专利名称：一种海洋枯草芽孢杆菌及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及海洋微生物应用生物技术及杉木根际土壤真菌病害防治， 具体的说是一种用于防治杉木人工林根际土壤真菌病害的海洋枯草芽孢杆 菌及其筛选方法。
背景技术：
杉木(0^m'唯/wm/a /朋ceo/ato)是我国特有的速生丰产的用材树种，分 布在我国南方的17个省、市、自治区，现有杉木人工林面积1214.07万公 顷，约占我国人工林总面积的24%。多年来的研究表明随着杉木连栽代 数的增加，杉木生产力就会下降，出现杉木连栽障碍。杉木纯林连栽，土 壤肥力下降，杉木幼苗立枯病害增加，土壤中有毒物质积累，土壤微生物 数量逐年减少，土壤中致害真菌增加，环境退化日益严重，栽种第3代杉 木土壤上的20年生杉木人工林较同年栽种第l代杉木，其胸径、树高和立 木蓄积分别降低22%、 30%和54%。杉木连栽引起生产力下降是一个普遍 现象，究其原因有很多，例如过去对土壤养分转化受阻，土壤养分含量下 降，土壤理化性状变劣，杉木病虫害增多报道较多，而对引起杉木连栽障 碍之一是土壤微生物多样性大大减少，对杉木生长致害的病原真菌明显增 多，经过微生物学鉴定杉木连栽土壤中主要致害菌中的尖孢镰刀菌萎蔫专 "(七型(^Fksan'w附 ovy5/ orw附 /5p.vas7>^c MW)， 正青毒菌(五wpe"/c/〃/w附 6^>/^"，附)等，所引起的杉木连栽土壤中毒，使杉木幼苗枯萎等毒害尤为 突出这方面的研究报道不多。近五年来，对杉木纯林连栽后出现真菌病原 菌增多，有毒物质积累，引起土壤中毒、地力下降，杉木幼苗立枯病严重 的情况，予以了足够的重视，但尚没有理想的、针对性的防治技术，亟需 早日能够有新的生防技术，解决杉木人工林土壤病害及地力衰退问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海洋枯草芽孢杆菌及其筛选方法，本发明 获得的海洋枯草芽孢杆菌菌种可用于防治杉木人工林根际土壤真菌病害， 进一步可制成用于杉木人工林土传真菌病害的防病减毒微生物制剂。
同时，本发明还提供了一种可以对杉木根际土壤真菌病害防治的海洋 枯草芽孢杆菌进行有效筛选的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为-
一种海洋枯草芽孢杆菌，其为Bflc/〃wwto7& 3728C，已经于2007年4月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，
保藏号为CCTCC No.M 207052。
所述海洋枯草芽孢杆菌的筛选方法为
1) 菌株丰刀f帝以纟工f对林(Afa"grove)白勺木禾览(万rwg/enaf gy附"ofr/ /za ) 幼根根表土壤为分离菌种的样品，将带有根表土壤的木榄幼年根样品剪成 0.5-4cm长小段，而后放于盛有海水的三角瓶中，三角瓶放在70-90。C水浴 中，热处理15-20分钟(以杀灭根表土壤样品中的非芽孢菌，达到有效分离 高活性目的菌株)，取出冷却，用稀释平皿分离方法涂平皿，进行初筛，初 筛平皿放在25-3(TC保温箱中保温培养36-60小时，以形态观察挑取单菌落， 编#;
戶)f述其木榄幼根为幼年支持根。此时的幼年根有弹性，筛管纤维中空， 似海绵状，有充气容氧的效果，此时的杉木幼年根根表土壤中的海洋芽孢 杆菌与木榄幼根间有联合共生的作用(老年根已木质化，无理想菌株可筛 选)，用此土壤样品作为筛选分离菌种的样品，经相互拮抗试验筛选与定向 筛选相结合方法进行菌种筛选后，可以获得目的菌株。
