专利名称：一种脂肪酶产生菌及其筛选方法和产业化应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种脂肪酶产生菌及其筛选方法和产业化应用，属于食品行业脂肪酶有机相中合成芳香酯技术领域。
背景技术：
芳香酯是一类短链脂肪酸酯，呈天然水果香味，是香精、香料的重要组分，广泛应用于酿造、食品、饮料、医药及化妆品等日常生活用品中。在我国，仅饮料工业用己酸乙酯年需求量就达三千吨左右。目前全球芳香酯的生产，除极少数酯是从天然植物中提取外，全部都是通过传统的化学合成法生产，产品的纯度及安全性难以保证，有些还给环境带来许多负面影响。尽管目前化学合成脂肪酸酯还比较经济，但随着人们对绿色食品的追求和天然产物的青睐，直接从植物中提取又无法满足日益增长的需求，人们开始把目光投向生物转化的方法来生产。
大曲是我国酿造酒用的糖化剂，发酵剂，同时也是生香剂，是大曲酒曲香的来源，其中含有大量的微生物，特别是富含产酯香的微生物。大多数芳香酯是白酒里的重要风味物质，因此有可能大曲中含有能高效稳定地在有机溶剂中催化合成这些芳香酯合成的脂肪酶产生菌。
发明内容
(1)要解决的技术问题本发明的目的是提供一种脂肪酶产生菌及其筛选方法和产业化应用，用于脂肪酶有机相中合成芳香酯。
(2)技术方案从中国大曲中分离得到一株华根霉。该菌株纯培养物已经于2001年6月24日保藏于武汉中国典型培养物保藏中心(命名为Rhizopus chinensis CCTCCM201021)。其在形态特征上更接近华根霉，但在生理生化特征上与所选的作为标准的华根霉(Rhizopus chinensis Saito AS3.1166)比较还有些差别，根据Arnsworth的真菌分类系统，属接合菌亚门，接合菌纲，毛霉目，毛霉科，根霉属，华根霉种(Rhizopus chinensis)；Rhizopus chinensis CCTCC M201021菌株的筛选先采用短链脂肪酸酯和/或长链脂肪酸酯为底物，以微生物分解短链脂肪酸酯和/或长链脂肪酸酯的能力为初筛指标；以微生物对有机溶剂的耐受性能为第一次复筛指标；再以微生物在有机相中合成脂肪酸酯的能力为再复筛指标；组合以上三种筛选方法从中国传统大曲曲样或酒醅，经过稀释涂布平板，单菌落移接斜面培养基，摇瓶培养，离心，上清液注初筛平板孔，挑取透明圈或荧光圈较大的菌株加入含有1～10％庚烷溶剂环境中摇瓶培养测定溶剂环境脂肪酶活力进行第一次复筛，将第一次复筛得到的微生物摇瓶培养后通过离心，菌体冷冻干燥制得酶制剂后以有机相合成脂肪酸酯能力为指标再复筛，菌体冷冻干燥制得全细胞酶制剂。
取0.5～5克大曲曲样或酒醅溶于15～150ml无菌生理盐水摇床震荡30～150分钟，再稀释，涂布平板后单菌落移接斜面培养基，25～35℃恒温培养2～5天，单菌落移接斜面，待斜面孢子成熟后，25～35℃，150rpm/m，摇瓶培养2～5天，进行初筛比较酶活，挑取透明圈和/或荧光圈较大的菌进行摇瓶复筛；选定具有较高脂肪酶酶活的菌株，加入含有1～10％庚烷的培养基中，25～35℃，150rpm/m，摇瓶培养2～5天，测定酶活，进行复筛比较微生物对溶剂环境的耐受性；筛选得到较高活力的菌株，25～35℃，100～300rpm/m，摇瓶培养2～5天，培养液在6000rpm/m下离心5分钟后，上清液及菌体分别冷冻干燥制得酶制剂后以有机相合成脂肪酸酯能力为指标再复筛，菌体冷冻干燥制得全细胞酶制剂；培养条件为接种量为0.1～5×106个/mL，产酶培养基条件为豆饼粉3～10％，蛋白胨3～10％，葡萄糖0.2～5％，K2HPO40.1～3％，MgSO4.7H2O0.01～0.5％，CaCL20.001～0.05％，pH6～9，50～300rpm，摇瓶培养48～120h，酶活可达400u/g。
