专利名称：脂肪酶粉末、其制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可适用于各种酯化反应、酯交换反应等中的脂肪酶粉末，其制备方法，脂肪酶粉末浸渍或浸润在油脂中而成的脂肪酶组合物，使用该脂肪酶粉末的油脂的酯交换方法等。
背景技术：
脂肪酶广泛地用于脂肪酸等各种羧酸与一元醇或多元醇等醇类的酯化反应、多个羧酸酯之间的酯交换反应等中。其中，酯交换反应不仅作为动植物油脂类的改质方法，而且作为各种脂肪酸的酯、糖酯和类固醇的制备方法是重要的技术。当将作为油脂水解酶的脂肪酶用作这些反应的催化剂时，可在室温至约70℃左右的温和条件下进行酯交换反应，与以往的化学反应相比，不仅抑制副反应、降低能耗，而且由于作为催化剂的脂肪酶是天然物质，因此安全性也较高。另外，可以根据其底物特异性或位置特异性高效地生产目标物。然而，即使将脂肪酶就那样地直接用于酯交换反应中也不会充分表现出其活性，而且难以将原本为水溶性的脂肪酶均匀地分散到油性原料中，其回收也困难。因此，以往通常将脂肪酶固定到一些载体上，例如阴离子交换树脂(专利文献1)、酚醛吸附树脂(专利文献2)、疏水性载体(专利文献3)、阳离子交换树脂(专利文献4)、螯合树脂(专利文献5)等上来用于酯化反应或酯交换反应等中。
如上所述，以往将脂肪酶固定化后用于酯交换反应中，但是所述固定化脂肪酶不仅伴随有固定化处理导致的原有脂肪酶活性的损失，而且使用多孔性载体时原料和产物堵塞细孔，其结果带来酯交换率的降低。而且，在利用以往固定化脂肪酶进行的酯交换反应中，由于载体所持有的水分被带入到反应体系中，因此难以避免副反应，例如在油脂类的酯交换反应中的甘油二酯或甘油一酯的生成等。
鉴于上述状况，已开发了各种使用脂肪酶粉末的技术。例如，提出了一种酯交换反应方法，其在惰性有机溶剂的存在下或不存在下，将脂肪酶粉末分散到含有酯的原料中进行酯交换反应，以使在酯交换反应时将分散脂肪酶粉末颗粒的90％或其以上保持在粒径1～100μm的范围内(专利文献6)。还提出了将含有磷脂和脂溶性维生素的酶溶液进行干燥，使用所得到的酶粉末的技术(专利文献7)。
然而，需要一种脂肪酶活性和稳定性进一步提高了的脂肪酶粉末。
专利文献1日本专利特开昭60-98984号公报专利文献2日本专利特开昭61-202688号公报专利文献3日本专利特开平2-138986号公报专利文献4日本专利特开平3-61485号公报专利文献5日本专利特开平1-262795号公报专利文献6日本专利第2668187号公报专利文献7日本专利特开2000-106873号公报发明内容本发明的目的在于提供一种脂肪酶活性和稳定性提高了的脂肪酶粉末。
本发明又一目的在于提供一种1，3选择性提高了的脂肪酶粉末。
本发明的又一目的在于提供一种将上述脂肪酶粉末浸渍或浸润于油脂中而成的脂肪酶组合物。
本发明的又一目的在于提供一种上述脂肪酶粉末的制备方法。
本发明的又一目的在于提供一种使用上述脂肪酶粉末来进行的油脂的酯交换方法。
本发明的这些目的和其它目的，从以下的描述将变得清楚。
本发明是基于如下发现完成的，即，当使用动物乳的固体成分对脂肪酶进行造粒、作成粉末状时，脂肪酶活性和稳定性就会显著提高，并且在脂肪酶为1，3特异性脂肪酶时，其1，3选择性将显著提高。
即，本发明提供一种脂肪酶粉末，其特征在于，该脂肪酶粉末是含有脂肪酶、和动物乳的固体成分的造粒物。
本发明还提供一种脂肪酶组合物，该脂肪酶组合物在油脂中浸渍或浸润有上述脂肪酶粉末。
本发明还提供一种脂肪酶粉末的制备方法，其特征在于，将动物乳或得自动物乳的奶油添加到含有脂肪酶的水溶液中，进行喷雾干燥、冷冻干燥或溶剂沉淀。
本发明还提供一种酯交换用或酯化用脂肪酶，其含有上述脂肪酶粉末。
本发明还提供一种油脂的酯交换方法，其特征在于，使用酯交换用脂肪酶。
具体实施例方式
作为在本发明中使用的脂肪酶，可以列举脂蛋白脂肪酶、单酰甘油脂肪酶、二酰甘油脂肪酶、三酰甘油脂肪酶、半乳糖脂肪酶、磷脂酶等。其中优选三酰甘油脂肪酶。
