生产脂肪酶的方法

专利名称：生产脂肪酶的方法
技术领域：
本发明涉及新的蛋白质，尤其是具有蛋白酶活性的蛋白质，其促进细
菌(尤其是伯克霍尔德氏菌属(5"rMoWmVi))产生细胞外脂肪酶，本发明涉 及编码它们的核酸序列、包含它们的表达构建体、以它们转化的宿主、具 有蛋白酶活性的蛋白质的生产方法，也涉及生产脂肪酶的方法，尤其是通 过伯克霍尔德氏菌属细菌。
背景技术：
蛋白酶广泛存在于自然界，并具有很多生理功能。它们是降解酶，其 催化肽键的切割。细胞外蛋白酶将大蛋白质切割成小分子以利于随后的吸 收，而细胞内蛋白酶则在代谢调控中起重要作用。它们的蛋白水解活性包 括例如通过激活限制性蛋白水解酶的酶原形式，分泌蛋白穿过膜的加工和 运输，或通过降解调控蛋白质或修饰核糖体蛋白质而调节基因表达[16。
在2000年，在铜绿假单胞菌(/^M^附卵"s flemg/朋^i)基因组中鉴定 出多种蛋白酶，其与大肠杆菌(五sc/^Wc&Vi co/i)的蛋白酶DegP、 Prc、 proteaseIII和SohB显示显著的同源性。在铜绿假单胞菌基因组中相应的 基因失活以后，在上清液中，3个突变体展现较高的脂肪酶活性，而l个 突变体展现较低的脂肪酶活性。进一步实验显示LipAB操纵子的基因表达 没有受到影响，这证实了这些蛋白酶影响铜绿假单胞菌中脂肪酶LipA的 折叠和/或分泌[241。
荚壳伯克霍尔德氏菌(5"/^^/fifeW"g/M附"e)是植物病原体，其引起稻类
植物枝条和圆锥花序上的外壳腐烂和发霉。正如许多其它的细菌，荚壳伯 克霍尔德氏菌产生细胞外脂肪酶(EC 3.1.1.3)，在多种生物技术应用中证明该脂肪酶是有用的[18。
因此需要此种脂肪酶的高产量生产。为了构建合适的过表达菌林，需 要鉴定可能的脂肪酶生产中的薄弱环节。这些薄弱环节预期为基因表达水 平，以及酶的折叠和分泌到培养液中。
因此，本发明要解决的问题是找到促进荚壳伯克霍尔德氏菌生产细胞 外脂肪酶的方法。
发明概述
上述问题通过补充蛋白质来解决，该蛋白质包含蛋白酶活性，其对荚 壳伯克霍尔德氏菌中脂肪酶IipA的表达和/或折叠和分泌具有有益的影响。
根据本发明，首先用具有广泛宿主特异性的pLAFR3载体构建荚壳伯 克霍尔德氏菌PG1的黏粒文库[20]。筛选约2500个克隆以后，鉴定出15 个对脂肪酶生产有影响的勦粒。2个縣粒的相应DNA片段,皮亚克隆到有广 泛宿主特异性的载体中，获得5个不同的质粒。这些质粒在荚壳伯克霍尔 德氏菌中表达产生具有增强脂肪酶活性的克隆。在相应DNA片段测序之 后，使用国家生物技术信息中心(NCBI)的开放读码框检索程序(ORF查寻) 来鉴定开放读码框(ORFs)。最长的ORF包含540个碱基对，该ORF和由 其得到的氨基酸序列包含在ThiJ/PfpI-G家族可以找到的保守结构域。该 家族包含多种蛋白质，例如蛋白酶、转录调控因子、RNA-结合蛋白质或分 子伴侣[3。因此推测该ORF编码迄今仍未表征的蛋白质，其组成对于荚 壳伯克霍尔德氏菌中脂肪酶lipA的表达和/或折叠和分泌具有有益影响的 细胞质蛋白酶。
附图描述
附图显示


图1编码来自荚壳伯克霍尔德氏菌的蛋白酶的ORF与数据库中蛋白 质的多重序列比对。首先，提交蛋白酶的氨基酸序列进行序列相似性检索， 使用具有BLOSUM62矩阵的EBL-EMBI中的WU-BLAST2程序。随后
选出与蛋白酶具有高度相々乂性的蛋白质，用于使用EBL-EMBI的 Db-Clustal构建多重序列比对。在比对的所有序列中一致的残基列以星号 标出。冒号代表保守取代。半保守的取代用单个点标出。根据本发明的蛋 白酶在第一行显示。下面的行显示Q8XA99:来自大肠杆菌的假定蛋白 质yhbO。
Q7CPQ5:来自鼠伤寒沙门氏杆菌(^1/附^me〃fl印尸/ 附",/"附)的 假定细胞内蛋白酶XHBO 。 Q8XH07:来自鼠伤寒沙门氏杆菌的假定蛋白 质STY3452。 Q5WER6:来自克劳氏芽孢杆菌(B"c〃/ws c/""w7)的一般应激 蛋白GSP18。 Q65MG4:来自地衣芽孢杆菌(JS. //c/^i/o/7ms)的YfkM。 Q9K8I1:来自嗜碱芽孢杆菌(凡/m/M"ni"s) BH3025的一般应激蛋白。 Q370CX9:来自蜡状芽孢杆菌(B. (ATCC 10987菌林)BCE0935的
ThiJ/P印I-家族蛋白质。Q65FG2:蛋白酶I，来自蜡状芽孢杆菌的ThiJ/Pfpl-家族蛋白质。PFI—PYRHO:来自掘越氏热球菌(/V^o ccws/^n7^s/i") OT3 的蛋白酶I 。 PFPI —PYRFU:来自强烈炽热J求菌/",'/mw"的蛋 白酶I。
图2根据本发明使用的质粒构建体的质粒类型，即图2A中的质粒 plTpro和图2B中的质粒pBBRpro。
图3在多种质粒的表达中观测的相对脂肪分解活性，这些质粒包含来 自荚壳伯克霍尔德氏菌PG1的亚克隆DNA。误差线显示来自4个独立实 验的标准差。脂肪酶活性以对硝基苯基棕榈酸酯作为底物用分光光度计测 定，并用相对于野生型菌抹的相对脂肪分解活性表示[21。用空的表达载 体pBBRl mcs作为对照。包含根据本发明蛋白酶的基因的质粒pBBRPG8/1 的表达导致脂肪酶活性增加20-30%。
图4质粒pBBRPPG 5/1、 5/3、 5/7、 8/1和8/3用限制性内切酶Xbal 和HincII进行限制性分析。分出1 pg DNA，将其应用于0.8%琼脂糖凝胶。 DNA分子量参照标记物从英杰(Invitrogen)获得。
图5在荚壳伯克霍尔德氏菌PG1 (a)和LU8093 (b)中假定蛋白酶的同 源表达。在4个独立的实验中使用PG培养基进行表达，在培养基中含有 1%橄榄油作为产生脂肪酶的谦导物。24小时以后，收集培养物并测定ODS8Q。细胞外脂肪酶活性用对硝基苯基棕榈酸酯作为底物用分光光度计测 定(根据Winkler等人，1978 [31)。通过A410/min与OD580的相关性来计算 相对脂肪分解活性。作为对照的菌林也用空载体pBBRlmcs转化，并在相 同时间检测。
图6根据本发明的蛋白酶在大肠杆菌BL12DE3中过表达。在0、 2 和4小时(T。、 T2、 T4)之后取样，并且以15。/oSDS-PAGE分离。用考马斯 蓝R-250将凝胶染色。l泳道蛋白质标准M12(Invitrogen)， 2泳道T。 BL21DE3 pET22b， 3泳道T。 BL21DE3 pETpro, 4泳道T2 BL21DE3 pET22b, 5泳道T0 BL21DE3 pETpro, 6泳道T4 BL21DE3 pET22b, 7泳道T4 BL21DE3 pETpro。
图7每个纯化步骤的SDS-PAGE分析。1泳道:蛋白质标准PageRuler (Fermentas)， 2泳道10 jil细胞裂解液(1:5)， 3泳道lOpl过滤液，4泳 道10pl清洗级分，5泳道10 jil洗脱液(1:13)。
发明详述
1.优选实施方案
本发明的第一主题涉及蛋白质，其特征在于具有至少一种如下性质
a) 具有包含共有序列AICHGP (SEQ ID NO: 7)的^J^酸序列
b) 没有螺旋-转角-螺旋(HTH)DNA-结合结构域；
c) 通过变性条件下的SDS-PAGE确定分子量约为20-22 kDa。
例如，特征a)、 b)和c)的l个或2个或3个可以以任何组合呈现，并 且尤其是这些特征可以同时存在。
此外，根据本发明的蛋白质具有蛋白酶活性。
优选根据本发明的蛋白质pl值在5.4-5.5范围内。它们可以从伯克霍 尔德氏菌属细菌，尤其是荚壳伯克霍尔德氏菌中获得。
根据本发明的蛋白质的特征还在于其在产生细胞外脂肪酶的宿主细菌 中表达以后，例如在伯克霍尔德氏菌属细菌、尤其是荚壳伯克霍尔德氏菌 中表达以后，在标准条件下测定，其增加细胞外脂肪分解的活性。与差J出
值相比，细胞外脂肪分解活性增加至少约1%，例如约5-200%或10-100% 或20-50%。
具体地，根据本发明的蛋白质包含根据SEQ ID NO: 2的M,列， 或由其衍生的至少有80%序列同源性的氨基酸序列。
本发明也涉及由包含SEQ ID NO: 1或由其衍生的至少有80%序列同 源性的核酸序列编码的蛋白质，也涉及这些编码的核酸序列本身。
本发明的又一主题涉及表达载体，其包含在至少一个调控核酸序列的 遗传控制下，编码才艮据上述定义的具有蛋白酶活性的蛋白质的核酸序列。
本发明的又一主题是重组微生物，其具有至少一个上述定义的表达载 体的遗传修饰。
本发明还涉及生产上述定义的具有蛋白酶活性的蛋白质的方法，其中 重组微生物是在表达此类蛋白质的条件下培养，并且蛋白质是分离的。
本发明也涉及生产优选的细胞外脂肪酶(E.C. 3.1.1.3)的方法，其中能 够产生此类脂肪酶的宿主能表达上述定义的具有蛋白酶活性的功能性蛋白 质，并且能同时或在不同时间表达，而且脂肪酶是分离的形式。具体地， 宿主是伯克霍尔德氏菌属细菌、尤其是荚壳伯克霍尔德氏菌。
