专利名称：一种细菌质粒dna提取的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学，具体地说是一种细菌质粒DNA的提取方法。质粒是存在于细菌染色体外的能独立复制并稳定遗传的环状双链DNA 分子，质粒腿A是基因工程的常用载体，可以携带外源基因进入细菌、动 物细胞或植物体内进行扩增与表达。质粒DNA提取的效率及质量对后续实 验(酶切、PCR扩增等)的成功与否有着直接的关系，因此快速高效地从细 菌细胞中提取和纯化质粒具有重要的意义。目前从细菌中提取质粒DNA常采用的方法有煮沸法、SDS法、碱裂解法等，这些方法通常都是针对带有人工构建质粒的大肠杆菌进行提取，耗时 长、质量低，而且提取过程中使用酚、氯仿等有毒物质，既污染环境又危 害人体健康。对于很多有机污染物降解细菌来说，污染物降解的特性都是 由细菌的内生质粒调控的或者与质粒有关，认清降解细菌质粒以及位于质 粒上的基因与有机污染物降解之间的关系，将有助于更深刻地了解微生物 对有机污染物降解的内在机制和过程，所以寻找一种安全高效、简便快速 并能应用于多种有机污染物降解菌的质粒提取方法是进行此项研究的基 础。发明内容本发明的目的在于提供一种安全、高效、适合多种细菌质粒DNA提取 的方法。有机污染物降解菌的质粒DNA提取的方法。 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为-. 提取的方法1) 细菌的培养将挑取的细菌单菌落在细菌常用液体培养基中，25-30x:振摇过夜培养；2) 菌体的收集、裂解当为革兰氏染色阴性菌时，取1.5-2.0mL培养 16-24小时的菌液，并在10000-12000rpm下离心30-60秒，收集菌体；用 l-l. 5mL S丁E溶液洗涤两次，10000rpra离心30秒；而后在细菌沉淀中加入 100-30GjuL溶液I ,再加入2QQ-6QQjuL溶液I]，冰浴3-5分钟，得裂解菌 液；当为革兰氏染色阳性菌分别培养时，取3. 0-4.0mL培养10-16小时的 菌液，并在8000-10000r，下离心60-90秒，收集菌体；用2. 0-3. OmL STE 溶液洗涤两次，lOOOOrpm离心30秒；而后在细菌沉淀中加入100-200 y L 溶液1和50-lOOjaL溶菌酶，37"C水洛30-60分钟,然后再加入200-600ML溶液II，冰浴3-5分钟，得裂解菌液；3) 质粒DNA的复性、与染色体DNA分离在步骤2)中得到的裂解菌 液内加入150-400 mL溶液m，冰浴15-20分钟，4 。C下以12000rpm离心10 分钟，取上清；并在上清液中加与其等体积的异丙醇，室温放置5分钟，4 。C下再以12000rpm离心5分钟，取其沉淀待用；4) 质粒dna的沉淀将步骤3)中的沉淀用100-400 m l无菌重蒸水溶 解，并加入溶解沉淀的无菌水的l/2体积的7. 5mol -L—屮lUc和5mo1 'l—'LiCl, 冰洛3-5分钟，4。C下以12000rpm离心5分钟，取上清；并在上清液中加 与其等体积的异丙醇，室温放置40分钟，沉淀即为质粒DNA;其中溶液I为50mmol/L葡萄糖，25画1/L Tris Cl ， pH8. 0和 1O隨ol/L EDTA, pH8. 0;溶液ii为0. 2mol/L NaOH和1%SDS;溶液iii为 溶液中含钾的浓度为3-5mol/L的KAc,和5mol/L乙酸根，pH4. 8; NH,Ac 和LiCl之间的摩尔比例是1: 1。所述细菌常用液体培养基的成分为葡萄糖1.0g,酵母奢l. 0g， MgS04 7H20 0. 2g, Na2C03 0. lg, CaCh . 2H20 0. Olg, MnS04 . H20 0. 02g, FeS04 - 7H20 0. 005g, NH萬1. Og， KH2P04 0. 4g, Na2HP04 。
