光滑；菌体形态杆状、端圆，格兰氏阳性，产生芽孢，周生鞭毛(电镜照片)、具运动性，孢子囊不膨胀，芽胞卵圆形、每个细胞只产一个芽胞、位于菌体细胞中央，0.66×2.10(μm)。
本发明的B9601-Y2菌株培养方式为(1)、液体培养把菌株接种于LB培养基中，在35℃温度下，转速120r/m的摇床上培养2～3天；(2)、固体培养把菌株接种于PSA培养基中，于37℃培养箱中培养3～4天。
本发明的B9601-Y2能够分泌蛋白性抑菌物质，对水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、水稻恶苗病菌、稻曲病菌、小麦根腐病菌、小麦全蚀病菌、小麦雪腐病菌、玉米小斑病菌、蚕豆根腐病菌、马铃薯晚疫病菌、棉花枯萎病菌、棉花红腐病菌、棉花炭疽病菌、油菜菌核病菌、黄瓜炭疽病菌、辣椒炭疽病菌、辣椒疫病菌、烟草赤星病菌、烟草黑胫病菌、苹果轮纹病菌、苹果斑点病菌、香荚兰根腐病菌、优良牧草沙达旺根腐病菌、食用菌中常见污染菌—绿色木霉菌、哈茨木霉菌等重要作物及食用菌上的24种重要病原真菌有很强的抑制作用，其作用机理是分解真菌的细胞壁、裂解原生质膜，使病原真菌细胞质外渗而死亡。
图1是枯草芽孢杆菌B9601-Y2在电子显微镜(12000×)下的形态照片。
实施例从山东省青州市小麦地土壤中分离到枯草芽孢杆菌B9601-Y2，菌株的培养采用两种液体培养基(1)、PS培养基新鲜马铃薯200g煎汁，蔗糖15g，加水1000ml灭菌；(2)、LB培养基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水1000m，灭菌备用。根据培养基不同，生防菌株的培养方式可选用两种(1)、液体培养把生防菌接种于LB或者PS培养基中，在35℃温度下，转速120r/m的摇床上培养2～3d；(2)、固体培养接种于PSA培养基(新鲜马铃薯200g煎汁，蔗糖15g，琼脂17g，加水1000ml灭菌)中，于37℃培养箱中培养3～4天。菌液的制备方法是将液体培养的菌液以清水稀释至所需浓度，用于植物病害防治或促进植物生根、生长和切花保鲜(固体培养的菌体用于菌种的保藏等)。B9601-Y2菌落圆形、淡茶褐色、菌落中央颜色略深、隆起、表面光滑；菌体形态杆状、端圆，格兰氏阳性，产生芽孢，周生鞭毛(电镜照片)、具运动性，孢子囊不膨胀，芽胞卵圆形、每个细胞只产一个芽胞、位于菌体细胞中央，0.66×2.10(μm)。图1是枯草芽孢杆菌B9601-Y2在电子显微镜(12000×)下的形态照片图。
防病效果实验生防菌株B9601-Y2由发明人从实验室分离得到，供试的病原真菌和腐生丝状真菌(见表1)由发明人从实验室分离和他人惠赠。指示菌株的培养采用PSA平板培养基。采用平板对峙培养法在培养皿平板对角线上等距离地接种4个直径为0.6cm的指示菌菌饼，在平板中央接上生防菌株B9601-Y2作为处理，以不接生防菌为对照。接种后于28℃培养箱中培养3～4天，在从靠近平板中央的一端到邻近平板边缘的一端的最大距离作为菌落生长的直径。在接种的第三天测量，菌落没有长出的不测量，菌落长到一起时，视为长满停止测量。每处理3次重复，各重复有4个观察值。表1受抑制的丝状真菌菌株 学名 菌株 学名水稻恶苗病菌 Gibberella fujikuroi 香荚兰根腐病菌F.oxysporum水稻纹枯病菌 Rhizoctonia solani蚕豆根腐病菌 F.solani稻曲病菌 Ustilaginoidea virens 沙达旺根腐病菌Sda1F.solani(sda1)稻瘟病菌 Magnaporthe grisea沙达旺根腐病菌Sda2F.oxysporum(sda2)小麦根腐病菌菌 Bipolaris sorokiniana Trichoderma viride绿色木霉菌株LTR-2LTR-2小麦全蚀病菌 Gaeumannomyces graminisvar.tritici 绿色木霉菌株T2T.viride T2小麦雪腐病菌 Microdochium nivale 绿色木霉菌株F1T.viride F1玉米小斑病菌 Bipolaris maydis 绿色木霉菌株F2T.viride F2马铃薯晚疫病菌 Phytophthora infestans绿色木霉菌株JbT.viride Jb棉立枯丝核菌 R.solani 木霉菌株Th-B T.harzianum Th-BFusarium oxysporum f.sp.