根据优选变体，所产生的脂肪酶包含根据SEQ ID NO: 6的氨基i^ 列，或由其衍生的至少有80%序列同源性的氨基酸序列，或由SEQ ID NO: 5或由其f汙生的至少有80%序列同源性的核酸序列编码。
2.通用术语的解释 "具有蛋白酶活性的蛋白质，，表示在至少一种此处描述的测试方法中， 蛋白酶的酶活性(蛋白水解活性)，例如(但是不限于)以至少一种合适蛋白酶 底物测定的蛋白水解活性。我们可能作为非限制性实例提及的氨肽酶底物， 例如赖氨酸-P-钠、精氨酸-P-钠、(左旋)-丙氨酸-p-钠、谷氨酸(P钠)-OH。 然而蛋白质的酶活性并不必需限制为蛋白水解活性。
"HTH结合结构域"指蛋白质序列中的螺旋-转角-螺旋DNA-结合基 序，如Dodd等人(1990)[26中所描述，其在此处明确地作为参考。
"细胞外脂肪酶"在本发明中具体指那些E.C. 3.1.1.3类的酶。优选地， 它们由伯克霍尔德氏菌属细菌、尤其是荚壳伯克霍尔德氏菌产生，例如具 体为脂肪酶lipA。此类脂肪酶具体在生物4支术方法中应用，例如Breuer 等人(2004) [27]、 Jaeger等人(2002) [28]和Schmid等人(2001) [29]的描述， 其在此处明确地作为参考。
"在标准条件下测定的细胞外脂肪分解活性"指用标准的分光光度法 以对硝基苯基棕榈酸酯作为底物测定的活性，根据Winkkr等人[31的方 法(最终底物浓度为0.8 mM; 37°C;在Soerensen砩酸盐緩冲液中)，正如 在实验部分所描述的。
"衍生"序列，例如衍生的氨基酸或核酸序列，除非另外说明，指根 据本发明与初始序列具有至少80%或至少90%、尤其91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%和99。/。一致性的序列。
两核酸之间的"同一性"指核苷酸的同一性，各情况下在核酸的全长 水平，尤其是通过Informax公司(USA)的Vector NTI Suite 7.1程序使用的 Clustal方法计算的同一性(Higgins DG， Sharp PM.在微型计算机上进行 的快速和灵敏的多重序列比对。Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151-1)， i殳置如下
多重比对参数
空位开放罚分 10
空位延伸罚分 10
空位分离罚分范围 8
空位分离罚分 关闭
比对延迟同一性％ 40
残基特异性空位 关闭
亲水残基空位 关闭
转换加权 0配对比对参数
FAST算法 开
K-元组大小 1
空位罚分 2
窗口大小 5
最好对角数 5
3.本发明的其它实施方案
3.1根据本发明的蛋白质
本发明不限于具体公开的具有蛋白酶活性的蛋白质或酶，也涉及其功 能性等同物。
在本发明范围内，具体公开的酶的"功能性等同物"或类似物是多种 多肽，其具有所希望的生物学活性，例如蛋白水解活性。
例如，"功能性等同物"指在蛋白水解活性的测试中，与包含根据SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的酶相比，展现至少20%、优选50%、尤其优选 75%、特别尤其优选卯％的酶活性的酶。而且功能性等同物优选在pH 4-10 之间是稳定的，并且最好最适pH值在5-8范围内，最适温度在20-80。C范 围内。
可以通过多种已知的测定蛋白水解活性的手段来证明蛋白水解活性。 不限于此，我们可以涉及使用脱脂牛奶琼脂平板的测试，该平板包含每升 30g脱月旨奶粉、5g酵母提取物、10gNaCl 、 10g胰蛋白胨、15 g琼月旨和 1 mM IPTG。将表达培养物的单个克隆或5 nl各纯化步骤的样品应用于琼 脂平板上，并在30。。(荚壳伯克霍尔德氏菌)或"。C (大肠杆菌)培养过夜。 可以通过克隆或样品周围形成的晕圏来检测蛋白水解活性。
根据本发明的"功能性等同物"具体也指突变体，其在上述^JJ^ 列的至少一个位点上氨基酸与具体提出的M酸有差异，但是仍然具有上 述生物学活性之一。因此"功能性等同物"包含突变体，其通过一个或多 个氨基酸添加、取代、缺失和/或倒置而获得，其中所述改变只要能导致突
变体具有才艮据本发明的性质，则该改变可以出现在任意序列位点。功能性 等同物具体也指突变体和未改变蛋白质之间的反应模式在性质上一致，即
例如同样的底物以不同速率转化。合适的M酸取代的实例在下表中显示
原始残基 取代的实例
丙氨酸Ala丝氨酸Ser
精氨酸Arg赖氨酸Lys
天门冬酰胺Asn谷氨酰胺Gln;组氨酸His
天门冬氨酸Asp谷氨酸Glu
半胱氨酸Cys丝氨酸Ser
谷氨酰胺Gin天门冬酰胺Asn
谷氨酸Glu天门冬氨酸Asp
甘氨酸Gly脯氨酸Pro
组氨酸His天门冬氨酸Asn;谷氨酰胺Gln
异亮氨酸lie亮氨酸Leu;缃氨酸Val
亮氨酸Leu异亮氨酸Ile;缬氨酸Val
赖氨酸Lys精氨酸Arg;谷氨酰胺Gln;谷氨酸Glu
曱石危氨酸Met亮氨酸Leu;异亮氨酸Ile
苯丙氨酸Phe曱硫氨酸Met;亮氨酸Leu;酪氨酸Tyr
丝氨酸Ser苏氨酸Thr
苏氨酸Thr丝氨酸Ser
色氨酸Trp酪氨酸Tyr
酪氨酸Tyr色氨酸Trp;苯丙氨酸Phe
缬氨酸Val异亮氨酸Ile;亮氨酸Leu
上述"功能性等同物，，也是所述多肽的"前体"，也可以是多肽的"功 能性衍生物"和"盐"。
"前体"是在此种情况下具有或没有所希望的生物学活性的天然或合 成的多肽前体。
"盐"指根据本发明的蛋白质分子的氛基盐和氨基的酸加成盐。M 盐可以通过已知方法产生，其包含无机盐例如钠、钩、铵、铁和锌盐，和 有机碱盐例如胺、例如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等等。本发明也 涵盖酸加成盐，例如无机酸盐、例如盐酸或硫酸盐，和有机酸盐、例如醋 酸和乙二酸盐。
根据本发明的多肽的"功能性衍生物，，也可以用已知技术从功能性氨
基酸侧基、或在它们的N-末端或C-末端产生。此类衍生物包括例如通过 与氨或伯胺或仲胺反应而获得的羧酸基的脂肪族酯类、羧酸基的酰胺类；
通过与酰基反应而产生的游离氨基的N-酰基衍生物；或通过与酰基反应而 产生游离羟基的O-酰基衍生物。
天然"功能型等同物"也包括能够从其它生物体获得的多肽，以及天 然存在的变体。例如可以通过序列比较确定同源序列区域，并且可以基于 本发明的具体参数来确定等同的酶。
"功能性等同物"也包括根据本发明的多肽的片段，优选单独的结构 域或序列基序，其例如呈现所希望的生物学功能。
而且，"功能性等同物"也有融合蛋白质，其具有上述多肽序列或由它 们衍生的功能性等同物之一的序列，并且在功能性N-末端或C-末端结合 至少一个另外的功能上有差异的异源序列(即融合蛋白质部分并没有实质 上的彼此功能影响)。这些异源序列的非限制性实例有，例如信号肽、组氨 酸锚或酶。
"功能性等同物"根据本发明也包括具体公开的蛋白质的同系物。这 些同系物与具体公开的氨基酸序列具有至少60%的同源性，优选至少 75%,尤其至少85%,例如卯、91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98或99% 的同源性，根据Pearson和Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8)， 1988， 2444-2448中的算法计算。根据本发明的同源性多肽的同源性百分比具体 指相对于此处具体描述的氨基酸序列之一的全长，氨基酸残基的一致性百 分比。
在可能的蛋白质糖基化情况下，根据本发明的"功能性等同物"包括 上述指定类型的蛋白质去糖基化或糖基化的形式，以及通过改变糖基化模 式而获得的修饰形式。
根据本发明的蛋白质或多肽的同系物通过诱变，例如通过蛋白质的点 突变、延长或缩短而产生。
根据本发明的蛋白质的同系物可以通过筛选突变体(例如缩短的突变 体)的组合数据库来鉴定。例如，通过在核酸水平上的组合突变可以产生蛋 白质变体的多样化数据库，例如通过合成的寡核苷酸混合物的酶催化连接。 有许多方法可以用于从简并寡核苷酸序列产生潜在同系物的数据库。简并
基因序列的化学合成在DNA自动合成仪上进行，然后合成的基因被连接 到合适的表达载体中。使用简并基因组能在混合物中提供编码所希望的可 能蛋白质序列组的所有序列。合成简并寡核苷酸的方法是本领域内技术人 员所公知的(例如Narang， S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura等人 (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura等人，(1984) Science 198:1056; Ike等人(1983) Nucleic Acids Res. 11:477)。
