专利名称：一种高温脂肪酶基因及其应用方法
技术领域：
本发明涉及一种编码嗜热菌(Gebacillus species)TW-1脂肪酶的DNA序列及其表达产物，还涉及该含该酶基因的重组质粒和表达相应酶的重组菌株。
背景技术：
脂肪酶是一类可以催化分解酯酰甘油的水解酶类。它特异性地在油-水两相界面上分解酯酰甘油中的酯键，最终产物是甘油及不同链长的脂肪酸。同时，也可以催化逆反应，即甘油和脂肪酸的成酯反应。
不同于大多数水解酶类，脂肪酶的最独特之处在于其反应体系的非均一性。水溶性的脂肪美可以在油-水两相界面进行催化反应。
近年来，随着环境污染加剧、及人们环保意识的增强，人们对化学洗涤剂的抵制越来越明显，活性酶添加剂型洗涤剂越来越受到人们的青睐。目前，脂肪酶已成为国际上最重要的工业酶类之一。来源不同的脂肪酶的所具有底物专一性、稳定性、最适反应温度、pH、对金属离子及去污剂的耐受能力等都有显著的差异。其中，热稳定脂肪酶凭借其高度的热稳定性而具有更广泛的应用前景。
发明内容
本发明提供的脂肪酶新颖之处在于1、对热有较高的耐受范围(40-90度)；2、极端pH值有较宽的适应性(6.0-9.0)。3、对去污剂(Tween 20，Chaps或Triton X-100)及酶抑制剂(EDTA，2-ME，SDS，PMSF or DTT)有较强的耐受性。
本发明的目的是提供一种热稳定脂肪酶及其编码基因。一种热稳定脂肪酶，是指具有SEQ NO.2氨基酸序列(417个氨基酸)的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸取代、缺失或添加，并且具有序列2的相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种构建热脂肪酶工程菌及生产热稳定脂肪酶的方法及用该方法所生产的热稳定脂肪酶的应用。
当用大肠杆菌为宿主细胞时，得到大肠埃希氏菌[Escherichia coliBL21(DE3)]，该菌株已于2005年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC NoM205046。
附图1脂肪酶基因的克隆。泳道1，PCR回收产物；2，重组质粒双酶切产物(EcoR I+Hind III)；3，PCR回收产物。
附图2脂肪酶在大肠杆菌表达系统中的表达。泳道1，只含空载的菌，未诱导；2，只含空载的菌，诱导；3，含重组质粒的菌，未诱导；4，含重组质粒的菌，诱导。
附图3温度对酶活的影响。
A，重组酶与粗酶的最适反应温度测定。酶与底物在不同温度下反应15分，然后进行酶活测定。
B，重组酶与粗酶的温度耐受测定。酶先在不同温度下温育15分，然后加底物反应15分，再进行酶活测定。
附图4pH对酶活的影响。
A，重组酶与粗酶的最适反应pH测定。酶与底物在不同pH下反应15分，然后进行酶活测定。
B，重组酶与粗酶的pH耐受测定。酶先在不同pH下温育15分，然后加底物反应15分，再进行酶活测定。
附图5去污剂和抑制剂对酶活的影响。
重组酶和粗酶在抑制剂(1mM)及去污剂(0.1％)作用下酶活测定。
表1金属离子对酶活的影响。在不同浓度的金属离子作用下，对酶活的测定。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等所著的《分子克隆实验室手册》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.嗜热菌(Gebacillus species)TW-1总DNA的提取及脂肪酶基因的克隆采用从中国厦门东南部热泉分离的嗜热菌(Gebacillus species TW-1)，常规或采用基因组提取试剂盒提取其总DNA。采用下列简并引物Lip15’-ATGATGAAA(GT)GCTG(CT)CGG-3’，Lip25’-TTAAGGC(TC)GCAA(GA)CTCGC-3’，或者来源于简并引物的一对特异引物。PCR反应体系如下94℃，4分钟，一个循环；94℃，45秒，60℃，45秒，72℃，75秒，30个循环；72℃，7分钟一个循环。产物经1％琼脂糖电泳验证得到一个约1.2K的DNA片段。
