专利名称：一种枯草芽孢杆菌脂肪酶及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子酶 学与生物技术，具体涉及一种高活力脂肪酶的编码基因，同时 涉及该突变基因编码的脂肪酶蛋白的制备方法。高酶活脂肪酶突变株蛋白可以广泛应用于 食品、能源、化工和医药等行业。
背景技术：
脂肪酶(Lipase，Ε. C. 3. 1. 1. 3)，全称为三酰基甘油酰基水解酶 (triacylglycerolacylhydrolase)，它属于α/β折叠酶家族，是一种丝氨酸水解酶。脂肪 酶的催化遵循丝氨酸水解酶的反应机制，能够在油水界面上将甘油三酯完全水解成脂肪酸 和甘油，因而脂肪酶能够催化脂水解、脂合成和脂交换等多种反应，被应用于油脂处理、洗 涤齐U、食品加工、精细化工、制药、造纸等多种行业。脂肪酶在动植物的各种组织及微生物中普遍存在，是生物体内脂代谢不可缺少的 重要水解酶。人们于1834年首先在动物胰脏发现脂肪酶的活性，至今已有近二百年的历 史。1871年报道了植物种子脂肪酶，而上世纪初人们从微生物中也发现了脂肪酶。由于微 生物脂肪酶种类多，具有比动植物脂肪酶更广的反应PH值、反应温度以及对底物的反应专 一性，又便于进行工业化生产和获得高纯度的酶制剂，再加上微生物脂肪酶在理论研究和 实际应用中都非常重要，因此它们在研究和应用上的进展相当迅速。产生脂肪酶的微生物 种类很多，如黑曲霉、白地霉、毛霉、荧光假单胞菌等，它们所产生的脂肪酶相继获得结晶。 其它如无根根霉、圆柱形假丝酵母、耶尔氏球拟酵母、粘质色杆菌等来源的脂肪酶也相继得 到高度提纯，并对它们的理化性质开展了进一步的研究。尽管产脂肪酶微生物容易发现，但寻找适合于工业规模生产的脂肪酶产生菌及其 发酵条件却非常困难。在通过传统诱变育种以及优化发酵条件提高脂肪酶产量方面已经开 展了大量的工作，并使得许多脂肪酶实现了工业化生产。近年来随着基因操作技术的深入 发展和应用，人们能够越来越多的通过直接对酶基因的改造，获得更适合于生产实践需求 的脂肪酶制剂。在众多的脂肪酶中，枯草杆菌脂肪酶Lip A作为一种细菌来源的脂肪酶，具 备许多优良的性质，如分子量小，催化活力高，底物范围广，是一种嗜碱性脂肪酶等，因此其 具有较好的食品工业及化学工业等方面的应用潜力。但是，由于枯草杆菌脂肪酶高浓度时 容易聚集，给其纯化和应用带来很大困难，所以通过改造Lip Α，得到高酶活突变株，使其在 低浓度范围就具有高催化活性，具有重大意义。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种高酶活脂肪酶突变株蛋白的编码基因 LipA(I12V/L140F/D144E)，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列以及所述的序列编码的突 变酶，该突变酶具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。通过重叠PCR引入突变，连接于表 达载体，获得高活力脂肪酶产生菌(Escherichia coli)BL21/pET28a_/Lip A ^0-H1 (112V/ L140F/D144E)，生产高活力突变体脂肪酶。该突变酶的酶活是野生型的三倍。
本发明的另一个目的是在于提供了一种枯草芽孢杆菌脂肪酶的制备方法，该方法 是构建大肠杆菌表达系统，利用亲和层析方法纯化高酶活脂肪酶突变株蛋白。该方法简便， 成本低廉。本发明的再一个目的是在于提供了一种枯草芽孢杆菌脂肪酶在洗涤剂工业中的 应用。该突变体蛋白对不同碳链长度的底物的催化活性是野生型的3倍以上，往洗涤剂 中添加时在保证相同催化功效的前提下，与野生型酶制剂相比可以有效减少酶制剂的使用 量，从而避免脂肪酶高浓度应用容易发生聚集而降低催化效率，提高洗涤剂的去污能力。为了实现上述任务，本发明采用以下技术措施本发明的第一个目的是提供一种核苷酸序列，该序列编码一种高酶活脂肪酶突变株蛋白，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，其特征是在于野生型脂肪酶结构基因上具有 34位的A突变为G (I12V)，420位的A突变为T (L140F)，432位的T突变为G (D144E)的点突变。一种高酶活脂肪酶突变株蛋白的制备方法，其步骤是1.突变脂肪酶LipA(I12V/L140F/D144E)突变点的引入(1)设计诱变引物，采用重叠PCR法依次在脂肪酶基因上把野生型Lip A基因上 34位的A突变为G(I12V)，420位的A突变为T (L140F)，432位的T突变为G(D144E)；(2)上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶BamHI和Hind III进行酶 切，与经过相同酶切的质粒pET28a(+)(购自Novagen公司)片段连接后，转化大肠杆菌 BL21(DE3)(购自Novagen公司)感受态细胞，获得的酶在大肠杆菌菌株(Escherichia coli)BL21/pET28a-/Lip Af10-H1 (I12V/L140F/D144E)中的表达；2.