作为产生这些脂肪酶的微生物，有细菌、酵母、丝状菌、放线菌等不受特别限定，可以列举假单胞菌属(Psudomonas sp.)、产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、球拟酵母属(Torulopsis sp.)、埃希氏菌属(Escherichia sp.)、日本假丝酵母属(Mycotorulasp.)、丙酸杆菌属(Propionibacterium sp.)、色杆菌属(Chromobacterium sp.)、黄单胞菌属(Xanthomonas sp.)、乳酸杆菌属(Lactobacillus sp.)、梭菌属(Clostridium sp.)、假丝酵母属(Candida sp.)、地霉属(Geotrichum sp.)、复膜孢酵母属(Saccharomycopsis sp.)、诺卡氏菌属(Nocardia sp.)、镰刀菌属(Fusarium sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、青霉属(Penicillum sp.)、毛霉菌属(Mucor sp.)、根霉属(Rhizopussp.)、须霉属(Phycomyces sp.)、柄锈菌属(Puccinia sp.)、杆菌属(Bacillus sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、嗜热真菌属(Thermomyces sp.)等。
其中，本发明优选1，3-特异性脂肪酶，特别优选得自根毛霉菌属(Rhizomucor sp.)和产碱杆菌属的1，3-特异性脂肪酶，更优选得自根毛霉菌属的米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)和得自产碱杆菌属的Alcaligenes sp.的1，3-特异性脂肪酶。另外，米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)以往也有被归属于毛霉菌属(Mucor sp.)的情况。
本发明优选得自根霉属和嗜热真菌属的1，3-特异性脂肪酶，特别是得自米根霉(Rhizopus oryzae)和棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的1，3-特异性脂肪酶。
作为本发明中使用的动物乳，可以列举牛乳、山羊乳等。其中，优选牛乳，特别是，作为动物乳的固体成分，优选牛乳的固体成分或得自牛乳的奶油的固体成分。
脂肪酶与动物乳的比例，可以是各种比例，以动物乳的固体成分计，优选为脂肪酶质量的0.1～20倍的量，更优选为1～20倍的量。
本发明的脂肪酶粉末，必须含有动物乳的固体成分和脂肪酶，此外还可以含有脂肪酶的培养基成分等。
本发明的脂肪酶粉末，优选其水分含量为10质量％或10质量％以下，特别优选为6.5～8.5质量％。
本发明的脂肪酶粉末的粒径可以是任意的，但优选脂肪酶粉末的90质量％或90质量％以上，其粒径为1～100μm。平均粒径优选为20～80μm，更优选为20～50μm。另外，脂肪酶粉末优选为球状。
脂肪酶粉末的粒径，可以使用例如HORIBA公司的粒度分布测定装置(LA-500)来测定。
本发明的脂肪酶粉末，可以通过例如将动物乳或得自动物乳的奶油添加到含有脂肪酶的水溶液中，经喷雾干燥、冷冻干燥或溶剂沉淀之后进行干燥的方法获得。在这里，作为在溶剂沉淀法中使用的溶剂，可以列举例如乙醇、丙酮、甲醇、异丙醇和己烷等，也可以使用它们的混合溶剂。其中，为了进一步提高脂肪酶粉末的活性，优选使用乙醇或丙酮。另外，溶剂沉淀之后的干燥例如可以通过减压干燥来进行。
在这里，作为含有脂肪酶的水溶液，可以列举除去菌体的脂肪酶培养液、精制培养液、由它们获得的脂肪酶粉末再次溶解·分散在水中得到的溶液、市售的脂肪酶粉末再次溶解·分散在水中得到的溶液、市售的液体脂肪酶等。而且，为了进一步提高脂肪酶活性，更优选除去了盐类等低分子成分的溶液；另外，为了进一步提高粉末的特性，更优选除去了糖等低分子成分的溶液。