棉花枯萎病菌vasinfectum 串株镰刀菌Fusariumn moniliforme棉花红腐病菌 F.moniliforme 交链孢菌 Alternaria sp.
棉花炭疽病菌 Collectotrichum gosyipii 辣椒镰刀菌Fusarium sp.
油菜菌核病菌 Sclerotinia sclerotiorum 白菜镰刀菌Fusarium sp.
Colletotrichum黄瓜炭疽病菌orbiculare甜瓜镰刀菌Fusarium sp.
辣椒炭疽菌 Colletotrichum capsici枝孢属Cladosporium sp.
辣椒疫病菌 Phytophthora capisci 金针菇Flammulina velutipes烟草赤星病菌 Alternaria alternata 香菇 Lentinus edodes苹果轮纹病菌 Botyosphaeriaberengeriana
促进植物生长作用实验将B9602-Y2在PS培养基中于37℃、120r/m摇床上培养3天。
实验一以培养菌液的10-5浓度处理水稻和小麦，并以10mg/mL的生根粉和用清水为对照。实验证明，10-5浓度能明显增加植株高度和根长，比清水处理增加株高73.12％，增加根长98.31％。对于小麦来说，10-5处理株高比清水增加23.66％，比生根粉增加40.24％，根长相应增加量分别达43.68％和22.55％。
实验二采用10-5菌液、萘乙酸及清水三个处理，取大小相当的红薯苗，直接扦插于装有等量的泥炭和土壤混合基质中，在10天后计算根数和总根长。结果表明，B9601-Y2明显能促进红薯生根，该处理根数比清水增加22.16％，比萘乙酸处理增加13.79％，根长分别相应增加54.03％和5.12％。
实验三以B9601-Y2发酵液和1.5mg/mL的萘乙酸处理，以清水为空白对照，田间试验结果表明，该菌株显著促进了天竺葵生根速度，增加叶片数、叶片轮数、根数和根长。B9601-Y2促进植株生根的时间短于清水空白对照和萘乙酸处理，在扦插第9天时，空白对照的插条还没有任何反应，而B9601-Y2所有插条基部均长出白色突起，萘乙酸处理只有少数插条基部有白色突起，在第12天时，空白对照根始出，且仅1-2条根，B9601-Y2开已长出3-4条根。与空白对照相比，B9601-Y2处理的插条叶片轮数多1.19轮，增加54.09％，叶片数多2.05叶，增加33.17％，根数多6.38根，增65.44％，根长长2.39cm，增29.70％，最大叶片直径大0.25cm。
实验证明，B9602-Y2该菌株能降低马铃薯晚疫病的发病速度，对辣椒疫病的预防效果达82.3％；治疗效果达65.8％，B9601-Y2与泥炭1∶100比例施入甜瓜基部，防治枯萎病效果达到80.03％。且对甜瓜植株有促进生长作用，促进提早开花5-7天。对前述病菌引起的病害有广泛的应用前景。它对食用菌中常见的污染菌—木霉菌也有很强的抑制作用。B9601-Y2具有促进植物生长和生根，提高植物生物量作用。以10万分一至1000万分之一的发酵液拌种能增加水稻和小麦的根长，植株增高，提高红薯、中国石竹、及长春藤生根，提高月季插条生根和长芽，且效果优于目前生产上常用的0.2％生根粉处理。10万分一菌液浇灌培养基质时，水稻株高和根长分别比生根粉与清水提高49.75％与73.12％和69.81％与98.31％，10万分之一发酵滤液浇灌培养基质时，水稻株高和根长比生根粉与清水处理提高61.50％与86.71％和95.65％与128.47％。同样浓度的菌液处理小麦时，株高和根长分别比生根粉与清水处理提高40.24％与23.66％和22.55％与47.68％；处理红薯插条时，根数和根长分别比1.5mg/mL萘乙酸与清水处理增加13.79％与22.16％和5.12％与54.03％。