所述初筛用的培养基采用牛肉膏蛋白胨麦芽汁琼脂培养基，具体的说就 是以等重量的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，与等重量的糖度为波美7度的麦 芽汁琼脂培养基，分别装瓶，灭菌冷却，临用时分别加热融化，无菌室内 混合均匀倒平皿使用。
2) 菌株复筛将上述初筛得到形态特征为枯草芽孢杆菌典型的菌落，
移接到盛有牛肉膏蛋白胨琼脂的斜面试管中，分别挑取单菌落5-10个，放 置于25-30'C保温培养36-60小时，供复筛用；
复筛采用平皿拮抗试验方法，所述平皿相互拮抗试验筛选模型与定向筛 选相结合的方法，是以已经分离得到杉木人工林根际土壤中主要致害真菌 为靶标菌株，与已经分离纯化的木榄幼根根表土壤中得到海洋芽孢杆菌菌 株之间进行拮抗试验筛选与定向筛选相结合的方法，筛选出高活性的海洋 芽孢杆菌。
具体为以杉木根际土壤病害真菌为靶子菌，按常规方法在平皿上进行 对峙的拮抗试验，在25-3(TC保温36-60小时，取出平皿，检测初筛菌株对 靶子菌的抑菌圈大小，抑菌圈直径达到16mm或16mm以上的为合格，择 优保存；
所述杉木根际土壤病害真菌为尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fwar/z^
3) 已复筛选定的海洋枯草芽孢杆菌可以进行杉木一年生实生苗盆栽土 壤中的定殖试验；
定殖试验将海洋枯草芽孢杆菌试管斜面菌种，移接扩繁，然后在 25-3(TC保温培养36-60小时，此时海洋枯草芽孢杆菌菌苔已长得十分丰满， 可以用无菌水刮洗下来，制成菌悬液，使每毫升菌悬液中的菌体细胞数达到10亿个CFU以上，即达到109浓度，可以与杉木苗盆栽土壤均匀混合， 使每克土壤中的试验测定的枯草芽孢杆菌的细胞数达105CFU以上，即每克 土壤中达到IO万个CFU细胞以上；土壤装入盆内，每盆移栽杉木一年生 实生苗，按盆栽试验常规方法管理，接入土中2-16周后，海洋枯草芽孢杆 菌细胞数稳定在10SCFU/克，土水平的，说明得到的海洋枯草芽孢杆菌能在 杉木根际土壤中定殖，此菌株为有效菌株，可供应用试验或推广应用。从 土壤中分离出来的定殖的枯草芽孢杆菌对靶标菌的抑菌圈直径不低于实验 室测定的结果，抑菌圈直径^16.6mm。
所述得到的对病原菌的抑制作用的海洋孢杆菌为枯草芽孢杆菌，用传 统的细菌学鉴定或16SrDNA序列检测证明其为枯草芽孢杆菌(^ c/〃w /Sm6"7/力。
本发明具有如下的优点
1、 供筛选高效防治杉木根际土壤镰刀菌病原菌的样品目标明确，采用 红树林木榄幼年支持根(带有根表土壤)，以此类样品按本发明方法进行分离 筛选，可以获得具有高效防治杉木根际土壤中尖孢镰刀菌等病原真菌病害 的优良的海洋枯草芽孢杆菌。
2、 本发明的筛选方法简明易行，筛选得率，。以上选择红树林木榄 (SrMgw/era gymw ;r/2/za)幼年支持根(带有根表土壤)为分离筛选目的菌株的 样品，采用实验室无菌操作技术，将木榄幼年支持根(带有根表土壤)经85 °C 、 15分钟热处理后，以平皿稀释法分离目的菌株，菌株编号，与靶标菌株杉 木根际土壤致害真菌尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fw犯n'Mm o砂son/m w^'"yk^m)之间，进行平皿拮抗试验，筛选出有高拮抗活性的编号菌株， 经传统的细菌学鉴定或16S rDNA序列检测证明其为枯草芽孢杆菌(Sa"7/w