鉴定重组质粒pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)用酶切、PCR方法对重组质 粒进行鉴定，并测序检验，一种分离的蛋白质(一种高活性脂肪酶的编码基因)，其编码基 因为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，本发明所述的编码高酶活脂肪酶突变株蛋白的基因Lip A(I12V/L140F/D144E), 具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，有以下特征1.本发明所用的脂肪酶野生型基因来自枯草芽孢杆菌，结构基因长度为546bp。2.具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，与野生型相比在此结构基因上具有三 处点突变，即34位的A突变为G(I12V)，420位的A突变为T(L140F)，432位的T突变为 G(D144E)。3.基因Lip A(I12V/L140F/D144E)编码的脂肪酶蛋白对不同碳链长度的底物 (C4-C16)的催化活性是野生型的3倍以上，并与野生型酶具有相似的热稳定性。本发明的高酶活脂肪酶突变株蛋白可用如下方法生产。该方法包括以下具体的 操作按照常规实验条件，如《分子克隆实验手册》(第三版)J.萨姆布鲁克等编著，2003， 北京科学出版社中所述的条件进行。1.突变脂肪酶Lip A(I12V/L140F/D144E)突变点的引入(1)设计诱变引物，采用重叠PCR法依次在脂肪酶基因上把野生型Lip A基因上 34位的A突变为G (I12V)，420位的A突变为T (L140F)，432 位的 T 突变为 G(D144E)；(2)上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶BamHI和Hind III进行酶切，与经过相同酶切的质粒pET28a(+)片段连接后，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得 大肠杆菌菌株(Escherichia coli)BL21/pET28a_/Lip A ^0-H1 (112V/L140F/D144E)；2.鉴定重组质粒pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)用酶切、PCR方法对重组质 粒进行鉴定，并测序检验，由此得到具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。3.将大肠杆菌 BL21(DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)单克隆子转到 5ml 含有卡 那霉素的液体LB培养基中培养过夜，次日取过夜培养物2.5ml以(ν/ν)的接种量转接 到250ml的液体培养基中在37°C的条件下振荡培养至0D600为0. 6，加入IPTG至终浓度为 0. 4mM，控制温度在18°C进行突变蛋白的诱导表达；4.将诱导培养的菌体以SOOOrpm在4°C冷冻离心机中离心，弃掉上清，收集菌体。 以Mili-Q级水、平衡缓冲液分别洗涤菌体一次，洗去菌体上残留的培养基。将250ml的菌体 以25ml的平衡缓冲液重悬，以超声波处理菌液30min，至菌液澄清。在4°C冷冻离心机中， IOOOOrpm下离心菌液30min，取上清，弃杂质。将上清经0. 45 μ m的滤膜过滤，即得粗酶液；5. LipA(I12V/L140F/D144E)突变体蛋白的纯化采用金属螯合的亲和层析法，粗酶 液经过亲和纯化，即可得到具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的高酶活脂肪酶突变株蛋 白；6.采用SDS-PAGE方法检测突变蛋白的纯度；7.将脂肪酶底物融入异丙醇中配成25mM的母液，稀释酶液至10μ g/ml。反应在 pH8. 0的磷酸缓冲液(部分长链底物需加0. 1% (ν/ν)阿拉伯胶作乳化剂)中进行，底物终 浓度为0. 5mM，反应温度为37°C，200ul体系中含5μ 1稀释酶液。用酶标仪监测0D405在 Imin内的变化，检验突变脂肪酶的活性。注以上提到的LB培养基配方如下LB液体培养基(w/w)胰蛋白胨，0. 