初筛比较酶活的两种方法三丁酸甘油酯乳化液透明圈法(以短链脂肪酸酯为底物)用3.0％的P.V.A溶液制备含100g/L三丁酸甘油酯的乳液，225mL磷酸缓冲液(pH7.5)中加入25mL三丁酸甘油酯乳化液和1.5％的琼脂粉，0.1MPa、灭菌20min。在无菌平皿中倒入上面的热溶液20mL，凝固后打出直径0.5cm的小孔，注入30uL酶液，34℃保温24h后测透明圈大小，以初步比较酯酶酶活的高低。
橄榄油荧光圈法(以长链脂肪酸酯为底物)用3.0％的P.V.A溶液制备含250mL/L橄榄油乳化液，225mL磷酸缓冲液(pH7.5)中加入25mL橄榄油乳化液和1.5％的琼脂粉，0.1MPa灭菌20min，冷却至60℃后加入0.001％的过滤灭菌的罗丹明B，在无菌平皿中倒入该溶液20mL，凝固后打出直径0.5cm的小孔，注入30uL酶液，34℃保温24h，在自然光下测荧光圈大小，以比较脂肪酶活力高低。
脂肪酶酶活测定取100mL三角瓶两只，分别加乳化液(3％PVA∶橄榄油＝3∶1)4mL和0.02mol/L、pH7.5的磷酸缓冲液5mL，置40℃水浴内预热5～10min，在其中一瓶中先加入1mL酶液，立即计时，反应15min后立即加入95％的乙醇15mL终止反应。空白先加入乙醇，其余同上。酚酞作指示剂，用0.05mol/LNaOH溶液滴定至终点，计算所消耗的体积之差。在40℃、pH7.5的条件下，脂肪酶水解脂肪每分钟产生1umol脂肪酸的酶量定义为1个酶活单位。
脂肪酶有机相中脂肪酸酯合成能力的测定发酵上清液和/或菌体冷冻干燥，取冷冻干燥酶粉若干(酶活在300u以上)，加入经分子筛脱水的0.4mol/L的己酸和乙醇于10mL庚烷中，在150mL带筛磨口三角瓶中，150r/m，38℃下反应1.5天，取过滤后的反应液进行气相色谱分析，以反映脂肪酶合成脂肪酸酯的能力。
微生物的初筛从五粮液、沙河、剑兰春、洋河酒厂的大曲和酒醅中经平板分离共得到730多株菌，包括细菌、酵母、放线菌和霉菌。其中，细菌17株，酵母20株，放线菌5株，其它均为霉菌。经初筛发现绝大多数霉菌均产一定的脂肪酶。同时发现，荧光圈和透明圈存在不一致的情况，表明这些菌所产脂酶对底物作用存在差异，或者所产酶为酯酶和脂肪酶的混合产物。取透明圈大于1.2cm和/或荧光圈大于0.9cm的菌进行摇瓶复筛。
微生物的第一次复筛经初筛得到56株透明圈/荧光圈较大的菌株，加入含有2％庚烷的培养基摇瓶培养后，分别测定其透明圈和/或荧光圈两种圈的大小和并用滴定法测酶活。以观察微生物菌株对溶剂环境的适应能力，筛选出耐有机溶剂且具有较高脂肪酶活力的菌株。筛选得到5株较高活力的菌株进行再复筛。
再复筛根据第一次复筛结果，选出其中透明圈和/或荧光圈及酶活均较高的菌株发酵离心后将菌体冷冻干燥后测定其在庚烷等有机溶剂中合成己酸乙酯的能力，得到两株在再复筛中具有较高的酯合成活力的菌株。其中Rhizopuschinensis CCTCC M201021不仅产酶最高，合成能力也很强。同时可见，对于不同的菌株，滴定酶活与酯化率之间并无相关性。因此，初筛以分解酶活为参数时，为减少漏筛，应尽可能选择多一点的平板筛子。因Rhizopuschinensis CCTCC M201021酯化率较高，酶活也较高，在有机相合成中，己酸乙酯的转化率也较高。