3. 筛选结果可信度高。所述得到的海洋枯草芽孢杆菌，进行杉木一年 生实生苗盆栽试验，在杉木根际土壤中能高密度定殖(接入土中12周后，海 洋枯草芽孢杆菌在根际的定殖密度达10SCFU/克.土以上)、高活性抑制病原 菌(从根际分离已定殖的达95%以上的菌株抑制病原菌活性不低于实验室测 定抑菌圈直径16.6mm)。并要求接种定殖的海洋枯草芽孢杆菌对杉木生长无 抑制作用，或具有促进杉木生长作用的菌株，对这些有拮抗靶标菌株的菌 株中选优保存，所得到的菌株即为有效菌株，从而完成了防治杉木人工林 根际土壤真菌病害的海洋枯草芽孢杆菌的筛选。
4. S編7/m 3728C应用效果好。所得到的海洋枯草芽孢杆菌 3728C，抑制杉木土壤中镰刀菌的活性强(抑菌圈直径16.66mm)，在杉木根 际土壤中定殖能力强(进行杉木一年生实生苗的盆栽试验，接种枯草芽孢杆 菌后12周，测定其在杉木幼苗根际土壤中的定殖密度l()SCFU/克.土，其为 筛选得到的高效菌株，从土壤中分离出来的定殖的枯草芽孢杆菌对靶标菌的抑菌圈直径不低于实验室测定的结果，抑菌圈直径16.66mm)对杉木生长 无抑制，并有促进生长的作用，并对环境友好，制成生态制剂，在杉木人 工林应用试验效果好，有利于应用推广。
本发明中所涉及的Sac/〃w w^7/s 3728C，已经于2007年4月23日保 藏在中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏号为 CCTCC No.M 207052。
图1为海洋细菌3728 (即为本发明中涉及的B"c/〃w 3728C)和
相关菌株的系统发育树。
具体实施例方式
本发明采用常规的平皿相互拮抗筛选模型和定向筛选相结合的方法， 其具体步骤①采集热带或亚热带地区沿海的红树林(7Wa"grave/om^)林 区的木榄(6wgw'eragvwwo/T&za)幼年支持根(有弹性，筛管纤维中空， 似海绵状，有充气容氧的效果。不取老年根，因老年根已逐渐木质化，变 硬。)带有土壤的样品；②经85°C、 15分钟处理后，以平皿稀释法分离所 需菌株；③以杉木人工林根际土壤中主要致害真菌尖孢镰刀菌萎蔫专化型 为靶标，通过平皿拮抗试验筛选出具有高效拮抗活性的木榄根表土壤样品 分离的海洋枯草芽孢杆菌；④通过盆栽试验筛选出具有高效拮抗活性且能 在杉木人工林土壤上栽种杉木苗的杉木根际土壤中定殖的，在原位土壤中 测定有明显抑制杉木根际土壤中致害真菌(尖孢镰刀菌萎蔫专化型)作用 的拮抗菌株，此菌株同时要对杉木生长无抑制作用，或略有促进生长作用， 进行挑选，经16SrDNA分析确定其为枯草芽孢杆菌，所得到的菌株，即为 高效菌株3728C。
用于防治杉木人工林根际土壤真菌病害的海洋枯草芽孢杆菌3728C已 在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC No，M207052。海洋 枯草芽孢杆菌3728C具有典型枯草芽孢杆菌特征，芽孢柱状、中生、不膨 大。菌体为杆状或短杆状，革兰氏染色阳性，菌落呈淡黄色、不透明、干 燥、表面粗糙，边缘不规则。水解淀粉，接触酶阳性，利用柠檬酸盐，能 在7%NaCl和45'C生长，分子生物学鉴定3728C菌株的16S rDNA序列与 枯草芽孢杆菌的序列相似性最高为99.5%。 3728C菌株能在杉木根际土壤 中高密度定殖(〉105CFU/^±)，对杉木人工林根际土壤真菌病害有明显的 防治效果(抑菌率>60%，防效达60%以上)；