在现有技术中，已知一些技术用于筛选组合数据库的基因产物，其由 点突变或缩短而产生，并且用于从cDNA文库中筛选具有选择性质的基因 产物。这些技术适合基因文库的快速篩选，该基因文库由根据本发明的同 系物的组合突变而产生。基于高通量分析来筛选大型基因文库的最常用的 技术包括将基因文库克隆到能够复制的表达载体中，用得到的载体数据库 转化合适的细胞，和在所希望活性的检测有助于载体分离的条件下组合基 因的表达，该载体编码产物被检测的基因。回归总体诱变(REM)是一种增 加数据库中功能性突变体频率的技术，其可以与筛选测试结合使用，以便 鉴别同系物(Arkin和Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave等人 (1993) Protein Engineering 6(3):327-331)。
3.2克隆核酸序列
本发明也涉及编码具有蛋白酶活性的酶的核酸序列。优选包含根据 SEQ ID NO: 1序列的核酸序列；或从根据SEQ ID NO: 2的氨基酸序列衍 生的核酸序列。
此处所述的所有核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA 和mRNA)可以通过已知的化学合成方法从核普酸构件产生，例如通过单 独重叠的片段浓缩、双螺旋的互补核酸构件。寡核苦酸的化学合成可以例 如通过已知的方法进行，例如亚磷酰胺方法(Voet， Voet，第二版，Wiley Press, New York,第896-897页)。合成的寡核苦酸的积聚、和通过DNA 聚合酶的Klenow片段和连接反应添补缺口、以及通用克隆技术在 Sambrook等人(1989)，分子克隆实验室操作手册，Cold Spring HarborLaboratory Press中描述。
本发明也涉及核,歹ij(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA 和mRNA)，其编码上述多肽和它们的功能性等同物之一，其功能性等同 物可以通过例如^f吏用人工核苷酸类似物而获得。
本发明既涉及分离的核酸分子，其编码根据本发明的多肽或蛋白质或 其生物学活性片段，又涉及核酸片段，其例如作为杂交探针或引物用于鉴 定或扩增根据本发明的编码核酸。
根据本发明的核酸分子可能另外包含编码基因区域的3，和/或5，末端 非翻译序列。
本发明还涉及与具体所述核苷酸序列或其片段互补的核酸分子。 根据本发明的核苷酸序列能产生探针和引物，用于其它细胞类型和生 物体中同源序列的鉴定和/或克隆。此类探针或引物通常包含核苷酸序列区 域，该序列区域能够在"严格性"条件下与根据本发明的核酸序列的有义 链或相应反义链的至少约12个、优选至少约25个、例如约40、 50或75 个连续核苷酸杂交。
"分离的"核苷酸分子是与其它以天然来源存在的核酸分子分离的， 而且如果通过重组技术产生，那么其基本上能够与其它分子材料或培养基 分离，或者如果为化学合成的，那么其能够与化学前体或其它化学品分离。 根据本发明的核酸分子可以通过分子生物学的标准技术方法和根据本 发明提供的序列信息进行分离。例如可以使用一种具体公开的全序列或其 片段作为杂交探针，并用标准杂交技术，从合适的cDNA文库分离cDNA (例如ambrook， J" Fritsch， E.F.和Maniatis， T.分子克隆实验室操作手 册.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY， 1989中所描述)。另外，包含公 开序列或其片段之一的核酸分子可以使用基于该序列而构建的寡核苷酸引 物，通过聚合H^式反应来分离。可以将此种方法扩增的核酸克隆到合适 的载体中，并通过DNA测序来表征。也可以通过标准合成方法，例如使 用DNA自动合成4义产生根据本发明的寡核苷酸。
才艮据本发明的核酸序列，例如SEQ ID No: 1或其4汙生物、同系物或这 些序列的部分，能够例如通过常用杂交技术或PCR技术，从其它细菌例 如经由基因组或cDNA文库分离。这些DNA序列在标准条件下与根据本 发明的序列杂交。
"杂交"指在标准条件下，多核苷酸或寡核苷酸结合于几乎互补的序 列的能力，而在这些条件下非互补配偶体之间不存在非特异结合。为此， 序列可以是90-100%互补。能够特异性相互结合的互补序列的特性应用于 例如RNA印迹或DNA印迹，或PCR或RT-PCR中的引物结合。
使用保守区域的短的寡核苷酸有利于杂交。然而，杂交中也可能使用 根据本发明的较长片段或全序列。这些标准条件依赖所使用的核酸(寡核苷 酸、较长片段或全序列)而改变，或依赖于杂交中所使用的核酸类型(DNA 或RNA)而改变。例如，DNA:DNA杂化物的解链温度比同样长度的 DNA:RNA杂化物的解链温度约4氐l(TC。
例如，依赖于特定核酸，标准条件指温度在42-58。C之间，在浓度为 0.1-5XSSC水溶緩冲液中(1XSSC = 0.15 M NaCl， 15 mM柠檬酸钠，pH 7.2)或者另外存在50%甲酰胺，例如42。C在5XSSC、 50%甲酰胺中。最 好DNA:DNA杂化物的杂交条件是0.1 X SSC,且温度在约20-45。C之间， 优选在约30-45。C之间。对于DNA:RNA杂化物，最好杂交条件是在0.1X SSC,且温度在约30-55。C之间，优选在约45-55。C之间。这些所述杂交温 度是在无曱酰胺的条件下以长度约为100个核苷酸、且G+C含量为50% 的核酸为例计算的解链温度值。DNA杂交的实验条件在有关的遗传学教科 书中都有描述，例如Sambrook等人"分子克隆"，Cold Spring Harbor Laboratory, 1989,并且可以使用本领域内技术人员所公知的公式，例如依 赖于核酸的长度、杂交类型或G+C含量来计算。本领域技术人员能够从 下述教科书中获得更多的杂交信息Ausubel等人(编辑)，1985，现代分子 生物学实验方法，John Wiley和Sons, New York; Hames和Higgins (编辑)， 1985，核酸杂交A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991，基本分子生物学A Practical Approach,
IRL Press at Oxford University Press, Oxford 。
"杂交"尤其可能在严格条件下进行。此类杂交条件是例如在
Sambrook， J" Fritsch， E.R， Maniatis， T" in:分子克隆(实验室操作手册)，
第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989，第9.31-9.57页或现代
分子生物学实验方法，John Wiley和Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6中描述。 "严格性"杂交条件具体指在由50。/。甲酰胺、5XSSC (750 mM NaCl，
75 mM柠檬酸三钠)、50 mM磷酸钠(pH 7.6)、 5XDenhardt溶液、10%
硫酸葡聚糖和20 g/ml变性剪切的鲑精DNA组成的溶液中在42。C培养过
夜，随后用0.1XSSC在65。C清洗滤膜。
本发明也涉及具体公开的或可推论出的核酸序列的衍生物。
因此，根据本发明的核酸序列还可能由例如SEQ ID NO: l衍生，并
且可能由于添加、取代、插入或缺失单个或几个核苷酸而有所不同，而且
其编码具有所希望性质的多肽。
本发明也涵盖包含所谓的沉默突变的核苷酸序列，或者根据特定来源
或宿主生物体的密码子选择、与具体所述序列相比发生改变的核苦酸序列，
，"8 -缺、左jfe 亦乂矢 /te,lJWr妃前4"T1亦乂5k "容乂tV赤乂士
v、'^^、fwi j h j ri~，vj,—7T刀 w ， rr*o
本发明也涉及由保守核苷酸取代获得的序列(即所述氨基酸被同样电 荷、大小、极性和/或可溶性的氨基酸所取代)。
本发明也涉及从具体公开的核酸通过序列多态性而衍生的分子。这些 遗传多态性由于天然变异而存在于种群内的个体之间。这些天然变异通常
在基因的核苷酸序列中产生1-5%的差异。
具有根据本发明的序列SEQ ID NO: 1的核酸序列的衍生物指例如等 位变体，其在衍生的氨基酸水平上在全序列范围具有至少60%同源性，优 选至少80%同源性，特别尤其优选至少卯％的同源性(关于在氨基酸水平