以蘸取菌液扦插时，天竹葵叶片轮数、叶数、根数和根长分别比1.5mg/mL萘乙酸与清水增加10.06％与54.09％，5.92％与33.17％，10.33％与65.44％和5.38％与29.70％。以10万分之一发酵液和滤液扦插长春藤时，促进根长比萘乙酸和清水空白对照增加321.09％和681.25％，285.71％和631.25％。以菌液蘸月季插条，其能促进腋芽长度比清水对照增加137.45％-200.49％，根数和总根长比0.2％生根粉与清水处理分别达41.67％与112.20％和187.29％与230.21％。此外，该菌株10万分一至1000万分之一的发酵液扦插月季鲜切花，能明显延长切花在瓶中保鲜期5-7天。对水稻稻瘟病菌、纹枯病菌、小全蚀病菌、小麦雪腐病菌、棉花枯萎病菌、红腐病菌、炭疽病菌、油菜菌核病菌、烟草赤星病菌、烟草黑胫病菌、苹果轮纹病菌、蚕豆根腐病菌、优良牧草沙达旺根腐病菌等24种重要植物病原真菌都有明显抑制作用，特别是对水稻稻瘟病菌、纹枯病菌、小麦根腐病菌、小麦全蚀病菌、烟草黑胫病菌、油菜菌核病菌等有极佳的抑制效果，这些病菌几近在培养基上不能生长。B9601-Y2还对引起食用菌绿霉病的绿色木霉和哈茨木霉菌也有明显的抑制作用，此外，该菌株还对常见于植物表面次生菌株交链孢菌和镰刀菌均有显著抑制作用，从而有减轻植物次生病原协助发病的作用。
B9601-Y2是一个来自土壤的芽孢杆菌，它与植物根部关系密切，且对许多土传植物病原物具有较好的控制作用、兼顾植物促生长和月季切花保鲜作用，能耐贮藏、抗逆性好，重新施入环境中也不会导致环境污染，具有很好的开发前景。
权利要求
1.一种枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B9601-Y2，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日2003年6月18日，保藏号CGMCC No.0954。
2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，B9601-Y2菌落圆形、淡茶褐色、菌落中央颜色略深、隆起、表面光滑；菌体形态杆状、端圆，格兰氏阳性，产生芽孢，周生鞭毛(电镜照片)、具运动性，孢子囊不膨胀，芽胞卵圆形、每个细胞只产一个芽胞、位于菌体细胞中央，0.66×2.10(μm)。
3.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，B9601-Y2菌株培养方式为(1)、液体培养把菌株接种于LB或PS培养基中，在35℃温度下，转速120r/m的摇床上培养2～3天；(2)、固体培养把菌株接种于PSA培养基中，于37℃培养箱中培养3～4天。
全文摘要
一种枯草芽孢杆菌菌株，属于微生物技术领域，将其命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B9601－Y2，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日2003年6月18日，保藏号CGMCC No.0954。本发明的枯草芽孢杆菌B9601－Y2，可用于防治植物不同类型病害及食用菌污染，并能有效地促进植物生长和生根，对许多土传植物病原物具有较好的控制作用、兼顾月季切花保鲜作用，能耐贮藏、抗逆性好，重新施入环境中也不会导致环境污染。
文档编号C12N1/20GK1554744SQ20031010419
公开日2004年12月15日 申请日期2003年12月28日 优先权日2003年12月28日
发明者何月秋, 马平 申请人:何月秋