通过本发明筛选出来的防治杉木人工林根际土壤致害真菌的木榄根际 的海洋枯草芽孢杆菌，以此菌株为主要组分之一研制成克服杉木连栽障碍 的防病减毒生态制剂，是一种高效、无毒、安全、无残留、能促进杉木人 工林绿色生态体系发展的微生物制剂，经在湖南会同杉木人工林地区的应用试验结果良好，有发展前途。
用本发明筛选方法得到的海洋枯草芽孢杆菌(^^7/w ^&///" 3728C， 具有高效防治杉木人工林根际土壤真菌病害的作用，抑制杉木土壤中尖孢 镰刀菌的活性强度大(抑菌圈直径达到16.6 mm)，并对杉木生长无抑制作用 且具有一定的促生长效果，对环境友好。
防治杉木人工根际真菌病害(镰刀菌)的海洋枯草芽孢杆菌的筛选方法
步骤如下
1、 样品采集在实验室准备无菌采样瓶子，已灭菌的剪刀，酒精棉球， 带至热带、亚热带红树林地区，选好木榄树，取木榄幼年支持根(带有根表 土壤)，用已灭菌的剪刀，剪取根尖前段幼年支持根约3cm长的根段，放入
到无菌采样瓶中，用冰瓶保藏带回至实验室，待分离筛选目的菌之用，所 采的木榄幼年支持根要有弹性感，其筛管纤维中空，似海绵状，幼年根的 粗细直径似人的小手指状，木榄幼年支持根表面要带有自然状态的土壤(即 沾在根上的海泥，不要经抖动能掉下的土壤)。
2、 菌株初筛将木榄幼年根(带有根表土壤)样品，用无菌剪刀把木榄 幼年支持根剪成2cm长小段，而后放于盛有海水的三角瓶中(用500mL三 角瓶，装海水100mL，12rC灭菌20分钟)，并将此三角瓶放在85。C水浴中， 热处理15-20分钟，杀灭非芽孢细菌，取出冷却，用稀释平皿分离方法涂平 皿，进行初筛，初筛平皿放在28'C保温箱中保温培养48小时，以形态观察 挑取单菌落，编号。初筛用的培养基采用牛肉膏蛋白胨麦芽汁琼脂培养基， 具体的说就以等重量的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，与等重量的糖度为波美7 度的麦芽汁琼脂培养基，分别装瓶，灭菌冷却，临用时分别加热融化，无 菌室内混合均匀倒平皿使用。木榄幼年根(带有根表土壤)样品悬液，用稀释 法涂此平皿，28'C保温培养，皿上长出来的单菌落，菌落形态十分典型， 海洋枯草芽孢杆菌在此平皿上，形成的单菌落形态(48小时)菌落有限生 长，周边不整齐，菌落直径2-4mm，浅土黄色，表面粗糙，干燥，有明显 而典型的褶皱，海洋枯草芽孢杆菌在此平皿上生长独特，与此平皿上生长 出来的其他单菌落形态特征有明显的不同，易于区分。
以上所述的两种培养基为
(1) 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基组成为牛肉膏3g，蛋白胨5g，水 lOOOmL，琼脂20g， pH7.0-7.2。 121°C，灭菌20分钟，备用；
(2) 麦芽汁琼脂培养基组成为糖度为波美7度的麦芽汁1000mL， 琼脂20g， pH7.0-7.2。 121°C，灭菌20分钟，备用；
麦芽汁的制备
(i)先制备麦芽粉取普通大麦(最好当年收获的)种子浸泡24小
时，置于水筐内，上面盖湿布，在2(TC左右保温，每天冲水l-2次(淋洗)， 至芽长为麦粒长度的1-1.5倍时，即可晒(烘)干磨成粉。
(ii)麦芽糖化将每1000g麦芽干粉加水3公斤，55。C糖化，加碘液检测，至不呈蓝色时为止(约6-7小时)，再煮沸30分钟，使蛋白质沉淀，调 pH至中性，以纱布过滤后，将滤液倒入量筒中，静置过夜，然后虹吸法吸 出上清液，用糖度计测定之，用水稀释至所需要的波美7度分装三角瓶， 121 。C灭菌20分钟，7令去卩备用。
3、 菌株复筛将上述初筛得到形态特征为枯草芽孢杆菌典型的菌落， 移接到盛有牛肉膏蛋白胨琼脂的斜面试管中，分别挑取典型的丰满健壮的