6g,加蒸馏水 至1L, pH7. 2-7. 5。上述得到的质粒DNA可用乙醇洗涤，空气中干燥后加50-lOOjaL TE溶 解，-2(TC保存。所述质粒DNA的洗涤用乙醇洗涤2-4次，其中乙醇的浓度为60-80%。 STE溶液的成分为10mmol/L Tris "Cl,pH8. 0， 10mmol/L NaCl和lmmol/L EDTA, pH8. 0; TE缓冲液为10mmol/L Tris HC1, pH8. 0和1mmol/L EDTA, pH8. 0;所述溶菌酶(Lysozyme Egg White,浓度为50mg/mL) 本发明所具有的优点1. 操作简便、安全。本发明所用仪器简单，易操作。用NH,Ac代替酚、 氯仿去除蛋白，可以有效降低对人体的危害，并减少对环境的污染。2. 质量高。选择适宜的条件进行细菌培养以及合适体积的菌液进行质 粒DNA提取，可最大限度的提高提取的效率；同时利用LiCl进行处理可以 大量沉淀RNA,并减少RNaseA的消化时间；用等体积异丙醇代替2倍体积 的乙醇来沉淀质粒dna,可以获得更好的沉淀效果，最终获得的质粒dna的 a，/a则均达到了 1.80，完全可以满足常规分子生物学实验的要求。3. 应用范围广。在带有质粒的有机污染物降解细菌中，既有革兰氏染 色阴性细菌也有革兰氏染色阳性细菌，经实验证明本发明不仅适用于革兰 氏染色阴性细菌质粒DNA的提取，同样适用于革兰氏染色阳性细菌，因此 具有广泛的适用性。
图1为DNA的水平琼脂糖凝胶电泳谱图；其中的1泳道是lkb DNA marker, 5泳道是入隨/跑c/111 marker,中间三个泳道分别2为戈登氏菌ZCG2， 3为假单胞菌B61, 4为人苍白杆菌ZHL4。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。 实施例1将在斜面培养的戈登氏菌ZCG2，挑取其单菌落在细菌常用液体培养基 中25。C振荡培养12小时后，取3. OmL菌液，9000rpni离心70秒,用2. OmL STE溶液洗涤两次，10000rpm离心30秒；先加入150 ja L溶液I和50 p L 溶菌酶(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，37。C水浴40分钟， 然后再加入400 mL溶液I1,冰浴5分钟；加入300 m L溶液iii,冰浴20分 钟，4。C, 12000rpm离心IO分钟；取上清，加等体积异丙醇，室温放置5 分钟，4'C， 12000rpm离心5分钟；用300 m L无菌重蒸水溶解沉淀，加入 150yL的7. 5mol . L—'NH4Ac和5mol . L—'LiCl,冰洛5分钟，4*C， 12000rpm 离心5分钟；取上清，并在上清液中加与其等体积的异丙醇，室温放置40 分钟，沉淀即为质粒DNA;将上述沉淀用70%乙醇洗涤两次，空气中干燥后 加70mL TE溶解。其中细菌常用液体培养基的成分为葡萄糖l. Og,酵母膏1.0g, MgS04 7H20 0. 2g, Na2C03 0. lg， CaCl2 2H20 0. Olg, MnS04 . H20 0. 02g, FeS04 7H20 0. 005g, NH萬1. Og, KH2P04 0. 4g, Na風0. 6g，加蒸馏水 至1L, pH7.2, 12rC灭菌30tnin;溶液I为50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris ■ CI, pH8. 0和lOmmol/L EDTA, pH8. 0;溶液II为0, 2mol/L NaOH和 1%SDS;溶液III为溶液中含钾的浓度为5mol/L的KAc,和5mol/L乙酸根， pH4. 8; NIUc和LiCl之间的摩尔比例是1:1。 STE溶液的成分为1O腿ol/L Tris-Cl， pH8. 0, 10,1/L NaCl和lmmol/L EDTA， pH8. 0; TE缓冲液为 lOmmol/L Tris HC1， p朋.0和lmmol/L EDTA, pH8. 0;其质粒DNA的提取 结果(参见图1第2泳道)，提取DNA的含量为28. 9pg/mL， A261t/A28 =l. 80。实施例2将在斜面培养的假单胞菌B61,挑取其单菌落在细菌常用液体培养基中 28。C振荡培养18小时后，取2. OmL菌液，lOOOOrpm离心45秒，用1. 