实施例2.脂肪酶基因的DNA的重组，表达及酶的纯化采用基因工程工具酶，将扩增的DNA片段连接到质粒载体pETGST中。然后用连接产物Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布在LB平板(含Amp 100μg/ml)上。挑取阳性菌落，提取质粒。然后采用双酶切和测序的方法鉴定脂肪酶的DNA片段已正确重组进了表达载体。
挑取含有重组质粒的单菌落于5ml LB液体培养基(含Amp 100μg/ml)，37℃摇培过夜。吸取1ml菌液于新的1000ml LB液体培养基(含Amp100μg/ml)，37℃摇培至OD600为0.6左右，加入IPTG至终浓度0.5mM，继续震荡培养4hr。
菌液离心，去上清。将细胞用适量PBS(pH 7.4)重悬，超声裂解菌体，离心去沉淀，上清中的重组蛋白脂肪酶用GST柱进行亲和纯化。
实施例3.脂肪酶活性测定按照Ruiz et al[16][16]C.Ruiz，F.I.J.Pastor，P.Diaz，Analysisof Bacillus megaterium lipolytic system and cloning of LipA，a novelsubfamily I.4 bacterial lipase，FEMS Microbiol.Lett.217(2002)263-267.等建立的酶活测定方法10mM对硝基丁酸酯(p-nitrophenylbutyrate，PNPB)，溶于乙腈/乙醇/50mM磷酸钾缓冲液(1∶4∶95)[17].适量酶液与底物混合后，60℃温育15分钟，通过测定405nm波长下的吸光值判定酶活。[18].酶的定义为，每分钟释放出1μmol的PNPB的量的酶定义为一个单位。
实施例4.脂肪酶的性质鉴定(1)酶最适反应温度的测定酶与底物在不同温度下反应15分，通过405nm波长下的吸光值判定酶活。重组酶与粗酶的温度耐受测定。酶先在不同温度下温育15分，然后加底物反应15分，再进行酶活测定。
(2)重组酶与粗酶的最适反应pH测定酶与底物在不同pH下反应15分，然后进行酶活测定。重组酶与粗酶的pH耐受测定酶先在不同pH下温育15分，然后加底物反应15分，再进行酶活测定。
(3)去污剂和抑制剂对酶活的影响重组酶和粗酶在抑制剂(1mM)及去污剂(0.1％)作用15分钟后进行酶活测定。
(4)金属离子对酶活的影响在不同浓度的金属离子作用15分钟后，对酶活进行测定附序表SEQ NO.11 ATGATGAAAG GCTGTCGGGT TATGTTTGTG TTGCTCGGAT TATGGCTTGT ATTCGGCCTA61TCGGTCCCGG GAGGGCGGGC TGAAGCGGCA ACTTCACGCG CCAACGATGC ACCCATCGTG121 CTTCTCCATG GTTTTACCGG CTGGGGAAGA GAAGAAATGT TTGGGTTCAA GTACTGGGGC181 GGCGTGCGCG GCGATATCGA ACAATGGCTG AACGACAACG GTTATCGAAC TTATACGCTG241 GCGGTCGGAC CGCTCTCGAG CAACTGGGAC CGGGCGTGTG AAGCGTATGC TCAGCTTGTC301 GGCGGGACGG TCGATTATGG GGCAGCCCAT GCGGCAAAGC ACGGCCATGC GCGGTTTGGC361 CGCACTTATC CCGGCCTGTT GCCGGAATTG AAAAGGGGTG GCCGCATCCA TATCATCGCC421 CACAGCCAAG GGGGGCAGAC GGCCCGCATG CTTGTCTCGC TCCTAGAGAA CGGAAGCCAA481 GAAGAGCGGG AGTACGCCAA GGCGCACAAC GTGTCGTTGT CACCGTTGTT TGAAGGTGGA541 CATCATTTTG TGTTGAGTGT GACGACCATC GCCACTCCTC ATGACGGGAC GACGCTTGTC601 AACATGGTTG ATTTCACCGA TCGCTTTTTT GACTTGCAAA AAGCGGTGTT GGAAGCGGCG661 GCTGTCGCCA GCAACGTGCC GTACACGAGT CAAGTATACG ATTTTAAGCT CGACCAATGG721 GGACTGCGCC GCCAGCCGGG TGAATCGTTC GACCATTATT