作为脂肪酶培养液，可以列举例如，含有大豆粉、蛋白胨、玉米浸液、K2HPO4、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O等的水溶液。作为它们的浓度，大豆粉是0.1～20质量％，优选1.0～10质量％，蛋白胨是0.1～30质量％，优选0.5～10质量％，玉米浸液是0.1～30质量％，优选0.5～10质量％，K2HPO4是0.01～20质量％，优选0.1～5质量％。另外，(NH4)2SO4是0.01～20质量％，优选0.05～5质量％，MgSO4·7H2O是0.01～20质量％，优选0.05～5质量％。培养条件最好控制如下培养温度为10～40℃，优选20～35℃；通气量为0.1～2.0VVM，优选0.1～1.5VVM；搅拌转速为100～800rpm，优选200～400rpm；pH为3.0～10.0，优选4.0～9.5。
菌体的分离优选通过离心分离、膜过滤等进行。另外，盐类和糖等低分子成分的除去可以通过UF膜(ultrafiltrationmenbrane，超滤膜)处理来进行。具体地说，进行UF膜处理，将含有磷脂酶的水溶液浓缩至体积的1/2量，然后添加与浓缩液等量的磷酸缓冲液，将该操作重复1～5次，可以获得除去了低分子成分的含有脂肪酶的水溶液。
离心分离优选控制在200～20,000×g，膜过滤优选由MF膜(microfiltration membrane，微滤膜)、压滤机等将压力控制在3.0kg/m2以下。菌体内酶的情况下，优选用均化器、韦林掺合器、超声破碎、法式压滤壶(French press)、球磨机等将细胞破碎，用离心分离、膜过滤等除去细胞残渣。均化器的搅拌转速为500～30,000rpm，优选1,000～15,000rpm；韦林掺合器的转速为500～10,000rpm，优选1,000～5,000rpm。搅拌时间较佳为0.5～10分钟，优选1～5分钟。超声破碎较佳在1～50KHz，优选在10～20KHz的条件下进行。球磨机优选使用直径0.1～0.5mm左右的玻璃制小球。
在本发明中，作为含有脂肪酶的水溶液，优选使用含有5～30质量％固体成分的水溶液。
添加的动物乳或得自动物乳的奶油，以其固体成分计，优选是含有脂肪酶的水溶液的固体成分质量的0.1～20倍的量，更优选是0.3～10倍的量，最优选是0.3～5倍的量。
在这里，含有脂肪酶的水溶液中的固体成分浓度、以及动物乳或得自动物乳的奶油中的固体成分浓度，可以使用例如糖度计((株)シ一·アイ·エス公司制造的BRX-242)，作为Brix.％(糖度％)求出。
添加动物乳或得自动物乳的奶油之后，优选将含有脂肪酶的水溶液的pH调节到6～7.5。特别优选将pH调节到7.0以下，更优选将pH调节到6.5～7.0的范围内。pH调节优选在即将进行喷雾干燥等干燥工序之前进行，也可以在其之前的任意工序中进行，也可以预先调节含有脂肪酶的水溶液的pH，以使其在即将进行干燥工序之前的p H在上述范围内。pH调节中可使用各种碱性剂和酸，优选使用氢氧化钠等碱金属氢氧化物。
另外，在干燥工序之前的中途的工序中，也可以浓缩含有脂肪酶的水溶液。浓缩方法没有特别的限制，可以列举蒸发器、闪蒸器、UF膜浓缩、MF膜浓缩、利用无机盐类的盐析、利用溶剂的沉淀法、利用离子交换纤维素等的吸附法、利用吸水性凝胶的吸水法等。较佳优选UF膜浓缩、蒸发器。作为用于UF膜浓缩中的模件，优选馏分分子量3,000～100,000、优选6,000～50,000的平膜或中空纤维膜，材质优选为聚丙烯腈类、聚磺酸类等。
喷雾干燥优选使用例如喷嘴逆流式、盘逆流式、喷嘴并流式、盘并流式等的喷雾干燥机进行，更优选盘并流式。喷雾干燥优选控制在如下条件进行喷雾器转速为4,000～20,000rpm，加热的入口温度为100～200℃，出口温度为40～100℃。