上的同源性参考上述对于多肽给出的详细内容)。最好在序列的部分区域有 更高的同源性。
此外，衍生物也可以理解为根据本发明的核酸序列的同系物，尤其是
SEQ ID NO: 1，例如真菌或细菌同系物、缩短的序列、编码和非编码DNA序列的单链DNA或RNA。例如，在DNA水平上，SEQIDNO:l的同系 物与SEQIDNO:l中的全DNA区域具有至少40%同源性，优选至少 60%,尤其优选至少70%，特别尤其至少80%同源性。
而且，衍生物可以理解为例如带有启动子的融合物。可以通过至少一 个核香酸交换，至少一个插入、倒置和/或缺失，而其并不会损害启动子的 功能或效率，来^"饰加入所述核苷酸序列的启动子。而且，可以通过改变 其序列来增强启动子的效率，或甚至用不同种属生物体的更有效的启动子 完全替换。
3.3根据本发明的构建体
本发明也涉及表达构建体，其在调控核酸序列的遗传控制下，包含编 码根据本发明的多肽的核酸序列；以及包含至少一种这些表达构建体的载 体。
根据本发明"表达单位"指具有表达活性的核酸，其包含此处定义的 启动子，并且此启动子在与要表达的核酸或基因功能性结合以后可以调控
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"调控核酸序列"。除启动子以外，也存在其它调控元件，例如增强子。 根据本发明，"表达盒"或"表达构建体"指表达单位，其与要表达的
核酸或基因功能性结合。与表达单位不同，表达盒不仅包含调控转录和翻
译的核酸序列，而且也包含应该表达为蛋白质的核,列，该蛋白质是作
为转录和翻译的结果。
在本发明中，术语"表达，，或"过表达"描述在微生物中一种或多种
酶的细胞内活性的产生或增加，该酶由相应DNA编码。为此，可能例如
在生物体中插4因、用其它基因取代存在的基因、增加基因的拷贝数、 使用强启动子或4吏用编码具有高活性酶的基因，并且这些方法可以任选地 组合。
优选此类根据本发明的构建体包含来自各自编码序列的5，-上游启动 子，和3，-下游终止序列，并且任选的还包括各自与编码序列功能性连接的
其他常用调控元件。
才艮据本发明，"启动子"、"具有启动子活性的核酸"或"启动子序列，， 指与要转录的核酸功能性连接并调控该核酸转录的核酸序列。
在本发明中，"功能性"或"有效的，，连接指例如具有启动子活性的核 酸之一、和要转录的核酸序列、以及此外任选的更多调控元件(例如使核酸 能够转录的序列和例如终止子)的有序排列，从而使各调控元件能够实现其 在核酸序列转录中的功能。这并不需要在化学意义上的直接连接。遗传控
制序列(例如增强子序列)也可以从更远距离的位置或甚至从其它DNA分 子来行使其对靶基因的功能。优选的排列是将要转录的核酸序列放置在启 动子序列之后(即3，端)，使两序列以共价键相互结合。启动子序列与转基 因表达的核,列之间的距离可以小于200 bp (碱基对)，或小于100 bp或 小于50 bp。
除启动子和终止子以外，可能涉及的其它调控元件的实例有寻靼序列、 增强子、多腺苷酸化信号、选择标记、扩增信号、复制起点等等。合适的 调控序列在例如Goeddel，基因表达技术酶学方法185， Academic Press,
根据本发明的核酸构建体具体包含SEQ ID NO: 1序列或其衍生物和 同系物，也包含可以从SEQIDNO:2衍生的核酸序列，其最好与一个或多 个控制性调控信号(例如增强基因表达的调控信号)有效的或功能性的连 接。
除这些调控序列以外，在实际结构基因的上游仍可能存在对这些序列 的天然调控，并任选地可以对之进行遗传修饰，从而关闭天然调控和增强 基因表达。也可以简单的设计核酸构建体，即在编码序列(例如SEQ ID NO:l或其同系物)上游不插入任何附加的调控信号，且不除去天然启动子 的调控。而是使天然调控序列沉默以便不再发生调控，并且使基因表达增 强。
优选的核酸构建体最好还包含一个或多个与启动子功能性连接的上述 增强子序列，以增强核酸序列的表达。其他有利的序列，例如其他的调控元件或终止子也可插入到DNA序列的3，末端。在构建体中可能含有一个 或多个拷贝的根据本发明的核酸。构建体也可以含有其他标记，例如抗生 素抗性或营养缺陷型补偿基因，其任选地用于构建体的选择。
合适的调控序列的实例存在于例如cos-、 tac-、 trp-、 tet-、 trp-tet-、 lpp-、 lac-、 lpp-lac-、 laclq_、 T7画、T5國、T3画、gal國、trc画、ara-、 rhaP(rhaPBAD)SP6-、 入-Pr-或入-Pl启动子中，这些启动子最好在革兰氏阴性菌中使用。其他 有利的调控序列也存在于例如革兰氏阳性启动子amy和SP02，和酵母或 真菌启动子ADC1、 MFct、 AC、 P-60、 CYC1、 GAPDH、 TEF、 rp28、 ADH。也可以使用人工启动子进行调控。
为了表达，最好在宿主生物体中将核酸构建体插入允许基因在宿主细 胞中最优表达的载体中(例如质粒或噬菌体)。除质粒和噬菌体以外，载体 也理解为指本领域内技术人员所公知的所有其它载体，例如病毒(如SV40、 CMV、杆状病毒和腺病毒)，转座子，IS元件，噬粒，黏粒，和线性或环 状DNA。这些载体可以在宿主生物体中自主复制或随染色体复制。这些载 体代表本发明的其他实施方案。
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W>* 一 ' — I"-Z ，- ， z， ' 、》 ，* ，j F 4， y JB_> fc-^ w V^r ^*丄息丄 * 1 ■ ， _M_^ HAM 1 ，
pUC19、 pKC30、 pRep4、 pHSl、 pKK223-3、 pDHE19.2、 pHS2、 pPLc236、 pMBL24、 pLG200、 pUR290、 pIN-III113Bl 、 kgtll或pBdCl，链霉菌 (&w/;to/i^^s)中的pIJ101、 pIJ364、 pIJ702或pIJ361,杆菌中的pUB110、 pC194或pBD214，棒状杆菌(Cwj"WflcteffM附)中的pSA77或pAJ667,真 菌中的pALSl、 pIL2或pBB116,酵母中的2aM、 pAG-l、 YEp6、 YEpl3 或pEMBLYe23,或植物中的pLGV23、 pGHlac+、 pBIN19、 pAK2004或 pDH51。上迷质粒代表可能质粒的一小部分选择。其它质粒是本领域内技 术人员所熟知的，并且能够在例如《克隆载体》(Pouwels P. H.等人编辑， Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985， ISBN 0 444 904018)中找到。
在载体的另一实施方案中，包含本发明核酸构建体或本发明核酸的载 体也可能以线性DNA的形式,皮有利地插入^i:生物中，并通过异源或同源 重组的方式整合到宿主生物体的基因组中。此线性DNA可能包括线性化
载体(例如质粒)，或仅包括根据本发明的核酸构建体或核酸。
为实现生物中异源基因的最佳表达，最好根据生物中特定的密码子使 用来修饰核酸序列。通过计算机分析所研究生物的其他已知基因，可以确 定密码子的使用。
将合适的启动子与合适的编码核苷酸序列和终止信号或多聚腺苷酸信
号融合来制备本发明的表达盒。常规重组和克隆技术见于例如T. Maniatis， E.F. Fritsch和J. Sambrook,分子克隆实验室操作手册，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)和T.J. Silhavy， M丄. Berman和L.W. Enquist，基因融合实验，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor， NY (1984)以及在Ausubel， F.M.等人，现代分子生物 学实验方法,Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience (1987)中的描 述。
为了实现在合适宿主生物体中的表达，最好将重组核酸构建体或基因
构建体插入宿主特异性载体中，这可使基因在宿主中最优表达。载体是本
领域技术人员所熟知的，并且能够在例如"克隆载体"(Pouwels P.H.等人， 始樣in抓；o" am"p"/iom_xrAW vn",—rwf"" 1oq;、士拔姿i1
3.4能够根据本发明使用的宿主
依据本发明，术语"微生物"指起始微生物(野生型)或根据本发明经 遗传修饰的微生物，或包含两者。
根据本发明，术语"野生型"指相应的起始微生物，并不必需相应于 天然存在的生物体。