TTGAACGGCT CAAGCGCTCC781 CCTGTTTGGA CGTCGACAGA TACCGCCCGC TACGATTTAT CCGTTTCCGG AGCTGAGAAG841 TTGAATCAAT GGGTGCAAGC AAGCCCGAAT ACGTATTATT TGAGCTTTGC CACAGAACGG901 ACGTATCGCG GAGCGCTCAC AGGCAACTAT TATCCCGAAC TCGGAATGAA TGCATTCAGC961 GCGGTCGTAT GCGCTCCGTT TCTCGGTTCG TACCGCAATC CGACGCTCGG CATTGACGAC1021 CGCTGGCTTG AAAACGATGG TATTGTCAAT ACGGTTTCCA TGAACGGTCC AAAGCGTGGA1081 TCAAGCGATC GGATCGTACC GTATGACGGG GCGTTGAAAA AAGGGGTTTG GAATGACATG1141 GGAACGTACA ATGTCGACCA TTTGGAAATC ATCGGCGTTG ACCCGAATCC GTCATTTGAT1201 ATTCGCGCCT TTTATTTGCG ACTTGCCGAG CAGTTGGCGA GCTTGCAGCC TTAASEQ NO.21 MMKGCRVMFV LLGLWLVFGL SVPGGRAEAA TSRANDAPIV LLHGFTGWGR EEMFGFKYWG61GVRGDIEQWL NDNGYRTYTL AVGPLSSNWD RACEAYAQLV GGTVDYGAAH AAKHGHARFG121 RTYPGLLPEL KRGGRIHIIA HSQGGQTARM LVSLLENGSQ EEREYAKAHN VSLSPLFEGG181 HHFVLSVTTI ATPHDGTTLV NMVDFTDRFF DLQKAVLEAA AVASNVPYTS QVYDFKLDQW241 GLRRQPGESF DHYFERLKRS PVWTSTDTAR YDLSVSGAEK LNQWVQASPN TYYLSFATER301 TYRGALTGNY YPELGMNAFS AVVCAPFLGS YRNPTLGIDD RWLENDGIVN TVSMNGPKRG361 SSDRIVPYDG ALKKGVWNDM GTYNVDHLEI IGVDPNPSFD IRAFYLRLAE QLASLQP
权利要求
1.一种来源于嗜热菌的高温脂肪酶或其功能类似物，其核苷酸序列与SEQNO.1所示的核苷酸序列具有至少90％的同源性。
2.根据权利1要求1所述的酶或其功能类似物，其氨基酸序列与SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少90％的同源性。
3.一种编码权利要求1至2中任意一项所述的高温脂肪酶或其功能类似物的基因。
4.根据权利要求所述的基因，它具有SEQ NO.1所示的核苷酸序列。
5.一种含有权利要求4所述的核苷酸序列的重组质粒，是pLIP。
6.一种含有权利要求4或5所述的高温脂肪酶或其功能类似物的基因的表达载体。
7.一种含有权利要求6所述表达载体的重组杆菌。
8.一种含有权利要求7所述的表达载体的重组大肠杆菌BL-21LIP，保藏号为CCTCC NOM205046。
9.一种制备高温脂肪酶的方法，是重组大肠杆菌BL-21LIP，按微生物发酵和酶工程技术制备高温脂肪酶。
全文摘要
本发明属于酶基因工程和酶工程领域。具体地说，涉及一种编码嗜热菌(Gebacillus species)TW－1脂肪酶的DNA序列及其表达产物，还涉及含该酶基因的重组质粒和表达相应酶的重组菌株，及利用该工程菌制备热稳定脂肪酶的方法和应用。本发明提供的脂肪酶新颖之处在于1.对热有较高的耐受范围(40－90摄氏度)；2.极端pH值有较宽的适应性(6.0－9.0)。3.对去污剂(Tween 20，Chaps或Triton X－100)及酶抑制剂(EDTA，2－ME，SDS，PMSF or DTT)有较强的耐受性。
文档编号C12N15/55GK1900276SQ20051008564
公开日2007年1月24日 申请日期2005年7月21日 优先权日2005年7月21日
发明者章晓波, 李鹤宾 申请人:国家海洋局第三海洋研究所