另外，冷冻干燥(freeze drying)也是优选的，例如优选通过实验室规模的少量用冷冻干燥机，经塔板式冷冻干燥来进行。进一步，也可以通过减压干燥调制。
这样制得的脂肪酶粉末可以就那样地直接使用，然而从操作性的角度出发，优选作为浸渍或浸润到油脂中的脂肪酶组合物来使用。在这里，脂肪酶组合物中的油脂的质量，相对于脂肪酶粉末优选是0.1～20倍，更优选是1～20倍。
可以通过如下方法容易地获得该脂肪酶组合物在通过喷雾干燥等来制造的脂肪酶粉末中添加油脂，用搅拌器或三一电动机(three-one motor)等均匀搅拌的方法；或者在喷雾干燥器的粉末回收部预先添加油脂，回收后均匀搅拌，通过过滤除去过量油脂的方法。
作为含浸到脂肪酶粉末中的油脂，没有特别的限制，可以列举菜籽油、大豆油、高油酸向日葵油、橄榄油、红花油、玉米油、棕榈油、芝麻油等的植物油，三油酸甘油酯(甘油三油酸酯)、三辛酸甘油酯(甘油三辛酸酯)、三乙酸甘油酯(甘油三醋酸酯)、三丁酸甘油酯(甘油三丁酸酯)等的三酰基甘油类，脂肪酸酯，甾醇酯等的一种或多种的混合物。
在脂肪酶为1，3-特异性脂肪酶的情况下，特别是得自米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)或产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)的脂肪酶的情况下，根据本发明，该脂肪酶的1，3-选择性极其高，因此可适宜将该脂肪酶粉末作为酯交换用脂肪酶或酯化用脂肪酶来使用。使用该脂肪酶粉末，按照常规方法，可以有效地进行油脂等的酯交换反应、油脂与脂肪酸酯的酯交换反应、醇解和酸解的酯交换反应、或者甘油与脂肪酸的酯化反应。
根据本发明，可提供一种脂肪酶活性和稳定性提高了的脂肪酶粉末。另外，在脂肪酶为1，3-特异性脂肪酶的情况下，其1，3选择性显著提高，可以以极高的比例将原料甘油三酯2位上的脂肪酸残基保持在酯交换制品中。
下面通过实施例更详细地描述本发明。
实施例1
脂肪酶溶解·分散于水溶液中的形态的ノボザイムズジヤパン(株)公司制造的得自米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的液体脂肪酶(商品名称Palatase 20000L)，将其用UF模件(旭化成工业(株)公司制造的SIP-0013)除去低分子成分，得到含有脂肪酶的水溶液1(固体成分浓度20.1质量％)。具体地说，在冰冷却下对液体脂肪酶(Palatase 20000L)进行UF膜处理，浓缩到其体积的1/2量，然后添加与浓缩液等量的pH 7的0.01M磷酸缓冲液。对所得的溶液，进行同样的UF膜处理之后添加磷酸缓冲液的操作，重复2次该操作，然后再进行UF膜处理，得到的脂肪酶浓缩液作为含有脂肪酶的水溶液1。
相对于20ml该含有脂肪酶的水溶液1，添加20ml的牛乳(小岩井乳业(株)公司制造的小岩井牛乳おいしさしたて固体成分浓度12.9质量％)。使用氢氧化钠水溶液将由此获得的溶液调节到pH 6.8～6.9。
脂肪酶浓缩液(＝含有脂肪酶的水溶液1)∶牛乳的体积比是1∶1，牛乳的固体成分是含有脂肪酶的水溶液1的固体成分质量的0.64倍的量。
使用喷雾干燥器(SD-1000型东京理化器械(株)公司制造)，在入口温度130℃、干燥空气量0.7～1.1m3/min、喷雾压力11～12Kpa的条件下将该溶液进行喷雾，得到脂肪酶粉末。脂肪酶粉末颗粒的形状为球状，脂肪酶粉末的90质量％或90质量％以上，其粒径在1～100μm的范围内，平均粒径为7.6μm。粒径是使用HORIBA公司的粒度分布测定装置(LA-500)测定的。
另外，通过以下方法测定含有脂肪酶的水溶液中的固体成分浓度和牛乳的固体成分浓度。
用糖度计((株)シ一·アイ·エス公司制造的BRX-242)测定，作为Brix.％求出。
