一种蜂球囊菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法
【专利摘要】本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种蜂球囊菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法。所述培养基的原料含有乳化橄榄油5%（w/v），果糖0.25--2%（w/v），酵母浸粉0.05--0.4%（w/v），Na+0.015-0.12mol/L，VB20.005-0.04%（w/v），pH7.4-7.7，将发酵种子液接种于该培养基，250mL的三角瓶装液量为75mL，接种量5%，于25℃，转速120r/min下培养。本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于蜂球囊菌发酵生产脂肪酶的培养基，具有脂肪酶产率高，脂肪酶活力高等优点。
【专利说明】一种蜂球囊菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法【技术领域】
[0001]本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种蜂球囊菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法。
【背景技术】
[0002]蜜蜂球囊菌是寄生于蜜蜂幼虫的一种真菌,可以引起蜜蜂白垩病。蜜蜂白垩病不仅使蜜蜂数量减少，而且蜂蜜产量也下降，近几年，有证据表明这种病的发生概率有增加的趋势。蜜蜂球囊菌也是影响我国养蜂业发展的潜在病害之一，对我国养蜂业的发展影响巨大。本发明就是希望从脂肪酶上分析蜜蜂球囊菌，提高脂肪酶的产量，对推动蜜蜂白垩病的防治研究具有指导性意义，为以后蜜蜂球囊菌的致病机理的研究奠定了基础。
[0003]脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是广泛存在于各类动物、植物和微生物中的一种酶，在脂质代谢中发挥重要的作用，具有显著的生理意义和生产应用的潜能。微生物来源的脂肪酶含量最为丰富。由于微生物种类多、繁殖快，易发生遗传变异，产生的脂肪酶具有比动植物脂肪酶作用更广的PH值、反应温度范围以及底物专一性；而且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和样品提纯，因此，微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，是生物技术和有机化学应用中使用最为广泛的酶类之一。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种蜂球囊菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法。
[0005]本发明首先提供了一种蜂球囊菌发酵生产脂肪酶的培养基，培养基的原料含有乳化橄榄油5% (w/v)，果糖0.25—2% (w/v)，酵母浸粉0.05— 0.4% (w/v), Na+0.015-0.12 mol/L, VB2 0.005-0.04 % (w/v)，pH7.4—7.7。
[0006]本发明优选的一种蜂球囊菌发酵生产脂肪酶的培养基含有乳化橄榄油5% (w/v),果糖 2% (w/v)，酵母浸粉 0.4% (w/v), NaCl 0.015mol/L, VB2 0.02 % (w/v)，pH7.4。
[0007]其次，本发明还提供了一种蜂球囊菌发酵产脂肪酶的方法，所述方法包含以下步骤:
(a)将蜂球囊菌(郑志阳，李江红，梁勤，陈大福.蜜蜂球囊菌分泌多种胞外酶侵染蜜蜂幼虫.福建农林大学学报，2011，40(3)，9月30日)接种于种子培养基，制得发酵种子液；
(b)将步骤(a)中制得的发酵种子液接种于上述发酵生产脂肪酶的培养基中，250mL的三角瓶装液量为75mL，接种量5%，于25°C，转速120 r/min下培养。
[0008]所述种子培养基PDA的原料含有:按培养基重量计，马铃薯20%，蔗糖2%。
[0009]采用本发明优化后的培养基，菌龄3d，发酵周期96h，发酵产生结果蜂球囊菌产脂肪酶为14U/mL以上。
[0010]本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于蜂球囊菌发酵生产脂肪酶的培养基，具有脂肪酶产率高，脂肪酶活力高，脂肪酶活性稳定以及重复性好等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为对硝基苯酚标准曲线。
【具体实施方式】
[0012]本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
[0013]实施例1
单因素实验确定培养基最优成分
(I)种子培养基配制:马铃薯去皮，切块，称取200g，沸水煮30min，6层纱布过滤，称取20g葡萄糖,加蒸懼水定容至1000mL, pH自然。高压灭菌121。。，20min。
[0014](2)发酵种子液的制备:将蜂球囊菌接种于马铃薯琼脂培养基上，于30°C下培养3d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株用接种针将蜂球囊菌菌块(0.5X0.5cm)接种至种子培养基，25°C，转速120 r/min下培养48h即为发酵种子液。
[0015](3)酶液的制备:取步骤(2)中的发酵种子液接种发酵培养基，25°C，转速120 r/min下培养72h，所得发酵液在4°C下，8000 r/min离心，lOmin，得上清液即为粗酶液，4°C
保存，待用。
[0016](4)脂肪酶酶活测定:酶活测定方法采用对硝基苯酚法。酶活定义为:在PH
8.0、50 °C条下,每分钟水解p-NPP释放I ii mo I对硝基苯酹(p-nitrophenol)所需的酶量为I个脂肪酶活力单位(U)。
[0017]方法:溶液A: 150 mg p-NPP溶于50 mL异丙醇；溶液B:500 mL pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中加入2.22 g Triton X-100和0.56 g阿拉伯胶。