5mL STE 溶液洗涤两次，lOOOOrpm离心30秒；先加入135 ja L溶液I ,然后再加入 270laL溶液I1 ,冰洛4分钟；加入200iaL溶液in，冰浴20分钟，4。C，12000rpm 离心10分钟；取上清，加等体积异丙醇，室温放置5分钟，4°C, 12000rpm 离心5分钟；用200 nL无菌重蒸水溶解沉淀，加入100 y L的 7. 5mol . L—'歸c和5rao1 . L 'LiCl,冰浴5分钟，4°C, 12000rpm离心5分 钟；取上清，加入等体积的异丙醇，室温放置40分钟，沉淀即为质粒DNA; 将上述沉淀用70%乙醇洗涤两次，空气中干燥后加60pLTE溶解。其中细菌常用液体培养基的成分为葡萄糖l.Og，酵母膏l.Og, MgS04 7H:0 0. 2g, Na.'CO 0. lg， CaCl2 2H20 0. Olg, MnSO, H.O 0. 02g, FeS04 . 7H;0 0. Q05g，歸O' l.Og, KHPOj 0. 4g， Na2HP04 0. 6g,加蒸f水至1L. pH7. 4， 12rC灭菌30min;溶液I为50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris'Cl， pH8. 0和10mmol/L EDTA, pH8. 0;溶液II为0. 2mol/L NaOH和 1%SDS;溶液III为溶液中含钾的浓度为4mol/L的KAc,和5mol/L乙酸根， pH4. 8; NH4Ac和LiCl之间的摩尔比例是1: 1。 STE溶液的成分为lOmmol/L Tris . CI, pH8. 0, 10mmol/L NaCi和1睡1/L EDTA, pH8. 0; 丁E缓冲液为 10mmol/L Tris HCl， pH8. 0和l鹏ol/L EDTA， pH8. 0;其质粒DNA的提取 结果(参见图1第3泳道)，提取DNA的含量为42. 3 ja g/mL, A2fc。/Aw)=l. 85。 实施例3将在斜面培养的人苍白杆菌ZHL4,挑取其单菌落在细菌常用液体培养 基中3(TC振荡培养20小时后，取1. 5mL菌液，11000rpm离心35秒，用1. OmL STE溶液洗涤两次，10000rpm离心30秒；先加入100 y L溶液I ，然后再 加入200juL溶液II,冰洛3分钟；加入150 n L溶液III,冰洛15分钟，4 °C， 12000rpm离心IO分钟；取上清，加等体积异丙醇，室温放置5分钟， 4°C， 12000rpm离心5分钟；用200 m L无菌重蒸水溶解沉淀，加入lOOyL 1的7. 5mol . L—'WUc和5mol L—'LiCl,冰洛5分钟，4°C, 12000rpm离心 5分钟；取上清，加入等体积的异丙醇，室温放置40分钟，沉淀即为质粒 DNA;将上述沉淀用70%乙醇洗涤两次，空气中干燥后加50 )a L TE溶解。其中细菌常用液体培养基的成分为葡萄糖l.Og,酵母膏l.Og, MgSO, ■ 7H20 0. 2g, Na2CO; 0. lg， CaCh 2H20 0. Olg, MnS04 H20 0. 02g, FeSO广7H20 0. 005g， NH4N03 l.Og, KH2P04 0. 4g, Na2HP04 0. 6g,加蒸馏水 至1L， pH7. 3, 12rC灭菌30min;溶液I为50,1/L葡萄糖，25醒ol/L Tris . CI, pH8. 0和10mmol/L EDTA, pH8. 0;溶液II为0. 2mol/L NaOH和 1°/。SDS;溶液III为溶液中含钾的浓度为3mol/L的KAc,和5mol/L乙酸根， pH4. 8; NH4Ac和LiCl之间的摩尔比例是1: 1。 STE溶液的成分为lOmmol/L Tris . CI, pH8. 0， 10mmol/L NaCl和l隱ol/L EDTA, pH8. 0; TE缓冲液为 lOmmol/L Tris HCl， pH8. 0和1嶋1/L EDTA, pH8. 0;其质粒DM的提取 结果(参见图1第4泳道)，提取DNA的含量为35. 3jug/niL, A26。/A28。=l. 82。