单菌落5-10个，移接斜面后编号，放置于28"C保温培养48小时，供复筛 用。复筛采用平皿拮抗试验方法，以杉木根际土壤病害真菌尖孢镰刀菌萎 蔫专化型(i^yaWww ax^/7WMw/s; .vas7'"yk;mw)为革巴子菌，在初筛已得歪lj 的初步认为是枯草芽孢杆菌(已编号的)，按常规方法在平皿上进行对峙的 拮抗试验，在28。C保温72小时，取出平皿，检测初筛菌株对尖孢镰刀菌萎 蔫专化型的抑菌圈大小，抑菌圈直径达到16mm以上的为合格，择优保存。 此复筛得到的菌株，可以进行杉木根际土壤的定殖试验。
4、 定殖试验已复筛选定的海洋枯草芽孢杆菌可以进行杉木一年生实 生苗盆栽土壤中的定殖试验。将海洋枯草芽孢杆菌试管斜面菌种，移接到 250mL的克氏瓶大斜面上(斜面培养基都用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基)扩 繁，然后在28'C保温培养48小时，此时海洋枯草芽孢杆菌3728C菌苔己 长得十分丰满，可以用无菌水刮洗下来，制成菌悬液，使每毫升菌悬液中 的菌体细胞数达到10亿个CFU以上，即达到109浓度，可以与杉木苗盆栽 土壤均匀混合，使每克土壤中的试验测定的枯草芽孢杆菌的细胞数达 105CFU以上(即每克土壤中达到10万个CFU细胞以上)。土壤装入盆内， 每盆移栽两棵杉木一年生实生苗，按盆栽试验常规方法管理，此时在盆栽 杉木苗根际土壤中接入的海洋枯草芽孢杆菌细胞数，先升后降，前三周杉 木根际土壤中枯草芽孢杆菌的数量增加很快，达到10、1(^CFU/克.土，三周 以后有所下降，逐步趋于稳定，海洋枯草芽孢杆菌细胞数稳定在105CFU/ 克-土水平，说明得到的海洋枯草芽孢杆菌能在杉木根际土壤中定殖，经测 量对杉木苗的生长无抑制作用，而却有一定促进生长的效果(株高、地径 都较不接菌的对照有所增加，试验与对照盆栽各三至五盆，盆栽试验时间 不短于三个月)。定殖试验成功的菌株，可以进一歩作经典的细菌学鉴定和 16SrDNA序列分析，最后试验结果综合数据确定筛选得到菌株的命名，一 般情况下98%的结果与初筛形态鉴定结果是一致的。至此实验筛选方法的 步骤都已经完成，此菌株为有效菌株，可供应用试验或推广应用。
用本发明筛选方法获得用于防治杉木人工林根际土壤真菌病害的海洋 细菌3728的有效菌株，经测定具有如下特征
1、海洋细菌3728的形态特征具有典型芽孢菌的特征，能产生芽孢， 芽孢形态为柱状、中生、不膨大，菌体细胞形态为杆状或短杆状，革兰氏 染色阳性，周生鞭毛，菌落呈淡黄色、干燥、不透明、表面粗糙、边缘不规则。
2、 海洋细菌3728的生理生化特征水解淀粉，明胶液化，接触酶阳 性，利用柠檬酸盐，能在3%、 5。％、 7XNaCl及45。C生长。能利用葡萄糖、 棉子糖、木糖、蔗糖、甘露醇、阿拉伯糖、果糖，不能利用半乳糖、山梨 糖、鼠李糖、菊糖、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐。
3、 分子生物学鉴定，海洋细菌3728的16S rDNA序列与枯草芽孢杆 菌(&"7/mSm^'"s)的序列相似性最高为99.5%,在系统发育树(进化树) 中也与枯草芽孢杆菌(Sfl"7/wSw^/fc)处于同一分枝上，见附图。
4、 在杉木根际土壤中能高密度定殖(〉105CFU/gD，对杉木人工林 根际土壤真菌病原菌尖孢镰刀菌萎蔫专化型及正青霉等有很强的抑制作 用，对杉木幼树立枯病有很好防效。
权利要求
1.一种海洋枯草芽孢杆菌，其特征在于所述微生物为Bacillus subtilis3728C，保藏号为CCTCC No.M 207052。