Rhizopus chinensis CCTCC M201021的初步鉴定鉴定菌种的属别，了解其基本的生理生化特性，对有效地利用已有文献、指导进一步的实验有着重要作用。为此，根据文献的方法对Rhizopus chinensisCCTCC M201021进行了形态和生理生化特性的鉴定，并与标准菌株华根霉(Rhizopus chinensis Saito AS3.1166)、少根根霉(Rhizopus arrhizus Fisher AS3.2893)进行了比较。
形态特征将Rhizopus chinensis CCTCC M201021接种于PDA培养基，28℃培养，首先有毛绒状菌丝长出，然后向四周蔓延，生长旺盛时菌丛高度达0.5cm左右，呈毛发状。菌丝初期为白色，老熟后变为灰黑色至黑色，并有大量黑色孢子产生。其菌落形态见图1。
生理生化特征比较载片培养光学显微镜下可观察到Rhizopus chinensis CCTCC M201021菌丝呈匍匐枝状，有隔膜，包囊柄直立，无分支，假根呈短指状，但极不明显，孢子囊球形或近似球形，黑色，孢子多为球形，也有椭球形，有暗色条纹，孢子可一端也可多端出芽生长，有性孢子为接合孢子，见图2。
对照标准菌株华根霉与Rhizopus chinensis CCTCC M201021形态上接近，但生长缓慢些，菌落要疏松些；少根根霉生长更为缓慢些，菌丝老熟后变为灰色，并产灰色孢子，无假根。
Rhizopus chinensis CCTCC M201021在形态特征上更接近华根霉，但在生理生化特征上与所选的作为标准的华根霉比较还有明显差别，如Rhizopuschinensis CCTCC M201021在实验温度范围内41℃生长一般，45℃不生长，而标准华根霉在45℃仍生长良好；Rhizopus chinensis CCTCC M201021在环境pH达8.1时已经不生长，而标准华根霉在pH8.5时仍生长良好。这可能是菌株来源不同产生的。综合以上特征，根据Ainsworth的真菌分类系统，属接合菌亚门，接合菌纲，毛霉目，毛霉科，根霉属，华根霉种，因这株菌是从洋河大曲中分离得到的，特将其命名为Rhizopus chinensis CCTCC M201021。
脂肪酶产生菌的应用制得的全细胞酶制剂用于2500L规模上有机相中芳香酯的转化合成；脂肪酸为3～18C的饱和一元酸，18C的油酸，脂肪醇为2～18C的伯醇，4～5C的仲醇，0.1～2.0mol/L的底物浓度下，搅拌反应24～120小时，转化率达到96％以上，酶半衰期1000小时以上。
3)有益效果发酵液经过冷冻干燥得到的Rhizopus chinensis CCTCC M201021酶制剂用于己酸乙酯的转化合成，酯化率较高，达到96％以上，酶活也较高，接近21U/ml。与自由酶或固定化酶相比，全细胞酶提供了在有机溶剂中催化反应的“微环境”，保持高效稳定的催化作用。
图1Rhizopus chinensis CCTCC M201021菌丝形态显微照片图2Rhizopus chinensis CCTCC M201021孢子形态电镜照片具体实施方式
实施例1取0.5g曲样或酒醅，加入15mL无菌生理盐水摇床振荡30min，再经适当稀释，涂布平板，置28℃恒温培养箱培养2～3天，单菌落划斜面，待斜面孢子成熟后接一环于初筛摇瓶，28～30℃，150r/m旋转式摇床发酵3天。发酵液在6000r/m离心5min，取上清液30uL注初筛平板小孔，取荧光圈和/或透明圈较大的菌进行摇瓶复筛，再复筛，发酵液经离心，上清液测酶活，上清液和菌体分别经冷冻干燥，制得全细胞华根霉脂肪酶酶制剂。
权利要求