可以利用根据本发明的载体制备例如由至少一个本发明载体转化的可 用于生产本发明所用多肽的重组微生物。最好将上述重组构建体引入合适 的宿主系统并表达之。优选使用本领域技术人员熟知的通用克隆和转染方 法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔法、逆转录病毒转染等等，以使 所述核酸在各自表达系统中表达。合适的系统在例如现代分子生物学实验 方法,F. Ausubel等人编辑，Wiley Interscience, New York 1997，或
Sambrook等人，分子克隆实验室操作手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY，1989中描述。
适合本发明使用的核酸或核酸构建体的重组宿主生物体原则上是任何 原核或真核生物体。最好使用微生物例如细菌、真菌或酵母作为宿主生物 体。革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，优选肠杆菌科(五"te/v ^cter/a"^)、 假单胞菌科CPye"J( wo舰由c^^)、根瘤菌科(及/r/^^,Vz""》、链霉菌科 (5^印to附ycetocetfe)或诺卡氏菌科(A^cfl/vftViceae)的细菌，特别优选使用埃 希氏菌属(Esc/^i7'cMfl)、假单胞菌属、链霉菌属、诺卡氏菌属、伯克霍尔 德氏菌属、沙门氏菌属(5^/挑( /^//")、农杆菌属(Jgro6"cteW"附)或红球菌属 (及^^fococc附)的细菌。特别尤其优选大肠杆菌属和种。其它有利的细菌也 可在下面组中找到a-蛋白细菌、p-蛋白细菌或Y-蛋白细菌。
那么根据本发明的宿主生物体优选包含至少一个本发明描述的核^ 列、核酸构建体或载体，其编码具有根据上述定义的蛋白酶活性的酶。
依据宿主生物体，按本领域技术人员熟知的方法生长或培糾艮据本发 明的方法中使用的生物体。作为规则，微生物在液体培养基中生长，该培
养基包含碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以有机氮源的形式例如酵母提 取物，或例如硫酸铵等盐类)、微量元素(例如铁盐、锰盐和镁盐)、和任选 的维生素，生长温度在0-100'C之间，优选10-60。C，同时供以氧气。液体 培养液的pH值可以维持在固定值，即在培养过程中可以调节或不调节。 可以进行分批发酵、半分批发酵或连续培养。可以在发酵开始时供应营养 素，或以半连续或连续方式进行随后加料。可以在生长过程中直接加入酮， 或有利地在之后加入。可以通过实施例中所描述的方法从生物体中分离酶， 或者在反应中使用酶粗提物。
能够根据本发明使用的宿主具体为伯克霍尔德氏菌属细菌，尤其是荚 壳伯克霍尔德氏菌种。通常可获得的菌种的非限制性实例是DSM号9512 的荚壳伯克霍尔德氏菌(异名」Rsew^ 附o/iflsg/"附cre)。
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3.5蛋白酶的重组生产
本发明也涉及重组生产根据本发明的多肽或其功能生物活性片段的方 法，该方法通过培养产多肽的微生物，如果需要通过诱导表达多肽，并从 培养液中将它们分离。如果需要，也可以通过此种方法在工业上生产多肽。
根据本发明生产的微生物可以连续或不连续的以分批法或以补料分批 法或以重复补料分批法培养。在Chmiel (Bioprocesstechnik 1. Einftihrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)或 Storha(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden， 1994)的教科书中可以找到已知培养方法的综 述。
所使用的培养基必须以适当的方式满足特定菌种的需要。多种微生物 的培养基在美国细菌学会(Washington D. C.， USA, 1981)的"通用细菌学 方法手册，，中描述。
这些可以根据本发明使用的培养基通常包含一种或多种碳源、氮源、 无机盐、维生素和/或微量元素。
优选的碳源是糖，例如单糖、二糖或多糖。例如葡萄糖、果糖、甘露 糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀 粉或纤维素都是;f艮好的碳源。也可以通过复合化合物(例如糖蜜)、或其它 糖精制的附带产品将糖加入到培养基中。加入多种碳源的混合物也是有利 的。其它可能的多友源有油和脂肪例如豆油、葵花子油、花生油和椰子油， 脂肪酸例如棕榈酸、硬脂酸或亚油酸，醇例如甘油、曱醇或乙醇，和有机 酸例如乙酸或乳酸。
氮源通常是有机或无机氮化合物或含有这些化合物的材料。氮源的实 例包括氨气或铵盐，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵，硝 酸盐，尿素，#^基酸，或复合氮源，例如玉米浆、豆粉、大豆蛋白质、酵 母提取物、肉提取物等等。氮源可以分别使用或用作混合物。
在培养基中可能存在的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、 锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或》危酸盐。石克源可以〗吏用含石克的无才几化合物，例如辟u酸盐、亚碌u酸盐、连二亚石危 酸、连四亚硫酸、硫代硫酸盐、硫化物，也可以使用有机硫化合物，例如 石克醇和巯基化合物。
磷源可以使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。 培养基中可以加入螯合剂，以维持溶液中的金属离子。尤其合适的螯
合剂包括二羟基酚，例如邻苯二酚或原儿茶酚(protocatechuate),或有机
酸，例如柠檬酸。
根据本发明使用的发酵培养基通常也含有其它生长因子，例如维生素 或生长促进剂，其包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸 和吡哆醇。生长因子和盐通常来自培养基中的复合成分，例如酵母提取物、 糖蜜、玉米浆等等。另外，可以向培养基中加入合适的前体。培养基中的 化合物的精确组分强烈地依赖于特定实验，并且必须根据各个特定情况而 单独确定。最适培养基的信息可以在"Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Publ. P.M. Rhodes, P.F, Stanbury， IRL Press (1997) p. 53-73， ISBN 0 19 963577 3)中找到。生长培养基也可从供应商那里获得，例 如标准1 (Merck)或BHI (Brain heart infusion, DIFCO)等等。
培养基的所有成分都要灭菌，通过加热(在1.5巴和121。C加热20分钟) 或过滤除菌。各成分可以一起过滤，或者如果需要可以分开过滤。培养基 的所有成分可以在生长开始即存在，或者任选地连续或补料分批加入。
培养温度通常在15-45。C之间，优选25-40。C,可以持续恒定或者在实 验过程中改变。培养基的pH值应该在5-8.5之间，优选在7.0附近。生长 的pH值可以在生长过程中通过加入碱性化合物来控制，例如氬氧化钠、 氢氧化钾、氨或氨水，或者加入酸性化合物，例如磷酸或硫酸。可以用防 泡剂来控制起泡，例如脂肪酸聚乙二酯。为了保持质粒的稳定性，可以在 培养基中加入合适的具有选择作用的物质，例如抗生素。在培养基中加入 氧或含氧的气体混合物，例如空气，以维持需氧条件。培养温度通常在20-45 。C。持续培养直到形成最大量的所需产物。这通常在10-160小时内达到。
然后进一步处理发酵液。按需要通过分离技术将菌体从发酵液中完全 或部分地移出，例如通过离心、过滤、倾析或4吏用这些方法的组合，或将 菌体完全留在发酵液中。
如果多肽并非分泌至培养基中，那么就要破坏细胞，通过已知的分离 蛋白质的技术从溶菌产物中获得产品。任选的通过高频超声、高压(例如在 弗氏压碎器中)、渗透、去污剂作用、水解酶或有机溶剂、匀浆等手段，或 通过几种所列方法的组合来破坏细胞。
可以用已知的层析方法来纯化多肽，例如分子筛层析(凝胶过滤法)、Q 琼脂糖层析、离子交换层析和疏水层析，以及使用其它常用方法，例如超 滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳。合适的方法在例如Cooper, F.G.， Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter， Berlin, New York or in Scopes, R.，蛋白质纯化，Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin中描述。