2. 权利要求1所述海洋枯草芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于1) 菌株初筛以红树林的木榄幼根根表土壤为分离菌种的样品，将带 有根表土壤的木榄幼年根样品剪成0.5-4cm长小段，而后放入盛有海水的三 角瓶中，三角瓶置于70-90。C水浴中，热处理10-20分钟，取出冷却，用稀 释平皿分离方法涂平皿，进行初筛，初筛平皿放在25-3(TC保温箱中保温培 养36-60小时，以形态观察挑取单菌落，编号；2) 菌株复筛将上述初筛得到形态特征为枯草芽孢杆菌典型的菌落， 移接到盛有牛肉膏蛋白胨琼脂的斜面试管中，分别挑取单菌落5-10个，放 置于25-3(TC保温培养36-60小时，供复筛用；复筛采用平皿拮抗试验方法，以杉木根际土壤病害真菌为靶子菌，按常 规方法在平皿上进行对峙的拮抗试验，在25-3(TC保温60-84小时，取出平 皿，检测初筛菌株对靶子菌的抑菌圈大小，抑菌圈直径达到16mm或16mm 以上的为合格，择优保存。
3. 按照权利要求2所述的筛选方法，其特征在于所述其木榄幼根为 幼年支持根。
4.按照权利要求2所述的筛选方法，其特征在于所述初筛用的培养 基采用牛肉膏蛋白胨麦芽汁琼脂培养基，具体的说就以等重量的牛肉膏蛋 白胨琼脂培养基，与等重量的糖度为波美7度的麦芽汁琼脂培养基，分别 装瓶，灭菌冷却，临用时分别加热融化，无菌室内混合均匀倒平皿使用。
5. 按照权利要求2所述的筛选方法，其特征在于已复筛选定的海洋 枯草芽孢杆菌可以进行杉木一年生实生苗盆栽土壤中的定殖试验；定殖试验将海洋枯草芽孢杆菌试管斜面菌种，移接扩繁，然后在 25-30'C保温培养36-60小时，此时海洋枯草芽孢杆菌菌苔已长得十分丰满， 可以用无菌水刮洗下来，制成菌悬液，使每毫升菌悬液中的菌体细胞数达 到10亿个CFU以上，即达到109浓度，可以与杉木苗盆栽土壤均匀混合， 使每克土壤中的试验测定的枯草芽孢杆菌的细胞数达105CFU以上，即每克 土壤中达到IO万个CFU细胞以上；土壤装入盆内，每盆移栽杉木一年生 实生苗，按盆栽试验常规方法管理，接入土中12周后，海洋枯草芽孢杆菌 细胞数稳定在10SCFU/克.土水平的，说明得到的海洋枯草芽孢杆菌能在杉 木根际土壤中定殖，此菌株为有效菌株，可供应用试验或推广应用。
6. 按照权利要求2所述的筛选方法，其特征在于所述杉木根际土壤 病害真菌为尖孢镰刀菌萎蔫专化型。
全文摘要
本发明涉及海洋微生物应用技术及杉木人工林根际土壤真菌病害防治，具体地说是一种海洋枯草芽孢杆菌及其筛选方法，所述微生物为Bacillus subtilis 3728C，保藏号为CCTCC No.M 207052，所采用的方法为常规的平皿相互拮抗筛选模型和定向筛选相结合的方法。通过本发明筛选出来的防治杉木人工林根际土壤致害真菌的木榄根际的海洋枯草芽孢杆菌，以此菌株为主要组分之一研制成克服杉木连栽障碍的防病减毒生态制剂，是一种高效、无毒、安全、无残留、能促进杉木人工林绿色生态体系发展的微生物制剂，经在湖南会同杉木人工林地区的应用试验结果良好，有发展前途。
文档编号C12R1/125GK101298597SQ200710011179
公开日2008年11月5日 申请日期2007年4月30日 优先权日2007年4月30日
发明者丽 刘, 徐洪利, 汪思龙, 王书锦, 胡江春, 薛德林, 马成新 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所