[0018]取2个试管(分别是对照管和样品管)，各加溶液B 2.85 mL和底物溶液A 0.1 mL(缓慢混合，该溶液至少可稳定2 h)。50 °C水浴中预热5 min，然后在对照管中加入已灭活的酶液0.05 mL，样品管中加入酶液0.05 mL，立即混匀计时。在水浴中准确反应10 min时马上测定410 nm下酶水解产生的p-nitrophenol的吸光度值(OD41t!值)。酶活计算公式:A= CtA1 - A0] XK + C0) XV1XN / (V2Xt)
A——样品酶活(u/mL) A1——样品的吸光度值(OD410值)A0——空白对照的吸光度值
(OD410值校准为0) K-p-nitrophenol标准曲线的斜率
C0-p-nitrophenol标准曲线的截距N-稀释倍数V1-反应液的体积(3 mL)
V2——酶液的体积(0.05 mL) t——反应时间(10 min)
(5)标准曲线的制作:
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[0019](6)不同碳源、氮源、金属离子、维生素对产脂肪酶的影响
(a)碳源对酶产量的影响，在含有乳化橄榄油50.0 g / L，K2 HPO4 1.0 g / L，CaCl20.lg/ L, NaCl 0.5 g / L，Mg2SO4 ? 7H20 0.1 g / L, (NH4)2SO4 l.0g/ L，的培养基中分别添加10.0 g / L葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、海藻糖、木糖醇、甘露醇、a-乳糖、可溶性淀粉、D-山梨醇、甲壳素、糊精、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、柠檬酸，以不加任何碳源为对照。0.1MPa，灭菌20min (下同)。各接入10%的种子发酵液，在25°C、120r/min的摇床中培养4d测酶活，结果见表1。
[0020](b)氮源对酶产量的影响，在含有乳化橄榄油50.0 g / L，K2 HPO4 1.0 g / L，CaCl2 0.1 g / L, NaCl 0.5 g / L, Mg2SO4 ? 7H20 0.1 g / L，，葡萄糖 10.0 g / L 的培养基中分别添加1.0 g / L的胰蛋白胨、酵母浸粉、甘氨酸、过硫酸铵、蛋白胨、尿素、酸水解酪蛋白、NH4N03、NaN03、(NH4) 2S04、KN03、(NH4) 2HP04,以不加任何氮源为对照。灭菌，各接入10%的种子发酵液，在25°C、120r/min的摇床中培养4d检测酶活性，结果见表2。
[0021](C)金属离子对产酶的影响，在含有乳化橄榄油50.0 g / L、(MM)2SO4 1.0 g / L，葡萄糖10.0 g / L的培养基分别添加0.02496mol/L (以6 (a)中含有的金属离子按其浓度换算得来)KCUMgCl2 ? 6H20、NaCl、ZnCl2、CuCl2 ? 2H20、MnCl2 ? 4H20、CaCl2'FeCl2 ? 4H20、FeCl3 *6H20、BaCl2*2H20、，以不加任何金属离子为对照。灭菌，各接入10%的种子发酵液，在25°C、120r/min的摇床中培养4d检测酶活性，结果见表3。
[0022](d)维生素对酶产 量的影响，在含有乳化橄榄油50.0 g / L，K2 HPO4 1.0 g / L,CaCl2 0.1 g / L, NaCl 0.5 g / L, Mg2SO4 ? 7H20 0.1 g / L, (MM)2SO4 1.0 g / L，葡萄糖10.0 g / L的培养基中分别添加0.01%叶酸、烟酸、硫胺素VB1' VB4、核黄素VB2、吡哆醇类VB6、抗坏血酸V。、VE,以不加任何维生素为对照。灭菌，各接入10%的种子发酵液，在25°C、120r/min的摇床中培养4d检测酶活性，结果见表4。
[0023](e) pH值对酶产量的影响，在含有乳化橄榄油50.0 g / L，K2 HPO4 1.0 g / L，CaCl2 0.1 g / L, NaCl 0.5 g / L, Mg2SO4 ? 7H20 0.1 g / L, (MM)2SO4 1.0 g / L，葡萄糖10.0 g / L 的培养基中分别用 NaOH 或 HCl 调节 pH 值为 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，灭菌。各接入10%的种子发酵液，在25°C、120r/min的摇床中培养4d检测酶活性，结果见表5。
[0024]表1不同碳源对酶产量的影响
序+?-mm+平均_活 u:/n?L)
ICK丨6.10906
【权利要求】
1.一种蜂球囊菌发酵生产脂肪酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料含有乳化橄榄油 5% (w/v)，果糖 0.25—2% (w/v)，酵母浸粉 0.05— 0.4% (w/v), Na+ 0.015-0.12mol/L, VB2 0.005-0.04 % (w/v)，pH7.4—7.7。
2.一种如权利要求1所述蜂球囊菌发酵生产脂肪酶的培养基，其特征在于，所述培养基含有乳化橄榄油5% (w/v)，果糖2% (w/v)，酵母浸粉0.4% (w/v), NaCl 0.015mol/L,VB2 0.02 % (w/v), pH7.4。
3.—种蜂球囊菌发酵产脂肪酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤: (a)将蜂球囊菌接种于种子培养基，制得发酵种子液； (b)将步骤(a)中制得的发酵种子液接种于权利要求1或者2所述的发酵生产脂肪酶的培养基中，250mL的三角瓶装液量为75mL，接种量为5%，于25°C、转速120 r/min条件下培养。
4.如权利3所述蜂球囊菌发酵产脂肪酶的方法，其特征在于，所述种子培养基为PDA，其原料含有:按培养基重量计，马铃薯20%，蔗糖2%。
【文档编号】C12R1/645GK103484440SQ201310283999
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年7月8日 优先权日:2013年7月8日
【发明者】邱君志, 李小霞, 郭庆丰, 何肖云, 张以盼, 曹丽萍, 涂洁, 孟丽雪, 董冬, 陈大福 申请人:福建农林大学