一种脂肪酶的原核表达及应用和固定化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种脂肪酶的原核表达及应用和固定化方法，属于酶工程及分子生物 学应用领域。
【背景技术】
[0002] 脂肪酶是一类能够催化酯键水解及合成的丝氨酸水解酶类，广泛存在于动物、植 物、微生物中。然而微生物脂肪酶具有动、植物不可比拟的特点：具有种类来源丰富，生产成 本低，pH和温度稳定性范围广，底物特异性广等，其广泛运用于食品、油、脂肪、手性化合物、 皮革、化妆品、生物柴油等工业生产。然而现在绝大部分工业酶是来自于嗜温微生物中，不 适合恶劣的工业生产程序，例如在有机试剂，高温等环境中。
[0003] 酶的生物催化热稳定性允许酶催化反应在高温环境下进行，这高温环境下进行生 物催化反应具有明显的优势：1.较高的扩散率；2.增加脂质和其他疏水性底物在水环境中 的溶解度；3.减少基质的粘度；4.增加反应物的溶解度；5.高温环境下更高的反应效率； 6.降低微生物污染的风险。在有机溶剂中，脂肪酶催化转酯作用是一种新型工业化应用，例 如，生产类可可脂，母乳替代品"Betapol"，和生物柴油等等，其中一种非常有效的生物柴油 生产方法是在无溶剂系统中利用脂肪酶催化废油脂与甲醇的转酯反应，然而甲醇对酶具有 毒害作用，容易使酶失活，为此脂肪酶在有机溶剂中的活性及稳定性是其在工业生物催化 领域中重要的性质。
[0004] 为了考虑生物催化的应用，研究并发现新酶及其生物学性质是非常重要的，而 来源极端微生物中的酶具有很高的内在热稳定性和化学稳定性，为此来源极端微生物中 的酶的生产及酶学性质的研究引起学者的广泛研究。目前，一些极端嗜热菌的基因组已 经被完全测序，如海栖热袍菌（Thermotoga maritima MSB8)，甲烧嗜热菌（Methanopyrus kandleri AV19)，敏捷气热菌（Aeropyrum pernix)等等，其中一些羧酸水解酶已经被分离 和定性，显示出高的热稳定性及不同化学稳定性，为工业生物催化提供了重要的酶来源。 [0005] 虽然热稳定性脂肪酶在工业催化中具有很大的应用前景，由于工业化生产中追求 的是低成本，高效益，所以游离的脂肪酶不适合工业化生产要求，为此发明了酶的固定化技 术和细胞表面展示技术。酶的固定化技术是将酶吸附或者共价结合在固体材料上面，或者 将酶截留在有机或无机聚合物上，其一个非常重要的途径去提高酶的稳定性，循环利用性 等等，然而其中带有一些不可忽视的缺点：酶固定化程序中成本高并且耗时长，回收利用时 酶活力的丧失等。营养细胞表面展示是通过基因操作技术使外源蛋白与膜或者细胞壁上运 载蛋白共表达，从而实现了外源蛋白在细胞表面的定位，此技术使不仅外源蛋白保持相对 独立的空间结构和生物活性，同时也利于酶的回收利用。但是外源蛋白展示在细胞表面需 要进行跨膜转运，所以多聚体或大分子量蛋白很难展示在细胞表面，同时营养体细胞在恶 劣环境下容易破裂，不易回收利用。
[0006] 枯草芽孢杆菌孢子为内生，在初始孢子化时，前孢子体借助母细胞表达的衣壳蛋 白组装成成熟孢子体，然后使母细胞破裂，释放成熟孢子，经过简单的离心就可以获得孢子 体。而且孢子具有独特的抗逆性，能很好的抵抗高温、强酸、强碱等不良环境的影响而长期 保持孢子状态。根据孢子的特性，近年来，新兴起了一门表面展示技术即枯草芽孢杆菌孢 子表面展示技术，其是基于细胞表面展示技术的原理，外源蛋白随着衣壳蛋白共表，然后组 装成孢子最外层的衣壳，从而实现了外源蛋白不需经过跨膜转运就能实现在孢子表面的定 位，该技术能很好的解决上述所呈现问题。
[0007] 起初，枯草芽孢杆菌孢子表面展示技术是用于口服疫苗及免疫原性的研究， Racele isticato等*(Isticato R, Cangiano G, Tran HT, Ciabattini A, Medaglini D, Oggioni MR, De Felice M, Pozzi G, Ricca E (2001) Surface display of recombinant proteins on bacillus subtilis spores. J Bacteriol 183: 6294-6301.)最先以 CotB 为锚定蛋白将破伤风毒素碳末端（TTFC)的459个氨基酸片段展示在孢子表面，并且将该孢 子饲喂小鼠后，在小鼠血清内检测到抗TTFC的IgG，说明了通过口服孢子表面展示的抗原 在生物体能具有很好的免疫效果。为此学者对孢子表面技术深入的研究并发现了其他的一 些衣壳运载蛋白，如CotC，CotG，CotX，CotE和OxdD，但是主要还是用于免疫原性的研 究。
