专利名称：一种脂肪酶lip及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种脂肪酶及其基因和应用。
背景技术：
脂肪酶(Lipase, E.C.3.1.1.3),全称为三酰基甘油酰水解酶(triacylglycerolacylhydrolase),它属于α/β折叠酶家族,是一种丝氨酸水解酶。脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。脂肪酶具有优良的立体选择性，反应条件温和并且不会造成环境污染，因此在洗涤、食品、造纸等许多工业领域中均有广泛的应用。脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中，相对于动植物，微生物分泌的脂肪酶具有更广的底物专一性、作 用温度以及作用PH范围。虽然微生物分泌的脂肪酶具有很好的应用特性，但是寻找到适于工业化大生产的脂肪酶生产菌株还是十分困难。通过传统诱变育种以及优化发酵条件，可以一定程度的提高微生物产脂肪酶的能力，然而脂肪酶产量和活力的突破性提高还需要依赖于基因工程。目前，在基因工程操作过程中一般选用大肠杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母作为脂肪酶基因的表达宿主。由于在大肠杆菌中表达产量较低，蛋白易形成包涵体，产业化生产困难。因此采用真核生物，如酿酒酵母和毕赤酵母等作为表达宿主成为当前的主要趋势。到目前为止已有多种微生物的脂肪酶基因在毕赤酵母中实现了异源表达，如溜曲霉(Shi B H et al..Cloning and Expression of Aspergillus tamariiFS132 Lipase Gene in Pichia pastoris.1nt J Mol Sci, 2010，11 (6):2373-2382.)、米根霉(Minging S et al..Functional expression of Rhizopus oryzae lipase inPichia pastoris:high-level production and some properties.JBiotechnol, 1998,66(5):147-156.)、扩展青霉(袁彩，林琳，施巧琴.扩展青霉碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达.生物工程学报，2003，19⑵:31-36.)等，表达的酶活分别为20U/ml、231U/ml和260U/ml。关于黑曲霉脂肪酶的研究报道主要是集中在酶的分离纯化、固定化以及应用，关于其基因的克隆与表达方面的报道很少，仅有的报道中也只是将黑曲霉脂肪酶基因转化到大肠杆菌(Shu Z Y et al..Aspergillus niger lipase:genecloning, over-expression in Escherichia coli and in vitro refolding.BiotechnolLett，2007，29(12):1875-1879.)和毕赤酵母(舒正玉，杨江科，徐丽.黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达.武汉大学学报，2007，53 (2):204-208.)，并没有详细的研究重组工程菌株的酶活力以及酶学性质。总体上来说，目前所报道的脂肪酶重组酶的酶活力普遍较低，生产成本较高。因此筛选高比活酶基因，构建高效产酶微生物，进行基因改良，优化酶的性质，是当前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于黑曲霉的脂肪酶。本发明的再一目的是提供上述脂肪酶的基因。
本发明的再一目的是提供包含上述脂肪酶的重组载体。本发明的再一目的是提供包含上述脂肪酶的重组菌株。本发明的再一目的是提供一种高效表达脂肪酶的方法。本发明的再一目的是提供上述脂肪酶的应用。本发明从黑曲霉中分离纯化得到一种脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示:
权利要求
1.一种脂肪酶LIP，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一种脂肪酶基因lip，其特征在于，编码权利要求1所述的脂肪酶LIP。
3.如权利要求2所述的脂肪酶基因lip，其特征在于，其碱基序列如SEQID N0.2所示。
4.包含权利要求2所述的脂肪酶基因Iip的重组载体。
5.根据权利要求4所述重组载体为pPICZaA。
6.一种高效表达脂肪酶LIP的方法，其特征在于，包括以下步骤:1)用权利要求4所述的重组载体转化毕赤酵母细胞，得重组菌株；2)重组菌株在发酵罐中进行发酵，诱导重组脂肪酶的表达；以及3)发酵结束后，回收并纯化所表达的重组脂肪酶LIP。
7.权利要求1所述的脂肪酶LIP在洗涤、造纸、食品工业中的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种脂肪酶及其基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明是为了解决现有技术的不足，从黑曲霉中克隆得到一种脂肪酶基因。该脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达，可达到比现有技术更高的表达水平。因此，本发明的重组脂肪酶在工业生产中可大大降低生产成本，使其在洗涤、造纸、食品等工业中显示出更大应用潜力。
文档编号C12N9/20GK103074315SQ20121043124
公开日2013年5月1日 申请日期2012年11月1日 优先权日2012年11月1日
发明者王建荣, 李阳源, 罗长财, 钟开新, 陈丽芝 申请人:广东溢多利生物科技股份有限公司