实施例2在实施例1中得到的脂肪酶浓缩液中添加与浓缩液等量的水，得到含有脂肪酶的水溶液2(脂肪酶浓缩液∶水的体积比是1∶1)。下面，除了用含有脂肪酶的水溶液2代替实施例1中含有脂肪酶的水溶液1之外，与实施例1相同地操作得到脂肪酶粉末。脂肪酶浓缩液∶水∶牛乳的体积比是0.5∶0.5∶1，牛乳的固体成分是含有脂肪酶的水溶液(UF)的固体成分质量的1.05倍的量。
实施例3在实施例1中得到的脂肪酶浓缩液中添加与浓缩液等量的pH 7的0.01M磷酸缓冲液，得到含有脂肪酶的水溶液3(脂肪酶浓缩液∶缓冲液的体积比是1∶1)。下面，除了用含有脂肪酶的水溶液3代替实施例1中含有脂肪酶的水溶液1之外，与实施例1相同地操作得到脂肪酶粉末。脂肪酶浓缩液∶磷酸缓冲液∶牛乳的体积比是0.5∶0.5∶1，牛乳的固体成分是含有脂肪酶的水溶液的固体成分质量的1.03倍的量。
实施例4在实施例1中得到的脂肪酶浓缩液中添加与浓缩液等量的pH8的0.01M磷酸缓冲液，得到含有脂肪酶的水溶液4(脂肪酶浓缩液∶缓冲液的体积比是1∶1)。相对于20ml该含有脂肪酶的水溶液4，添加10ml的牛乳(小岩井乳业(株)公司制造的小岩井牛乳おいしさしたて固体成分浓度12.9质量％)。使用氢氧化钠水溶液将由此获得的溶液调节到pH6.8～6.9。
脂肪酶浓缩液∶磷酸缓冲液∶牛乳的体积比是0.5∶0.5∶0.5，牛乳的固体成分是含有脂肪酶的水溶液的固体成分质量的0.52倍的量。
下面，与实施例1相同地操作，得到脂肪酶粉末。
实施例5
在实施例1中得到的脂肪酶浓缩液中添加与浓缩液等量的pH 8的0.01M磷酸缓冲液，得到含有脂肪酶的水溶液5(脂肪酶浓缩液∶缓冲液的体积比是1∶1)。相对于20ml该含有脂肪酶的水溶液5，添加2ml的鲜奶油(商品名称北海道纯正奶油35，高梨乳业(株)制造，固体成分浓度43质量％)。使用氢氧化钠水溶液将由此获得的溶液调节到pH 6.8～6.9。
脂肪酶浓缩液∶磷酸缓冲液∶鲜奶油的体积比是0.5∶0.5∶0.1，鲜奶油的固体成分是含有脂肪酶的水溶液的固体成分质量的0.34倍的量。
下面，与实施例1相同地操作，得到脂肪酶粉末。
实施例6在实施例1中得到的脂肪酶浓缩液中添加与浓缩液等量的pH8的0.01M磷酸缓冲液，得到含有脂肪酶的水溶液6(脂肪酶浓缩液∶缓冲液的体积比是1∶1)。相对于20ml该含有脂肪酶的水溶液6，添加20ml的泽西牛乳(Jersey cow milk)(阿苏小国ジヤ一ジ一4.5牛乳阿苏农业共同组合制造，固体成分浓度13.2质量％)。使用氢氧化钠水溶液将由此获得的溶液调节到pH 6.8～6.9。
脂肪酶浓缩液∶磷酸缓冲液∶牛乳的体积比是0.5∶0.5∶1，牛乳的固体成分是含有脂肪酶的水溶液的固体成分质量的1.06倍的量。下面，与实施例1相同地操作，得到脂肪酶粉末。
实施例7除了作为粉末化的方法进行冷冻干燥来代替喷雾干燥之外，与实施例1相同地操作而得到脂肪酶粉末。冷冻干燥如下进行将调节到pH6.8～6.9的含有脂肪酶的水溶液加入回收烧瓶中，用干冰甲醇冻结，然后用东京理化器械(株)公司制造的冷冻干燥器(FDU-830)，在0.15托(Torr)下冷冻干燥1～2天。干燥后，用研钵轻轻粉碎，得到脂肪酶粉末。
比较例1除了不添加牛乳之外，与实施例3相同地操作，得到脂肪酶粉末。脂肪酶浓缩液∶磷酸缓冲液的体积比是1∶1。
按照如下方法测定由此获得的脂肪酶粉末的脂肪酶活性。结果示于表-1中。
脂肪酶活性在以1∶1(w)的比例混合三油酸甘油酯与三辛酸甘油酯而成的油中加入粉末脂肪酶，在60℃下进行反应。随时间取样10μl，用1.5ml己烷稀释后，过滤掉粉末脂肪酶得到的溶液作为气相色谱分析的样品。通过气相色谱(柱DB-1ht)分析并按照下式求得反应速率。气相色谱条件是，柱温初期150℃，升温15℃/min，最终370℃，除此之外的条件与后述的1，3-选择性试验中的相同。
反应速率(％)＝{C34area/(C24area+C34area)}×100式中，C24代表三辛酸甘油酯，C34代表三辛酸甘油酯的一个脂肪酸被C18取代了的物质，area是它们的峰面积。