权利要求
1. 一种细菌质粒DNA提取的方法，其特征在于1)细菌的培养将挑取的细菌单菌落在细菌常用液体培养基中，25-30℃振摇过夜培养；2)菌体的收集、裂解当细菌为革兰氏染色阴性菌时，取1.5-2.0mL培养16-24小时的菌液，并在10000-12000rpm下离心30-60秒，收集菌体；用1-1.5mL STE溶液洗涤两次，10000rpm离心30秒；而后在细菌沉淀中加入100-300μL溶液I，再加入200-600μL溶液II，冰浴3-5分钟，得裂解菌液；当为革兰氏染色阳性菌分别培养时，取3.0-4.0mL培养10-16小时的菌液，并在8000-10000rpm下离心60-90秒，收集菌体；用2.0-3.0mL STE溶液洗涤两次，10000rpm离心30秒；而后在细菌沉淀中加入100-200μL溶液I和50-100μL溶菌酶，37℃水浴30-60分钟，然后再加入200-600μL溶液II，冰浴3-5分钟，得裂解菌液；3)质粒DNA的复性、与染色体DNA分离在步骤2)中得到的裂解菌液内加入150-400μL溶液III，冰浴15-20分钟，4℃下以12000rpm离心10分钟，取上清；并在上清液中加与其等体积的异丙醇，室温放置5分钟，4℃下再以12000rpm离心5分钟，取其沉淀待用；4)质粒DNA的沉淀将步骤3)中的沉淀用100-400μL无菌重蒸水溶解，并加入溶解沉淀的无菌水的1/2体积的7.5mol·L-1NH4Ac和5mol·L-1LiCl，冰浴3-5分钟，4℃下以12000rpm离心5分钟，取上清；并在上清液中加与其等体积的异丙醇，室温放置40分钟，沉淀即为质粒DNA；其中溶液I为50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·Cl，pH8.0和10mmol/L EDTA，pH8.0；溶液II为0.2mol/L NaOH和1％SDS；溶液III为溶液中含钾的浓度为3-5mol/L的KAc，和5mol/L乙酸根，pH4.8；NH4Ac和LiCl之间的摩尔比例是1∶1。
2. 按权利要求1所述的细菌质粒DNA提取的方法，其特征在于所述 细菌常用液体培养基的成分为葡萄糖1. 0g，酵母膏1. Og，MgSO, '7H,0 0. 2g, Na2C03 0. lg， CaCl2 2H20 0. 01g, MnS04 ' H20 0. 02g, FeS04 7H20 0. 005g, NH4N0, l.Og, KH2P04 0. 4g, Na2HP04 0. 6g，加蒸馏水至1L, pH7. 2-7. 5。
3. 按权利要求1所述的细菌质粒DNA提取的方法，其特征在于上述 得到的质粒DNA可用乙醇洗涤，空气中干燥后加50-IOOjuLTE溶解，-20°C 保存。
4. 按权利要求3所述的细菌质粒DNA提取的方法，其特征在于所述 质粒DNA的洗涤用乙醇洗涤2-4次，其中乙醇的浓度为60-80%。5.按权利要求1所述的细菌质粒DNA提取的方法，其特征在于STE 溶液的成分为10國l/LTris .Cl， pH8. 0, lOmmol/L NaCl和1mmol/L ED丁A， pH8. 0; TE缓冲液为0隱ol/LTris . HC1， pH8. 0和lmmol/L EDTA, pH8. 0。
全文摘要
本发明涉及分子生物学，具体地说是一种细菌质粒DNA的提取方法。具体为将微生物菌体在液体培养基中，25-30℃振摇过夜培养；将培养过夜的菌液中加入缓冲溶液，离心收集和洗涤得裂解菌体；质粒DNA的分离纯化，所得到的质粒DNA可直接用于酶切、PCR等多种分子生物学实验。本发明操作简便、安全、质量高、同时适用于革兰氏染色阴性细菌、革兰氏染色阳性细菌质粒DNA的提取，因此具有广泛的适用性。
文档编号C12N15/31GK101235379SQ20071001027
公开日2008年8月6日 申请日期2007年2月2日 优先权日2007年2月2日
发明者宛 刘, 张利红, 李培军, 乐 郑 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所