5% (w/w)酵母抽提物，(W/W)NaCl，用 蒸馏水配置，调节pH至7. 0，在1. 034X105Pa高压下蒸气灭菌20分钟。LB固体培养基在上述LB液体培养基的基础上再加1. 5-2. 0% (w/w)琼脂。发酵产酶培养基在LB培养基中加卡那霉素至终浓度为0. 4mM即可。本发明获得的一种枯草芽孢杆菌脂肪酶在食品、能源、化工和医药等行业有着广 泛的应用前景。在食品工业中脂肪酶可以用于油脂改性、乳酪的熟化和后期风味的强化等； 在化工工业中脂肪酶可以用于绢纺、皮毛、皮革、明胶等的脱脂、添加到洗涤剂中增加洗涤 剂的去污能力等；在医药行业中脂肪酶可作为帮助消化、降低血脂、治疗局部炎症的药物、 作为临床诊断脂血病、胰腺炎等疾病的依据及进行消旋体药物的生物法手性拆分等。脂肪 酶在洗衣粉中的应用过程如下
在洗衣粉中加入5_500U/g的脂肪酶，脂肪酶能催化分解衣物油污成甘油二脂、甘 油单脂及脂肪酸等较易溶于水的物质，从而显著提高洗衣粉的洗涤效果，尤其是去除黄斑 的效果。在洗衣粉添加脂肪酶的优势是能有效提高洗衣粉的去污能力，并降低直链烷基苯 磺酸盐、脂肪醇硫酸盐、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸盐、烷基磺酸盐等表面活性剂和三聚磷酸钠 的用量，减少去污剂对环境的污染。本发明所述的高酶活脂肪酶突变株蛋白的优势之一在 于其酶活是野生型的3倍以上，可以有效减少酶制剂的使用量，从而降低含酶洗衣粉的成 本。优势之二在于低剂量的酶制剂应用可以避免脂肪酶高浓度应用容易发生聚集而降低催 化效率，保证洗涤剂的油脂去污能力。
所述的大肠杆菌表达载体pET28a(+)和大肠杆菌菌株BL21 (DE3)均购自Novagen 公司。所述重组质粒pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)为本发明所构建。所述的重组大 肠杆菌菌株BL21(DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)是具有质粒pET28a_Lip A(I12V/L140F/ D144E)的大肠杆菌菌株，保藏编号CCTCC NO :M2010058，保藏单位中国典型培养物保藏 中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏日期2010年3月15日，分类命名大肠杆菌 (Escherichiacoli)BL21/pET28a-/Lip A (I12V/L140F/D144E)。所述的编码基因 Lip A(I12V/L140F/D144E)是具有SEQUENCE NO. 1的核苷酸序列的高酶活脂肪酶突变株蛋白编 码基因。所述的蛋白Lip A(I12V/L140F/D144E)是具有SEQUENCE NO. 2的氨基酸序列的高 酶活脂肪酶突变株蛋白。一种分离的蛋白质，其序列为SEQUENCE NO. 2所示的氨基酸序列。本发明的优点和效果本发明中提供的脂肪酶突变株的核苷酸序列和蛋白质序列是一种脂肪酶高酶活 突变株的基因和蛋白质序列，未见报道。本株脂肪酶突变株蛋白对不同碳链长度的底物的 催化活性酶活是野生型酶活的3倍以上，同时45°C以下具有良好的热稳定性，符合实际应 用的要求。而脂肪酶在食品、化工和医药等领域有着广泛的应用，因此，获得高酶活的脂肪 酶，具有很高的实用价值。特 别是脂肪酶高浓度应用时容易聚集，影响催化效率。而该高酶 活突变株可以在低浓度范围提供高催化活性，即达到相同催化效力，酶的添加量仅为野生 型的三分之一，有效避免高浓度应用酶发生聚集的问题。
图1为一种重组质粒的构建示意图(1)用PCR方法扩增出Lip A基因；(2)设计诱变引物，采用PCR定点突变法依次在脂肪酶基因上把野生型Lip A基因 上34位的A突变为G(I12V)，420位的A突变为T(LHOF)，432位的T突变为G(D144E)；(3)上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶BamHI和Hind III进行酶切， 与经过相同酶切的质粒pET28a(+)片段连接后，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得 获得重组质粒 pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)；图2 为一种重组表达质粒 pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)的 PCR 鉴定(a)和 酶切鉴定(b)结果示意图(1%琼脂糖凝胶电泳)。如图2(b)所示，以上下游引物扩增出的条带大小为546bp，与LipA结构基因大小一致。