根据各时间下的反应速率，利用分析软件(Origin ver.6.1)求得反应速率常数K值。脂肪酶活性以比较例1的K值设为100时的相对活性来表示。
表-1
表中，bf(7)代表pH 7的0.01M磷酸缓冲液，bf(8)代表pH8的0.01M磷酸缓冲液。另外，除了实施例7之外，进行喷雾干燥。
由表-1的结果可知，根据本发明，脂肪酶的酶活性显著提高。
接下来，采用下面的方法测定实施例1、实施例7及比较例1的脂肪酶粉末的1，3-选择性。
1，3-选择性的测定方法使用1摩尔的1，3-二棕榈酸-2-油酸-甘油酯(Gryceryl-1，3-Palmitate-2-Oleate(POP))和3摩尔的辛酸乙酯(C8Et)作为反应底物，添加脂肪酶粉末使其根据酶活性成为底物的0.5～5w％，在60℃下进行反应，随时间抽样，并用己烷稀释。对该样品进行GC分析，并按照下式求得1·3位(C16:0Et)和2位(C18:1Et)的反应速率。
C16:0Et(％)＝{C16:0Et area/(C16Et+C18:1Et area+C8Et area)}×100C18:1Et(％)＝{C18:1Et area/(C16Et+C18:1Et area+C8Et area)}×100根据各时间下的各反应速率，利用分析软件(Origin ver.6.1)求得反应速率常数K。此时，最终反应速率的值是可变的。求出以2位的反应性设为1时的1，3位的反应性。
<GC条件>
柱DB-1ht 5m注入量1μl载体气氦气汽化室温度360℃检测器温度370℃柱温初期50℃，升温15℃/min，最终370℃结果示于表-2中。
表-2
由表-2的结果可知，根据本发明，1，3-特异性脂肪酶的1，3-选择性显著提高。
接下来，采用下面的方法测定实施例1和比较例1中得到的各脂肪酶粉末的稳定性。
稳定性测定方法5g三辛酸甘油酯和5g三油酸甘油酯在60℃下反应24小时～72小时，将各批次的初期活性的降低程度进行绘图，并由总反应时间和活性的降低称度计算出半衰期。
其结果，实施例1中得到的脂肪酶粉末的半衰期是913小时，比较例1中得到的脂肪酶粉末的半衰期是234小时，因此，可知根据本发明的脂肪酶粉末，稳定性提高2倍或2倍以上。
实施例8将名糖产业公司制造的粉末脂肪酶(商品名称脂肪酶QL，得自产碱杆菌属)悬浮于水中，得到含有脂肪酶的水溶液(固体成分浓度2.0质量％)。相对于20ml该含有脂肪酶的水溶液，添加2ml牛乳(小岩井乳业(株)公司制造的小岩井牛乳おいしさしたて固体成分浓度12.9质量％)。含有脂肪酶的水溶液∶牛乳的体积比是10∶1，牛乳的固体成分是含有脂肪酶的水溶液的固体成分质量的0.65倍的量。使用氢氧化钠水溶液将由此获得的溶液调节到pH 6.8～6.9。
使用喷雾干燥器(SD-1000型东京理化器械(株)公司制造)，在喷出口温度130℃、干燥空气量0.7～1.1m3/min、喷雾压力11～12Kpa的条件下对该溶液进行喷雾，得到脂肪酶粉末。脂肪酶粉末颗粒的形状为球状，脂肪酶粉末的90质量％或90质量％以上，其粒径在1～100μm的范围内，平均粒径为35μm。粒径是使用HORIBA公司的粒度分布测定装置(LA-500)测定的。
比较例2除了未添加牛乳之外，与实施例8相同地操作，通过喷雾干燥得到脂肪酶粉末。
测定这些脂肪酶粉末的脂肪酶活性，以比较例1的脂肪酶粉末的活性设为1时的相对值来表示。将总结结果示于表-3中。
表-3
由表-3的结果可知，根据本发明，脂肪酶活性提高约2倍。
实施例9在实施例1中得到的脂肪酶粉末中加入5倍量的菜籽油，使脂肪酶粉末含浸于菜籽油中，过滤除去过量的油脂，制得脂肪酶粉末/菜籽油的质量％为55/45的脂肪酶组合物。
比较例3将天野エンザイム(株)公司制造的得自米根霉(Rhizopusoryzae)的粉末(冷冻干燥)脂肪酶(脂肪酶D“アマノ”)以5质量％的浓度再悬浮于水中，使用喷雾干燥器(SD-1000型东京理科器械(株)公司制造)，在入口温度130℃、干燥空气量0.7～1.1m3/min、喷雾压力11～12Kpa的条件下进行喷雾，得到脂肪酶粉末。