为了分离重组蛋白质，最好使用载体系统或寡核苷酸，所述寡核苷酸 以特定核苷酸序列延伸了 cDNA，从而编码改变的多肽或融合蛋白质，可 用于例如更简单的纯化。合适的此类修饰例如作为锚的所谓"标签"，例如 六组氨酸锚的修饰、或能够作为抗原被抗体识别的表位(例如在Harlow， E. 和Lane, D.， 1988，抗体:实验室操作手册，Cold Spring Harbor (N.Y.) Press 中描述)。这些锚可以使蛋白质附着于固体支持物(例如可填充到层析柱中 的聚合物基质)，或可以用于微孔滴定板或其它支持物。
同时，这些锚也用于识别蛋白质。为了识别蛋白质，可能使用普通标 记，例如使用荧光染料和酶标记物，其在与底物反应以后形成可检测的反 应产物，或者使用放射性标记物，将它们单独使用或与锚相结合用于蛋白 质衍生物，
3.6执行本发明的方法用荚壳伯克霍尔德氏菌生产脂肪酶 基本上，通过荚壳伯克霍尔德氏菌的发酵生产脂肪酶。生物体在特定 生产培养基中生长。脂肪酶由荚壳伯克霍尔德氏菌以活性形式分泌到培养 基中。发酵结束后，通过倾析/离心将细胞从培养基中分离。将得到的残渣
干燥，以获得脂肪酶的干燥制剂。也可以通过合适的层析方法从培养基中 获得脂肪酶的超纯形式。最后，也可以通过固定作用直接将脂肪酶从培养 基吸附到合适的载体上。为此使用蛋白质专业人员所熟悉的标准方法。
另夕卜，对于蛋白酶也进行微生物生产和细胞外脂肪酶分离(参见上述)。 根据本发明可以更容易获得的脂肪酶能够用于例如精细化学药品的生 产。特别是，其用于通过分解外消旋物来获得光活性化合物。然而，也可 能用作对映选择性合成的催化剂。最后，酶不仅由于其立体选择性而应用， 而且也由于其位置选择性而得到应用。可能应用的区域包括聚合物或低分 子化合物的修饰，其中的酯键被位置选择性地剪切或连接。
以下实施例仅用于说明本发明。对于本领域技术人员显而易见的是， 许多可能变化也包含于本发明的范围内。
实施例
在本发明范围内进行克隆步骤，按Sambrook等人(1989) op. cit.中所 描述的进行，例如限制性内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的纯化、 将核酸转移到硝酸纤维素和尼龙膜上、DNA片段的连接、转化大肠杆菌细 胞、细菌的生长、噬菌体的复制和重组DNA的测序。
1.实验描述
a)细菌菌林和生长条件
用大肠杆菌DH5a进行常规克隆实验。该菌林在37。C Luria Bertani 培养基中培养(LB培养基(pH7.0): 10g/lNaCl、 10 g/1细菌用胰蛋白胨、5 g/1酵母提取物；Sambrook J.等人[17)。使用氨节青霉素(IOO照/ml)、四 环素(25將/ml)或氯霉素(50將/ml)来保持质粒。野生型荚壳伯克霍尔德氏 菌PG1菌林(从Jan Tommassen， Utrecht University, the Netherlands获得) 和生产菌林荚壳伯克霍尔德氏菌LU8093用于表达研究。
这些菌林在30°C PG培养基中培养，该培养基每升含有6g (nh4)2S04、3.5 g kh2P04、3.5 g k2hpo4、0.02 g CaCl2、 1 g MgS04 x 7 h20
和2g酵母提取物，pH6.5 [6。为了诱导脂肪酶产生，加入1% (v/v)橄 榄油(Sigma)，并且向培养基中加入氯霉素(200照/ml)以保持表达质粒。
b)本发明的质粒和黏粒构建体的生产
DNA操作的通用方法根据Sambrook等人[17，或根据制造商的DNA-修饰酶说明书进行。
荚壳伯克霍尔德氏菌PG1基因组文库的构建基本按Staskawicz等人20所描述的进行。从过夜培养液中分离基因组DNA以后，用Sau3A将 DNA部分水解。在标准Tris-醋酸-EDTA緩冲液中以0.5%琼脂糖凝聚电泳 分离DNA片段，将大于15 kb的片段切下并纯化。祐粒pLAFR3 (Staskawicz等人[20)用限制型内切酶HindIII和EcoRI通过两个不同的反 应进行水解，随后去磷酸化。在第二步骤中，将两个限制性酶切割片段用 BamHI消化以获得适合于Sau3A的末端。基因组DNA和两个pLAFR3 的DNA片段用T4 DNA连接酶在16'C连接过夜。最后，縣粒在体外包装 并转导进大肠杆菌JM101中。由于黏粒pLAFR3允许蓝/白斑筛选，因此 可以用LB琼脂平板鉴定阳性克隆，该平板含有四环素(25將/ml)、异丙基 -l-硫代-p-D-吡喃半乳糖苷(IPTG,终浓度为250照/ml)和5-溴-4-氯-3-丐l 咮-(KD-吡喃半乳糖苷(40-Gal，终浓度为40照/ml)。总计选出9300个克隆 并转移到微孔滴定板上，其导致4倍荚壳伯克霍尔德氏菌PG1基因组的覆 盖度。
这样获得的祐粒pLAFRPG5和pLAFRPG8的DNA片段对荚壳伯克 霍尔德氏菌中脂肪酶的生产具有突出影响。后者通过在pBBRlmcs (Kovach，M.E.等人[30)中插入EcoRI/Hind111片段进行亚克隆。对这样得 到的质粒pBBRPG5/1、 5/3、 5/7、 8/1 + 8/3进行DNA测序。
编码根据本发明蛋白酶的179个氨基酸的DNA片段通过聚合酶链式 反应扩增，使用荚壳伯克霍尔德氏菌PG1基因组作为模板。提供具有 BamHI识别序列对应于扩增DNA的5，末端的寡核苷酸引物Proup (CTAGGATCCAATTCGCCTCATCCAATGCA) (SEQ ID NO: 8)，和具有
HindIII 识 別 序 列 的 第 二 引 物 Prod。wn (CGCAAGCTTTCACGCGCCGGCCC) (SEQ ID NO: 9)。扩增的DNA片 段大小为540 bp,该片段被克隆到pBBRlmcs的BamHI/Hindlll位置， 其在lac启动子的控制下表达。得到的质粒定名为pBBRpro(参见图2B), 其通过接合作用转移到荚壳伯克霍尔德氏菌中。为了在大肠杆菌中过表达, PCR产物用如下引物扩增带有Ndel识别序列的ProupN (GTACATATGCAGCAGCGTGGC)(SEQIDNO: 10)，和带有Xhol识别 序列的ProdownX (ATCTCGAGTCACGCGCCGGCC) (SEQ ID NO: 11)。 随后将DNA片段克隆到pET22b (Novagen Inc., Madison, WI， USA (1997)) 的Ndel/Hindlll位置，这样其在T7启动子控制下并具有C-末端6 x His 标签，该标签使其能够通过镍-次氮基三乙酸金属亲和层析来纯化。得到的 质粒定名为pETpro(参见图2A)，其通过转化转移到大肠杆菌中。
c) 荚壳伯克霍尔德氏菌中黏粒或质粒的接合转移 黏粒的接合转移以大肠杆菌JM101作为供体，大肠杆菌pRK2013作
为辅助菌林[6。具有广宿主特异性的质粒pBBRl mcs和pBBRpro (通过 Hindlll和BamHI切割位点将原基因克隆到pBBRlmcs中产生)的接合转 移是用大肠杆菌S17-l作为供体菌林进行的双亲融合[19。将过夜培养的 受体菌林(荚壳伯克霍尔德氏菌PG1或LU8093),和培养到对数期的供体 和辅助菌林离心，清洗并在0.9% NaCl中重悬。将每种培养液的l ml组 合、离心并在50^il0.9。/。NaCl中重悬。混合液以点状涂布于LB琼脂平板 上并干燥。平板于30。C培养过夜。第二天，将菌斑重悬于0.9。/。NaCl中， 平铺于选择性PG培养基，该培养基包含用于筛选黏粒的四环素(50照/ml) 和氨千青霉素(100nm/ml)，或包含用于筛选广宿主特异性载体的氯霉素 (200 jig/ml)和氨千青霉素(100照/ml)。
d) 在同源宿主荚壳伯克霍尔德氏菌中的表达研究和在异源宿主大肠 杆菌中重组蛋白质的过表达
1用PG培养基+1%橄榄油使pBBRpro在荚壳伯克霍尔德氏菌PG1和 Lu8093菌林中表达24小时。表达空载体pBBRlmcs作为对照。24小时以 后，收集样品，将其离心并用0.9。/oNaCl清洗两次。将沉淀适当稀释用于 测定光密度(ODss。)，其上清液用于测定脂肪酶活性。
在大肠杆菌中使用T7表达宿主大肠杆菌BL21DE3进行本发明蛋白酶 的过表达。菌林在LB培养基中生长，该培养基包含用于保持过表达载体 pETpro的100叫/ml氨节青霉素。通过热激将载体pETpro转化到大肠杆 菌BL21DE3中(根据Hanahan的RbCl2方法，1983 [32)，即将ljil载体溶 于50jalTMF緩冲液中，加入到转化感受态细胞中，在冰上培育30分钟， 在42。C热激90秒，加入700jilLB培养基，并在37。C培养30分钟。然后 将内容物涂于选择性琼脂平板上(含100 ^g/ml氨节青霉素的LB琼脂)。