表达载体pET28a(+)大小为5369bp，插入的Lip A结构基因大小为546bp，将重 组表达质粒pET28a-LipA(I12V/L140F/D144E)用BamHI和Hind III双酶切，电泳结果如 图2(b)中所示，得到大小分别约为5360和550bp的两个片段，与推测值一致。以上结果 证明高酶活脂肪酶突变株蛋白编码基因Lip A(I12V/L140F/D144E)已克隆到表达载体 pET28a (+)，重组表达质粒 pET28a-LipA (I12V/L140F/D144E)构建成功。图3为一种纯化后的重组大肠杆菌菌株(Escherichia coli) BL21/pET28a_/Lip A f10-H1(I12V/L140F/D144E)诱导表达产生的高酶活脂肪酶突变株蛋白示意图(10% SDS-聚 丙烯酰胺凝胶电泳检测)脂肪酶分子量约为21kDa，与结果相符。
图4为一种突变酶与野生型的热稳定性比较将野生型和突变株酶液分别置于45°C和50°C下，每隔十分钟取样测定剩余酶活， 评价了酶的热稳定性。如图4(a)所示，在45°C中水浴中水浴保存1小时内，野生型和突变 株酶活都没有明显损失。50°C中水浴保存20分钟后，突变株Lip A(I12V/L140F/D144E)的 酶活开始下降，1小时后其剩余酶活为原来的60%左右；野生型在50°C水浴30分钟后，酶 活也开始下降，但下降幅度较小，1小时后野生型仍可保留80%以上的活性，见图4(b)。总 体而言，高酶活脂肪酶突变株蛋白Lip A(I12V/L140F/D144E)具有良好的热稳定性，能够满 足实际应用的需要。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。实施例中的实验方法，均按常规 条件进行，具体参考《分子克隆实验指南》(作者J.萨姆布鲁克等，第三版，2003年，科学出 版社)中所述实验方法。实施例1.高酶活脂肪酶突变株蛋白的获得图1显示了重组突变脂肪酶基因的构建原理和过程。天然的脂肪酶为单体蛋白， 含181个氨基酸，基因长为546bp。一种高酶活脂肪酶突变株蛋白的制备方法，其步骤是1.突变酶Lip A(I12V/L140F/D144E)编码基因中突变点的引入(1)设计诱变引物，采用重叠PCR法在Lip A基因上依次把野生型Lip A基因上 34位的A突变为G(I12V)，420位的A突变为T(L140F)，432位的T突变为G(D144E)。设计脂肪酶定点突变所需引物序列上游引物5‘ -ATTAGGATCCGCTGAACACAATCCAGTCGTTATGG-3 ‘下游引物5‘ -TATA AAGCTTTTAATTCGTATTCTGGCCCCCG-3 ‘定点突变引物12V-1 5'-ATGCCCCTCCAACACCGTGAAC-3
12V-2 5'-GTTATGGTTCACGGTGTTGGAG-3
140F-15'-CTAATCTTGAAAAGTAATTC-3‘
140F-25'-GTCATGAATTACTTTTCAAG-3‘
144E-15'-CGTTTCTAGCACCCTCTAATC-3
144E-25'-TTCAAGATTAGAGGGTGCTAG-3以野生型脂肪酶基因片段为模板，用上游引物与引物12V-1为PCR引物，扩增出约 56bp 的基因片段。PCR 循环条件:94°C 5min ；94°C 30sec，52°C 40sec，72°C 40sec，30 个循 环；72°C 5min。PCR扩增产物经1. 8% (w/w)琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。另外，此56bp的 基因片段也可通过核苷酸片段的合成来直接获得。用下游引物与引物12V-2作为PCR反应的引物，以野生型脂肪酶基因片段为模板， 扩增出 520bp 的基因片段。PCR循环条件:94°C 5min ；94°C 30sec，52°C 40sec，72°C 60sec, 30个循环；72°C 5min。PCR扩增产物经1. 2% (w/w)琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。将以上得到的两种PCR产物混合，加入上、下游引物再次进行PCR，PCR反应条件 为94°C 5min ；94°C 30sec,50°C 60sec，72°C 60sec，30 个循环；72°C lOmin。PCR 扩增产物经1.2% (w/w)琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。得到含有突变位点I12V的脂肪酶基因片段。