实施例10将与比较例3相同的粉末(冷冻干燥)脂肪酶(脂肪酶D“アマノ”)以5质量％的浓度再悬浮于水中，相对于5ml该脂肪酶溶液，添加10ml牛乳(明治乳业(株)公司制造的明治おいしい牛乳固体成分浓度12.9质量％)。使用喷雾干燥器(SD-1000型东京理科器械(株)公司制造)，在入口温度130℃、干燥空气量0.7～1.1m3/min、喷雾压力11～12Kpa的条件下进行喷雾，得到脂肪酶粉末。
实施例11将与比较例3相同的粉末(冷冻干燥)脂肪酶(脂肪酶D“アマノ”)以5质量％的浓度再悬浮于水中，相对于5ml该脂肪酶溶液，添加10ml牛乳(明治乳业(株)公司制造的明治おいしい牛乳固体成分浓度12.9质量％)。将该脂肪酶溶液慢慢添加到150ml预先冷却到0℃以下的乙醇中，得到沉淀物。用离心分离机(ベツクマン公司制造GS-6KR)，在3000rpm、10分钟的条件下，回收所得的沉淀物，然后用干燥机(东京理科器械(株)公司制造FDU-830)减压干燥16～20小时，得到脂肪酶粉末。
测定这些脂肪酶粉末的活性，以比较例3的脂肪酶粉末的活性设为100时的相对值来表示。总结结果示于表-4中。
表-4
由表-4的结果可知，根据本发明，脂肪酶活性显著提高。
比较例4将天野エンザイム(株)公司制造的得自米根霉(Rhizopusoryzae)的粉末脂肪酶(脂肪酶F-AP 15)以15质量％的浓度再悬浮于水中，使用喷雾干燥器(SD-1000型东京理科器械(株)公司制造)，在入口温度130℃、干燥空气量0.7～1.1m3/min、喷雾压力11～12Kpa的条件下进行喷雾，得到脂肪酶粉末。
实施例12将与比较例4相同的粉末脂肪酶(脂肪酶F-AP15)以15质量％的浓度再悬浮于水中，相对于10ml该脂肪酶溶液，添加10ml牛乳(明治乳业(株)公司制造的明治おいしい牛乳固体成分浓度12.9质量％)。使用喷雾干燥器(SD-1000型东京理科器械(株)公司制造)，在入口温度130℃、干燥空气量0.7～1.1m3/min、喷雾压力11～12Kpa的条件下进行喷雾，得到脂肪酶粉末。
测定这些脂肪酶粉末的活性，以比较例4的脂肪酶粉末的活性设为100时的相对值来表示。总结结果示于表-5中。
表-5
由表-5的结果可知，根据本发明，脂肪酶活性显著提高。
比较例5使用喷雾干燥器(SD-1000型东京理科器械(株)公司制造)，在入口温度130℃、干燥空气量0.7～1.1m3/min、喷雾压力11～12Kpa的条件下，对ノボザイムズジヤパン(株)公司制造的得自棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的液体脂肪酶(商品名称Lipozyme T1 100L)进行喷雾，得到脂肪酶粉末。
实施例13相对于1ml的与比较例5相同的液体脂肪酶(商品名称Lipozyme T1 100L)，添加10ml牛乳(明治乳业(株)公司制造的明治おいしい牛乳固体成分浓度12.9质量％)。使用喷雾干燥器(SD-1000型东京理科器械(株)公司制造)，在入口温度130℃、干燥空气量0.7～1.1m3/min、喷雾压力11～12Kpa的条件下，将该脂肪酶溶液进行喷雾，得到脂肪酶粉末。
比较例6使用10ml的与比较例5相同的液体脂肪酶(商品名称Lipozyme T1 100L)，慢慢添加到60ml预先冷却到0℃以下的乙醇中，得到沉淀物。用离心分离机(ベツクマン公司制造GS-6KR)，在3000rpm、3分钟的条件下，回收所得沉淀物，然后用干燥机(东京理科器械(株)公司制造FDU-830)减压干燥16～18小时，得到脂肪酶粉末。
实施例14相对于1ml的与比较例5相同的液体脂肪酶(商品名称Lipozyme T1 100L)，添加10ml牛乳(明治乳业(株)公司制造的明治おいしい牛乳固体成分浓度12.9质量％)。将该脂肪酶溶液慢慢添加到60ml预先冷却到0℃以下的乙醇中，得到沉淀物。用离心分离机(ベツクマン公司制造GS-6KR)，在3000rpm、3分钟的条件下，回收所得沉淀物，然后用干燥机(东京理科器械(株)公司制造FDU-830)减压干燥16～20小时，得到脂肪酶粉末。