37。C培养2小时后，加入终浓度为0.4 mM的IPTG诱导T7启动子的 表达。在培养2、 4和6小时采集培养样品，通过十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
e) 细胞提取物的生产
将细胞调节到光密度为0.15，重悬于15pl SDS緩冲液中，在95。C培 养5分钟。
f) TCA沉淀
上清液中加入1/10体积的1%十二烷1^克酸钠，并在室温培育10分 钟。用1/10体积的70。/。三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白质，于冰上放置l小时。 离心10分钟(13000rev/min,室温)，然后用冰冷的80。/。丙酮洗两次，在真 空干燥器中干燥。最后在15pl SDS緩冲液中重悬蛋白质并于95'C培养5 分钟。
g) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
用15%聚丙烯酰胺凝胶根据Laemmli13进行十二烷基硫酸钠-聚丙
烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。蛋白质用考马斯亮蓝R250染色。
h) 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
用4-12y。聚丙烯酰胺梯度凝胶(Invitrogen)按制造商的实验方法进行 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质用考马斯亮蓝R250染色。
i) 本发明的蛋白酶的纯化
本发明的蛋白酶用镍-次氮基三乙酸金属亲和层析来纯化。为此，6 L 大肠杆菌BL21DE3 pETpro的液体培养物在37。C生长直到在580 nm的光 密度达到5.0。然后加入lmMIPTG诱导细胞，在37。C再生长4小时。经 离心(5000 rev/min, 15分钟，4。C)收集细胞，之后沉淀在25 ml冰冷緩冲 液(50mM Kpi, 10 mM咪唑，pH 8.0)中重悬。细胞与溶菌酶共同培育 (0.5mg/ml，冰上30分钟)和随后超声处理(IO x 30秒)来石皮碎细胞。除去细 胞碎片，样品再次离心(14000rev/min，20分钟，4。C)并过滤。澄清的溶菌产 物应用于镍-次氮基三乙酸柱，用磷酸钾緩冲液(50 mM Kpi， 20 mM咪唑， pH 8.0)清洗。用含有250 mM咪唑(pH 8.0)的50 mM磷酸钾緩冲液洗脱重 组蛋白质，然后将相应级分组合，并用葡聚糖凝胶-G25柱除盐。取出每个 纯化步骤的50 jtl体积用于SDS-PAGE分析和测量蛋白水解酶活性。然后 用Bradford测定法[41来确定蛋白质浓度，用牛血清白蛋白作为标准品。
j)酶活性测定
如Stuer等人[21所述,在含有三丁酸甘油酯乳剂(7.5 ml三丁酸甘油 酯，0.75 g阿拉伯树胶，用蒸馏水补至15ml)的指示平板上测定脂肪分解 活性，或者可选择以对硝基苯基棕榈酸酯(pNPP)作为底物用分光光度法测
pNPP:终浓度为0.8 mM
S0rensen磷酸盐緩冲液溶液A: 50mMNa2HPO4 x 2 H20
溶液B: 50mMKH2PO4
溶液A和B以17:1的比例混合 底物乳剂溶液I: 207mg去氧胆酸钠
100 mg阿拉伯树胶 卯ml S0rensen磷酸盐緩冲液 溶液II: 30 mg对硝基苯基棕榈酸酯 10 ml异丙醇
底物乳剂在每次活性测定之前新鲜配制，并于l小时之内使用。酶测 试在恒温37。C进^f亍。将10-50 pl上清液加入到2 ml预热的底物乳剂中， 测量超过5分钟的OD41。的变化(AOD楊)。将AOD"o/min与培养物的OD580 进行对比得到相对的脂肪分解活性。
蛋白水解活性用脱脂牛奶琼脂平板测定，该平板每升包含30 g脱脂 奶粉、5 g酵母提取物、10 g NaCl、 10 g胰蛋白胨、15 g琼脂和lmM IPTG。 表达培养物的单个克隆或各纯化步骤的5 jil样品涂布于琼脂平板上，在30 'C(荚壳伯克霍尔德氏菌)或37。C(大肠杆菌)培养过夜。通过在菌落或样品 周围形成的晕圏来检测蛋白水解活性。
k)计算机分析
序列比对、ORF和数据库检索使用国家生物技术信息中心的标准软 件基本局部比对检索工具(Basic Local Alignment Search Tool) (BLAST) [1,2，或开放读码框查寻(Open Reading Frame-Finder) (ORF-查寻)，或 欧洲生物信息学学会(EMBL-EBI):华盛顿大学基本局部比对检索工具2.0 版(WU-BLAST2， db Clustal) [1, 210。蛋白质可能定位的预测和计算机分 析使用预测程序ProtParam工具[9卜PSORT-B8j、专业蛋白质分析系统 (ExPASY)的SignalP 3.0服务器[14和Pole Biolnformatic， Lyons,网络蛋白 质序列分析(PBIL，NPS， France) [5的螺旋-转角-螺旋-预测服务器。
2.测试结果
a)鉴定荚壳伯克霍尔德氏菌生产脂肪酶中的薄弱环节
如上所述，用具有广宿主特异性的黏粒pLAFR3[19构建荚壳伯克霍 尔德氏菌PG1的基因组文库。在荚壳伯克霍尔德氏菌PG1和LU8093接 合以后，用脂肪酶指示平板和脂肪酶活性测定[21来篩选黏粒数据库。
在约2500个克隆的文库中，鉴定出15个对脂肪酶生产有影响的勦粒。 来自这些黏粒中的2个黏粒的相应DNA片段被亚克隆到pBBRlmcs中， 并通过DNA测序来鉴定。在荚壳伯克霍尔德氏菌中进一步的表达研究最 终得到l个质粒，其能导致细胞外脂肪酶活性增加20-30%(参见图3)。
b) ThiJ/PfpI蛋白质的表达使荚壳伯克霍尔德氏菌中的脂肪酶活性增
加
质粒pBBRPG 8/1的限制性内切酶分析(图3)和插入序列的DNA测 序显示DNA片段的大小约为1.2kb(参见图4,第4泳道)。
用国家生物技术信息中心(NCBI)的开放读码框检索程序(ORF-查寻) 检测到3个开放读码框(ORT)，最大的一个(540bp)编码具有保守结构域的 蛋白质，其为ThiJ/PfpI家族的特征蛋白质。另外2个ORF包含444或348 bp，其与数据库中的其它注释蛋白质没有显著的相似性。
用EMBL-EBI的WU-Blast2程序与数据库中其它蛋白质进行氨基酸 序列比对，结果显示几种情况有显著的相似性，具体为推测的细胞内蛋白 酶和应激蛋白(参见图1)。例如有69%的氨基酸序列与大肠杆菌中的细胞 内蛋白酶YHBO相似。与芽胞杆菌的一般应激蛋白有49%相似性[221，与 蜡状芽胞杆菌(5fl"7/附"M船)的蛋白酶I有44%相似性[11，和与强烈炽 热球菌和掘越氏热球菌的蛋白酶Pfpl和PH1704有44%—致性25。最近 发表的关于DJ-l/ThiJ/P印I超家族中进化和功能关系的综述显示该超家族
包含具有多种功能的蛋白质，例如蛋白酶、转录调控子、(T-交叉反应蛋白
质、过氧化氢酶等等[3。
除人类DJ-1蛋白质和来自植物的ThiJ或蛋白酶相关的蛋白质以外， 与遗传帕金森病相关的还有许多具有DJ-l/ThiJ类结构域的细菌蛋白质， 例如含有过氧化氢酶结构域和DJ-l/ThiJ结构域的过氧化氢酶大亚基，或AraC型转录调节因子。后者可以通过在蛋白质C-端部分存在一个或多个 螺旋-转角-螺旋(HTH)基序来鉴定。推测HTH基序介导DNA结合，而ThiJ 类结构域是酰胺酶[3。(7-交叉反应蛋白质家族具有格外保守的组成(91.4% 同一性)，这将它们与邻近的家族区分开来。这些蛋白质具有不同的ElbB 结构域(ElbB-来自大肠杆菌的增强番茄红素生物合成蛋白质2)，与ThiJ 蛋白质显示相对中等的同源性。最后，有两组蛋白质在氨基酸序列水平上 具有高度相似性，其包括上述比对的蛋白质(图1)。第一组包括PfpI蛋白 酶，包括来自强烈炽热球菌或掘越氏热球菌的两种蛋白酶PfPI和PH1704。 尽管仅以低聚物形式，这些蛋白酶形成六聚环结构，并显示ATP依赖的蛋 白酶活性。由于在组氨酸残基旁边存在半胱氨酸残基(IOO),因此这些蛋白 质被分类为半胱氨酸蛋白酶。在PH1704的晶体结构中，相应的半胱氨酸 100残基处于亲核的弯曲处基序中，并与组氨酸101 —起形成在三对单体 之间接触面的催化三联体部分[23。由于所有的已知蛋白酶都具有相邻的 半胱氨酸/组氨酸残基，而在非蛋白酶成员中发现有半胱氨^/X取代，很 可能多数邻近组的蛋白质，即那些ThiJ/PfpI类蛋白质，由于其中多数都 在同样位置具有半胱氨酸/组氨酸残基对，因此很有可能也展现蛋白酶活 性。此外，在半胱氨酸/组氨酸残基对附近鉴定到共有序列，即AICHGP (SEQ ID NO: 7)。属于此组的蛋白质包括例如来自大肠杆菌的细胞内蛋白 酶YhbO、来自枯草芽孢杆菌(J . s"6说的的应激蛋白GSP18、来自大肠杆 菌的分子伴侣Hsp31和来自酿酒酵母(51. ce"v&iV^)的细胞内蛋白酶 YDR533C[3。