以突变体I12V脂肪酶基因片段为模板，分别以上游引物与引物140F-1作为一对 PCR引物，下游引物与引物140F-2作为一对PCR引物，通过两次PCR操作，分别获得大小约 为430bp和130bp的PCR产物。然后将两种PCR产物混合，加入上、下游引物再次进行PCR， 获得含有突变位点I12V和L140F的脂肪酶基因片段Lip A(I12V/L140F)。以突变体Lip A(I12V/L140F)为模板，分别以上游引物与引物144E-1作为一对 PCR引物，下游引物与引物144E-2作为一对PCR引物，通过两次PCR操作，分别获得大小约 为440bp和120bp的PCR产物。然后将两种PCR产物混合，加入上、下游引物再次进行PCR， 获得含有突变位点I12V、L140F和D144E的脂肪酶基因片段Lip A(I12V/L140F/D144E)。(2)上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶BamHI和Hind III进行酶切， 用T4连接酶与经过相同酶切的质粒pET28a(+)片段连接，16°C连接过夜后连接产物转化大 肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用卡那霉素-LB平板筛选得到阳性菌落，经过鉴定(见下一 步骤)，命名为大肠杆菌菌株 BL21(DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)；2.质粒 pET28a_Lip A(I12V/L140F/D144E)的鉴定用质粒抽提试剂盒从阳性菌落BL21 (DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)培养物中分 别提取质粒pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)，分别采用酶切和PCR方法对重组质粒进行 鉴定。以上下游引物进行PCR，扩增出的条带大小约为546bp，如图2(a)，与预期大小相符。 与Lip A结构基因大小一致。用BamHI和Hind III双酶切，电泳结果如图2(b)中所示，得到大小分别约为5360 和550bp的两个片段，与实验结果基本一致。质粒上Lip A(I12V/L140F/D144E)基因的序列测定由英俊(invitrogen)生物技 术有限公司进行。测序引物是利用质粒pET28a(+)上的通用引物，测序结果表明获得的Lip A(I12V/L140F/D144E)基因序列与预期设计完全一致，由此得到具有SEQ ID NO. 1所示序列 的高酶活脂肪酶突变株蛋白编码基因Lip A(I12V/L140F/D144E)。一种分离的蛋白质，其编 码基因为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。Lip A(I12V/L140F/D144E)基因全长546nt，编 码181个氨基酸的蛋白。将产生的质粒命名为(Escherichia coli)BL21/pET28a_/Lip A 40-氏(112乂/114(^/1)144￡)。4.重组质粒 pET28a_Lip A(I12V/L140F/D144E)的提取将BL21(DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)接种到 LB 培养基，37°C过夜培养，用质 粒抽提试剂盒提取质 pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)。4.突变体蛋白 Lip A(I12V/L140F/D144E)的诱导表达；将大肠杆菌BL21(DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)单克隆子转到5ml含有卡那 霉素的液体LB培养基中培养过夜，次日取过夜培养物2.5ml以(v/v)的接种量转接到 250ml的液体培养基中在37°C的条件下振荡培养至0D600为0. 6，加入IPTG至终浓度为 0. 4mM，控制温度在18°C进行突变蛋白的诱导表达5.突变体蛋白 LipA(I12V/L140F/D144E)酶液的提取；将诱导培养的菌体以SOOOrpm在4°C冷冻离心机中离心，弃掉上清，收集菌体。以 Mili-Q级水、平衡缓冲液分别洗涤菌体一次，洗去菌体上残留的培养基。将250ml的菌体 以25ml的平衡缓冲液重悬，以超声波处理菌液30min，至菌液澄清。在4°C冷冻离心机中，lOOOOrpm下离心菌液30min，取上清，弃杂质。将上清经0. 45 y m的滤膜过滤，即得粗酶液；6.突变体蛋白 Lip A(I12V/L140F/D144E)的纯化；采用金属螯合的亲和层析法，具体采用GE公司的预装柱His Trap FF 1ml，在 ATKA系统上进行。