测定这些脂肪酶粉末的活性，以比较例5的脂肪酶粉末活性设为100时的相对值来表示。总结结果示于表-6中。
表-6
由表-6的结果可知，根据本发明，脂肪酶活性显著提高。
权利要求
1.一种脂肪酶粉末，其特征在于，该脂肪酶粉末是含有脂肪酶、和动物乳的固体成分的造粒物。
2.根据权利要求1所述的脂肪酶粉末，所述脂肪酶是1，3-特异性脂肪酶。
3.根据权利要求2所述的脂肪酶粉末，所述1，3-特异性脂肪酶是得自根毛霉菌属或产碱杆菌属的脂肪酶。
4.根据权利要求2所述的脂肪酶粉末，所述1，3-特异性脂肪酶是得自根霉属和嗜热真菌属的1，3-特异性脂肪酶。
5.根据权利要求3所述的脂肪酶粉末，所述1，3-特异性脂肪酶是得自米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的1，3-特异性脂肪酶。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的脂肪酶粉末，所述动物乳的固体成分是牛乳的固体成分或得自牛乳的奶油的固体成分。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的脂肪酶粉末，该脂肪酶粉末的水分含量为10质量％或10质量％以下。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的脂肪酶粉末，该脂肪酶粉末通过将动物乳或得自动物乳的奶油添加到含有脂肪酶的水溶液中，进行喷雾干燥、冷冻干燥或溶剂沉淀而获得。
9.根据权利要求8所述的脂肪酶粉末，在添加动物乳或得自动物乳的奶油之后，含有脂肪酶的水溶液的pH被调节到6～7.5。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的脂肪酶粉末，所述脂肪酶粉末的90质量％或90质量％以上，其粒径为1～100μm。
11.一种脂肪酶组合物，该脂肪酶组合物在油脂中浸渍或浸润有权利要求1～10中任一项所述的脂肪酶粉末。
12.根据权利要求11所述的脂肪酶组合物，前述脂肪酶组合物中的油脂的质量，相对于脂肪酶粉末是0.1～20倍。
13.一种脂肪酶粉末的制备方法，其特征在于，将动物乳或得自动物乳的奶油添加到含有脂肪酶的水溶液中，进行喷雾干燥、冷冻干燥或溶剂沉淀。
14.根据权利要求13所述的制备方法，所添加的动物乳或得自动物乳的奶油，以其固体成分计，是含有脂肪酶的水溶液中固体成分质量的0.1～20倍量。
15.根据权利要求13或14所述的制备方法，在添加动物乳或得自动物乳的奶油之后，将含有脂肪酶的水溶液的pH调节到6～7.5。
16.根据权利要求13～15中任一项所述的制备方法，所述含有脂肪酶的水溶液是除去菌体的脂肪酶培养液或其精制培养液。
17.根据权利要求13～16中任一项所述的制备方法，所述脂肪酶是得自根毛霉菌属或产碱杆菌属的脂肪酶。
18.一种酯交换用或酯化用脂肪酶，其含有权利要求1～10中任一项所述的脂肪酶粉末。
19.一种油脂的酯交换方法，其特征在于，使用权利要求18所述的酯交换用脂肪酶。
全文摘要
提供一种脂肪酶粉末，该脂肪酶粉末是含有脂肪酶、和动物乳的固体成分的造粒物；一种脂肪酶组合物，在油脂中浸渍或浸润有该脂肪酶粉末；以及一种脂肪酶粉末的制备方法，该方法包括将动物乳或得自动物乳的奶油添加到含有脂肪酶的水溶液中，进行喷雾干燥、冷冻干燥或溶剂沉淀。根据本发明可以提供脂肪酶活性和稳定性提高了的脂肪酶粉末。
文档编号C12P7/64GK1806043SQ20058000054
公开日2006年7月19日 申请日期2005年4月8日 优先权日2004年4月8日
发明者铃木顺子, 根岸聪, 新井有里, 樱井智香 申请人:日清奥利友集团株式会社