为了将根据本发明的蛋白酶归类到上述组之一，在ExPASy网站的帮 助下进行计算机辅助研究。确定分子量约为19.6 kDa和理论pl为5.45 (ProtParam工具[9)。根据SignalP 3.0预测程序[14，氨基紗列不包含 用于分泌的信号序列。这表明其定位于细胞质，用细菌蛋白质的亚细胞定 位的预测程序(PSORT-B问)也验证了这一点。用HTH预测程序(网络蛋白 质序列分析[51)进^f亍进一步的结构对比显示，根据本发明的蛋白酶没有任何 HTH-DNA结合结构域。因此，该蛋白质也不是转录调节因子。
基于在氨基酸序列水平上与来自大肠杆菌的细胞内蛋白酶YhbO具有 高度相似性，很可能本发明的来自荚壳伯克霍尔德氏菌的蛋白酶与YhbO 具有高度相似性，因此其属于ThiJ/PfpI类蛋白质家族。从比对(图l)中可 见，所有在YhbO和其它该组蛋白质中鉴定到的保守氨基酸残基也存在于 本发明的蛋白酶中。也确定了 YhbO的晶体结构，其显示该蛋白质形成同 型二聚体[25。使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果显示在大肠杆菌中 以融合蛋白质表达的本发明的蛋白酶亚基形成多聚体构象(数据未显示)。
c) 本发明的蛋白酶在荚壳伯克霍尔德氏菌中的表达
经DNA序列分析产生两个引物，其可以从荚壳伯克霍尔德氏菌PG1 基因组直接扩增本发明蛋白酶的基因。得到的PCR产物用限制性酶切位 点HindIII和BamHl被插入到具有广宿主特异性的pBBRlmcs载体中。 构建体命名为pBBRpro，用大肠杆菌S17-l作为供体菌林将其转移到受体 菌林荚壳伯克霍尔德氏菌PG1或LU8093中。如上所述进行总共4个不 同的表达研究。
对于野生型菌林荚壳伯克霍尔德氏菌PG1，质粒pBBRpro的额外表 达导致脂肪酶活性增加2-3倍，而在生产菌林LU8093中，只增加0.3倍(参 见图5a和b)。此种差别的原因在于生产菌林已经产生比野生型菌林约高 10倍量的脂肪酶，因此质粒的表达不再能以与野生型菌林相同的程度引起 脂肪酶的产生。
如果表达培养物的菌落在脱脂牛奶琼脂平板上生长，其晕圏的形成是 没有差别的(数据未显示)。由于推测本发明的蛋白酶定位于细胞质，而且 载体pBBRlmcs具有相对少的拷贝数，因此在指示平板上的简单培养可能 不足以检测蛋白水解活性。
d) 本发明的蛋白酶在大肠杆菌中过表达
为了过表达本发明的蛋白酶，将基因克隆到在T7启动子控制下的载 体pET22b中，用得到的构建体转化大肠杆菌BL21DE3。先用25 ml培
养基进行小规模的过表达预研究，如上所述，且样品通过SDS-PAGE分 析(参见图6)。在诱导2-6小时以后检测到蛋白质成功过表达。基于所使 用的蛋白质标准，本发明的蛋白酶分子量约为21 kDa，其比计算的约19.6 kDa的分子量略高。当由表达培养物获得的菌落在脱脂牛奶琼脂平板上 生长时，没有观测到晕圏形成的差异(数据未显示)。由于本发明的蛋白酶 过表达并不会形成包涵体，因此推测在大肠杆菌中表达的蛋白质无活性， 或者脱脂牛奶并不是合适的底物。
e)本发明的蛋白酶的纯化
过表达的蛋白质用镍-次氮基三乙酸金属亲和层析来纯化。6L大肠杆 菌BL21DE3 pETpro的液体培养物在37。C生长过夜，直到光密度OD柳 达到0.6，加入l mMIPTG诱导蛋白质的过表达。4小时后收集细胞，并 在25ml水冷緩冲液(50mMKpi，10mM咪唑，pH8.0)中重悬。细胞与溶 菌酶共同培育(0.5mg/ml，冰上30分钟)，然后超声处理(IO x 30秒)来破碎 细胞。通过离心(14000rev/min，20分钟，4'C)和过滤除去细胞碎片。然后 将澄清的溶菌产物应用于镍-次氮基三乙酸柱，用磷酸钾緩冲液(50 mM Kpi， 10 mM咪唑，pH 8.0)清洗。用含有250 mM咪唑(pH 8.0)的50 mM Kpi 緩冲液洗脱重组蛋白质，将相应级分组合，并用葡聚糖凝胶-G25柱除盐。 从每个纯化步骤取出50 pl体积样品用于SDS-PAGE分析(图7)。除盐洗 脱以后，纯化的蛋白质的总体积为90ml。用Bradford测定法[4以牛血清 白蛋白作为标准品，确定样品的蛋白质浓度为3 mg/ml，其相应于蛋白质 总产量为270 mg。纯化的蛋白质可以用于进一步的酶活性测试。
i)在微孔滴定板中测定蛋白酶活性
用酶平板测试(Taxaprofile E， Merlin, Bornheim-Hersel)来测定纯化蛋 白质的蛋白酶活性。在此测试中，欲研究的蛋白质在95个氨肽酶和蛋白酶、 76个糖苷酶、磷酸酶和酯酶的底物中，在pH8.2、 pH7.5、 pH5.5和H4.0 的17个经典反应中进行测定。随后的操作由Merlin公司提供。用纯化蛋 白质的緩沖液作为对照(10mM Kpi緩冲液pH6.5)。平板在30。C培养24 小时以后，进行目测。该测试总共进行3次，发现与以下底物有清楚的阳 性反应
4个氨肽酶底物赖氨酸-P-Na、精氨酸-P-Na、(左旋)-丙氨酸-卩-Na、 谷氨酸(PNa)-OH
2个糖苷酶底物对硝基苯基-ot-(左旋)-吡喃阿拉伯糖苷、对硝基苯基 -P-D-吡喃半乳糖苷。
参考文献
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权利要求
1.蛋白质，其特征在于具有至少一种如下性质a)具有包含共有序列AICHGP(SEQ ID NO7)的氨基酸序列；b)没有螺旋-转角-螺旋(HTH)DNA结合结构域；c)在变性条件下由SDS-PAGE确定的分子量约为20-22kDa。
2. 权利要求1所要求的蛋白质，其具有的pl值在5.4-5.5范围内。
3. 上述权利要求的任一项所要求的蛋白质，其从伯克霍尔德氏菌属 的细菌获得。
4. 权利要求3所要求的蛋白质，其从荚壳伯克霍尔德氏菌获得。
5. 上述权利要求的任一项所要求的蛋白质，其在生产细胞外脂肪酶 的细菌宿主中表达之后，增加在标准条件下测定的细胞外脂肪分解活 性。
6. 权利要求5所要求的蛋白质，其中宿主是荚壳伯克霍尔德氏菌。
7. 权利要求5或6所要求的蛋白质，其中细胞外脂肪分解活性与基 础值相比增加至少约5%。
8. 上述权利要求的任一项所要求的蛋白质，其包含SEQ ID NO: 2 的M酸序列；或由其衍生的具有至少80%序列同源性的氨基酸序列。
9. 上述权利要求的任一项所要求的蛋白质，其编码核酸包含SEQ ID NO: 1或由其衍生的具有至少80%序列同源性的序列。
10. 权利要求9定义的核酸序列。
11. 表达构建体，其包含在至少一种调控核酸序列的遗传控制下的权 利要求10所要求的核酸序列，该核酸序列编码具有蛋白酶活性的蛋白 质。
12. 重组微生物，其具有至少一种权利要求11所要求的表达构建体 的遗传修饰。
13. 权利要求1-9的任一项所要求的具有蛋白酶活性的蛋白质的生产 方法，其中在表达该蛋白质的条件下培养重组微生物，并且分离形成的蛋白质。
14. 脂肪酶(E.C丄1丄3)的生产方法，其中使能够产生脂肪酶的宿主表 达权利要求1-9的任一项所要求的具有蛋白酶活性的功能性蛋白质， 和使其同时或在不同时间表达脂肪酶，并且分离形成的脂肪酶。
15. 权利要求14所要求的方法，其中该宿主是伯克霍尔德氏菌属的 细菌。
16. 权利要求14和15的任一项所要求的方法，其中该脂肪酶包含 SEQ ID NO: 6的氨基酸序列或由其衍生的具有至少80%序列同源性 的氨基,列。
17. 权利要求14-16的任一项所要求的方法，其中该脂肪酶由包含 SEQ ID NO: 5序列的核酸序列或由其衍生的具有至少80%序列同源 性的核酸序列编码。
全文摘要
本发明涉及新的蛋白质，尤其是具有蛋白酶活性的蛋白质，其促进细菌(尤其是伯克霍尔德氏菌属的细菌)产生细胞外脂肪酶，还涉及其编码核酸序列、包含它们的表达构建体、由此修饰的宿主、尤其是通过伯克霍尔德氏菌属细菌生产具有蛋白酶活性的蛋白质的方法和生产脂肪酶的方法。
文档编号C12N9/52GK101198695SQ200680021664
公开日2008年6月11日 申请日期2006年6月13日 优先权日2005年6月15日
发明者A·贝赛林, B·豪尔, F·罗森诺, K-E·贾格尔, M·布罗伊尔 申请人:巴斯福股份公司