粗酶液经过亲和纯化，即可得到具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的 高酶活脂肪酶突变株蛋白。一种分离的蛋白质，其序列为SEQUENCE NO. 2所示的氨基酸序 列。实施例2 突变体蛋白Lip A(I12V/L140F/D144E)的活性检测及其他酶学性质分析。将不同碳链长度的各种底物融入异丙醇中配成25mM的母液。将酶液用反应缓冲 液稀释成10 U g/ml。反应在pH8. 0的磷酸缓冲液(部分长链底物需加0. 1 % (v/v)阿拉 伯胶作乳化剂)中进行，反应温度为37°C，200ul体系中含5iU稀释酶液，底物终浓度为 0. 5mM，利用酶标仪监测0D405在lmin内的变化。酶活单位定义为在37°C下，每分钟产生 1 U mol对硝基苯酚所需要的酶量。 热稳定性分析催化活性提高的突变体有时会伴随热稳定性的降低，将野生型和突变株酶液分别 置于45°C和50°C下，每隔十分钟取样测定剩余酶活，评价了酶的热稳定性。如图4 (a)所示， 在45°C中水浴中水浴保存1小时内，野生型和突变株酶活都没有明显损失。50°C中水浴保 存20分钟后，突变株Lip A(I12V/L140F/D144E)的酶活开始下降，1小时后其剩余酶活为 原来的60%左右；野生型在50°C水浴30分钟后，酶活也开始下降，但下降幅度较小，1小时 后野生型仍可保留80%以上的活性，见图4(b)。总体而言，高酶活脂肪酶突变株蛋白Lip A(I12V/L140F/D144E)具有良好的热稳定性，能够满足实际应用的需要。实施例3 一种枯草芽孢杆菌脂肪酶在洗涤剂中的应用。将突变体蛋白Lip A(I12V/L140F/D144E)以5_500U/g的脂肪酶剂量添加到洗衣 粉中，该蛋白能催化分解衣物油污成甘油二脂、甘油单脂及脂肪酸等较易溶于水的物质，从 而显著提高洗衣粉的洗涤效果，尤其是去除黄斑的效果。在洗衣粉添加脂肪酶的优势是能 有效提高洗衣粉的去污能力，并降低直链烷基苯磺酸盐、脂肪醇硫酸盐、脂肪醇聚氧乙烯醚 硫酸盐、烷基磺酸盐等表面活性剂和三聚磷酸钠的用量，减少去污剂对环境的污染。本发明 所述的高酶活脂肪酶突变株蛋白的优势之一在于其酶活是野生型的3倍以上，可以有效减 少酶制剂的使用量，从而降低含酶洗衣粉的成本。优势之二在于低剂量的酶制剂应用可以 避免脂肪酶高浓度应用容易发生聚集而降低催化效率，保证洗涤剂的油脂去污能力。
权利要求
一种枯草芽孢杆菌脂肪酶，其特征在于该酶在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-/Lip A f10-H1(I12V/L140F/D144E)中表达，CCTCC NOM2010058。
2.一种分离的蛋白质，其编码基因为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
3.一种分离的蛋白质，其序列为SEQUENCE NO. 2所示的氨基酸序列。
4.权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌脂肪酶在洗涤剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌脂肪酶及制备方法和应用，一种枯草芽孢杆菌脂肪酶，大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-/Lip A f10-H1(I12V/L140F/D144E)，CCTCC NOM2010058。这种高活力脂肪酶突变体的编码基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其步骤是第一是通过PCR扩增出枯草芽孢杆菌脂肪酶Lip A结构基因；第二是设计3对诱变引物，通过重叠PCR将突变引入脂肪酶Lip A基因；第三获得高活力脂肪酶产生菌BL21(DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)；第四是在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白；第五是纯化蛋白。一种枯草芽孢杆菌脂肪酶在洗涤剂工业中的应用。本发明方法易行，成本低廉，高酶活脂肪酶突变株蛋白在食品、能源、化工和医药等行业具有重要应用价值。
文档编号C12N9/20GK101857856SQ201010187108
公开日2010年10月13日 申请日期2010年5月25日 优先权日2010年5月25日
发明者危宏平, 周亚凤, 崔宗强, 张先恩, 张治平, 王晓英, 王殿冰 申请人:中国科学院武汉病毒研究所