[0008] 近年来，将酶展示在孢子表面作为酶的固定化是研究的新热点，因为展示在孢子 表面的酶具有很好的稳定性及回收利用性。而大部分的表面展示目的蛋白是通过构建一 个重组整合质粒将目的基因通过基因重组原理整合到枯草芽孢杆菌染色体DNA上，通过蓝 白班相同的原理，挑选产生淀粉酶失活的突变菌株。王楠等构建了一整合质粒，用CotC作 为锚定蛋白将家蚕的乙醇脱氢酶展示在孢子表面，且具有很高的活力。但是这中孢子表面 展示的方法具有一些缺点：操作复杂，转化成功率低，蛋白表达量低等等，而穿梭表达载体 的运用很好的解决这问题，曲媛媛等（Qu YY, Wang JW, Zhang ZJ, Shi SN, Li DX, Shen WL, Shen E, Zhou JT (2014) Catalytic transformation of hodas using an efficient meta-cleavage product hydrolase-spore surface display system. J Mol Catal B-Enzym 102: 204-210.)通过构建穿梭表达载体，用CotG作为锚定蛋白将一水解酶展示 在孢子表面，与纯化的游离酶和固定化在SBA-15介孔材料上的酶相比，其表现出更好的 酶活力和回循环利用率。而 Hinc, K 等（Hinc K, Isticato R, Dembek M, Karczewska J, Iwanicki A, Peszynska-Sularz G, De Felice M, Obuchowski M, Ricca E (2010) Expression and display of urea of helicobacter acinonychis on the surface of bacillus subtilis spores. Microb Cell Fact 9.)分别以 CotB,CotC，CotG 为锚定蛋白 将脲酶亚基UreA在孢子表面，发现虽然CotC，CotG展示的UreA的量比CotB的大一些，但 是其UreA不是展示在孢子的最外层，而CotB展示的UreA是暴露在孢子的表面，所以CotB 相比较而言是最佳的锚定蛋白去表面展示外源蛋白。
[0009] 热稳定性脂肪酶展示在耐热的孢子表面既能够共同耐受恶劣环境，拥有更好的稳 定性，而且还能通过简单的离心或过滤回收，具有很好的循环利用率。为此该发明具有更广 泛的应用前景。
【发明内容】
[0010] 为了克服酶在恶劣环境中不稳定甚至失活以及酶催化在工业化生产过程中的成 本问题，本发明将一种新的来自于极端嗜热菌（MSB8)的脂肪酶基 因构建到原核表达载体中，并转入原核表达宿主细胞，诱导重组脂肪酶的表达，然后纯化并 鉴定其酶学性质；利用分子克隆技术构建一高拷贝数的穿梭表达载体，以C〇tB为锚定蛋白 将脂肪酶固定在孢子表面。
[0011] 实现本发明的技术路线如下： 本发明提供一种新的来源于极端嗜热菌海栖热袍菌（ThermotogamaritimaMSB8)脂 肪酶基因(脂肪酶Tml350基因)，具有SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列，其基因编码具有SEQ IDN0. 2所示的氨基酸序列。以海栖热袍菌（ThermotogamaritimaMSB8)基因组DNA为模 板，PCR获得该脂肪酶基因片段。
[0012] 本发明提供一种脂肪酶Tml350基因的应用，该基因通过原核表达诱导重组脂肪 酶的表达，具体操作包括以下步骤： 1) 构建含有脂肪酶核苷酸序列的原核表达载体； 2) 获得含有重组原核表达载体的宿主细胞； 3) 获得重组脂肪酶。
[0013] 所述构建的原核表达载体为pET-28a-Tml350; 所述原核表达的宿主细胞为凡co/i BL 21 (pET-28a-Tml350)。
[0014] 其中获得脂肪酶Tml350基因制备的重组脂肪酶，具体方法为，将重组宿主细胞 万.coBBL21 (pET-28a-Tml350)用IPTG进行诱导培养，超声破碎诱导表达后的菌体，离心 分离上清和沉淀，通过SDS-聚丙烯酰胺胶检测上清和沉淀，发现表达的重组脂肪酶为包涵 体蛋白，通过尿素溶解，Ni-NTA纯化及尿素梯度复性，获得纯的高活性脂肪酶。
[0015] 纯化后的脂肪酶具有底物广泛性，很好的热稳定性，耐碱性，甲醇激活性及耐甲醇 性。
[0016]