1.一种脂肪酶产生菌，其特征是菌株从中国大曲中分离得到的一株华根霉(已保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，命名为Rhizopus chinensis CCTCCM201021)，其在形态特征上更接近华根霉，但在生理生化特征上与所选的作为标准的华根霉(Rhizopus chinensis Saito AS3.1166)比较还有些差别，根据Ainsworth的真菌分类系统，属接合菌亚门，接合菌纲，毛霉目，毛霉科，根霉属，华根霉种(Rhizopus chinensis)。
2.一种权利要求1所述的脂肪酶产生菌的筛选方法，其特征是先采用短链脂肪酸酯和/或长链脂肪酸酯为底物，以微生物分解短链脂肪酸酯和/或长链脂肪酸酯的能力为初筛指标；以微生物对有机溶剂的耐受性能为第一次复筛指标；再以微生物在有机相中合成脂肪酸酯的能力为再复筛指标；组合以上三种筛选方法从中国传统大曲曲样或酒醅，经过稀释涂布平板，单菌落移接斜面培养基，摇瓶培养，离心，上清液注初筛平板孔，挑取透明圈或荧光圈较大的菌株加入含有1～10％庚烷溶剂环境中摇瓶培养测定溶剂环境脂肪酶活力进行第一次复筛，将第一次复筛得到的微生物摇瓶培养后通过离心，菌体冷冻干燥制得酶制剂后以有机相合成脂肪酸酯能力为指标再复筛，菌体冷冻干燥制得全细胞酶制剂；取0.5～5克大曲曲样或酒醅溶于15～150ml无菌生理盐水摇床震荡30～150分钟，再稀释，涂布平板后单菌落移接斜面培养基，25～35℃恒温培养2～5天，单菌落移接斜面，待斜面孢子成熟后，25～35℃，150rpm/m，摇瓶培养2～5天，进行初筛比较酶活，挑取透明圈和/或荧光圈较大的菌进行摇瓶复筛；选定具有较高脂肪酶酶活的菌株，加入含有1～10％庚烷的培养基中，25～35℃，150rpm/m，摇瓶培养2～5天，测定酶活，进行复筛比较微生物对溶剂环境的耐受性；筛选得到较高活力的菌株，25～35℃，100～300rpm/m，摇瓶培养2～5天，培养液在6000rpm/m下离心5分钟后，上清液及菌体分别冷冻干燥制得酶制剂后以有机相合成脂肪酸酯能力为指标再复筛，菌体冷冻干燥制得全细胞酶制剂；培养条件为接种量为0.1～5×106个/mL，产酶培养基条件为豆饼粉3～10％，蛋白胨3～10％，葡萄糖0.2～5％，K2HPO40.1～3％，MgSO4.7H2O0.01～0.5％，CaCL20.001～0.05％，pH6～9，50～300rpm，摇瓶培养48～120h，酶活可达400u/g。
3.一种权利要求1所述的脂肪酶产生菌的应用，其特征是制得的全细胞酶制剂用于有机相中芳香酯的转化合成；脂肪酸为3～18C的饱和一元酸，18C的油酸，脂肪醇为2～18C的伯醇，4～5C的仲醇，0.1～2.0mol/L的底物浓度下，搅拌反应24～120小时，酶半衰期1000小时。
全文摘要
一种脂肪酶产生菌及其筛选方法和产业化应用，属于食品行业中有机相中芳香酯合成用脂肪酶产生菌技术领域。该菌株是从中国大曲中分离得到的一种华根霉，命名为Rhizopus chinensis CCTCC M201021。其筛选方法是取曲样或酒醅。经过稀释涂布平板，单菌落移接斜面培养基，摇瓶培养，离心，上清液注初筛平板孔，挑取透明圈和/或荧光圈较大的菌进行摇瓶发酵复筛，再复筛。菌体冷冻干燥制得全细胞华根霉脂肪酶酶制剂。制得的脂肪酶酶制剂用于有机相中芳香酯的转化合成。
文档编号C12N9/20GK1443841SQ0311327
公开日2003年9月24日 申请日期2003年4月22日 优先权日2003年4月22日
发明者徐岩 申请人:江南大学