专利名称：可稳定自发光的细菌质粒及其制备方法
技术领域：
本发明一种可用于标定细菌的发光质粒及其制备方法，尤指技术上提供一种在细菌世代繁殖中可稳定且大量存在于细菌中的革兰阴性细菌的自发发光载体及其制备方法。
背景技术：
一般欲得知细菌在动物体中的分布和行为，大多是在实验动物牺牲后，才能分析动物器官标本，而不能直接观察。于是遂有人研发利用发光基因在细菌中表现的方法，来观察细菌在动物体中的分布和行为，而利用发光基因在细菌中表现的方法，一般来讲有三种主要途径1.在质粒中直接表现发光基因，但受限于质粒本身的不稳定性，以致大部份的细菌容易遗失所植入的质粒，无法稳定且大量的存在细菌中，而在细菌的繁殖中，质粒难以稳定的存在于各个子细菌，往往只能维持少数几代而已，因此整体细菌表现的强度很快即转弱。若使用抗生素筛选，强迫细菌保有该质粒，否则无法存活，但此法却无法运用于活体动物中，因为如果给动物喂食抗生素，则由抗生素对测试动物所引起的变因将可能复杂化实验结果。2.将发光基因藉由转位子(transposon)逢机地插入细菌的染色体中，但不能确定被插入的DNA处是否为重要的基因所在；又因转位发生机率不高，更增填筛选上的困难度。况且此法只针对该种已转位的菌株，若应用于其它种菌株则其转位子的位置将会不同， 如此将更增填变因，以致不能作多种菌株的观察和比较。3.以双重组交换将发光基因插入细菌的染色体中，虽然可以准确地插入特定基因中，但其发生机率不高，又因发光基因(IuxAB⑶E-kan)本身很长(至少71Λ)，更降低重组交换的机率，难以完成大分子DNA在细菌中的克隆及传递。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种可稳定自发光的细菌质粒及其制备方法，欲解决的技术问题点是一般欲得知细菌在动物体中的分布和行为，大多需牺牲动物才能分析动物器官标本，而一般利用发光基因在细菌中表现的方法，有以下几点缺失1.若在质粒中直接表现发光基因，受限于质粒本身的不稳定性，大部份的细菌容易遗失所植入的质粒，无法稳定且大量的存在细菌中；2.若发光基因藉由转位子(transposon)逢机地插入细菌的染色体，不能确定被插入DNA处是否为重要的基因所在，且转位发生机率不高；另外也只受限于该转位的测试菌株可被使用而已，却不能广泛地应用于其它多种菌株上；3.若以双重组交换将发光基因插入细菌的染色体中，其发生机率不高，且发光基因本身很长不容易完成在细菌中的克隆及传递。解决问题的技术特点一种可稳定自发光的细菌质粒，其包含luxABCDE自发发光基因、可启动luxABCDE自发发光基因的启动子、ColEl复制子、对氨比西林与卡那霉素的抗性基因、pir、parG、parF、stbD、及StbE稳定质粒的相关基因，以及pilXl至pilXll与taxA、taXB、taXC接合生殖作用相关的基因；本发明的质粒制备步骤如下a.获得一可启动发光基因(luxABCDE)的质粒；b.将含ColEl复制子及抗性基因的质粒接入质粒pSE34中；c.结合步骤a.与b.质粒制得本发明的质粒。对照先前技术的功效本发明的革兰阴性细菌专用的稳定自发发光载体有以下几点功效第一，可直接使用此发光质粒于细菌中，有利于观察其在动物体内的分布变化。因而无需牺牲动物，即可直接分析研究细菌在动物体内的分布和行为。第二，本发明的发光质粒可稳定存在于细菌中，并可大量复制质粒，如此有助于细菌的发光强度，能持续而且能高效地表现，因而能克服质粒在细菌的繁殖中，难以稳定且大量的存在细菌中的缺点。第三，本发明可利用质粒的接合生殖作用，既可帮助克隆(cloning)又可便于该质粒在细菌与细菌的间传递本发明的发光质粒。如此即可简单的选出所需要的高效能且持续发光的细菌，而可减少许多在克隆(cloning)时筛选工作的负担，尤其本发明因含有许多重要功能的基因以致质粒DNA过大，所以当在一般DNA克隆(cloning)的剪接上，成功机率相对上很低。因此，利用接合生殖作用可降低克隆上的困难度。
图1 本发明其一实施例的步骤流程图。图2A 本发明其一实施例的质粒pXen-5架构图。图2B 本发明其一实施例构筑质粒p3ZLux4示意图。图3A 本发明其一实施例的质粒PSE34架构图。图;3B 本发明其一实施例构筑质粒pSE-Luxl示意图。图4 为本发明其一实施例的质粒pSE-Luxl架构图。
具体实施例方式本发明的可稳定自发光的细菌质粒pSE_Luxl(SEQ ID NO 1)，含有至少一 IuxAB⑶E自发发光基因(SEQ ID NO 21)、至少一可启动IuxAB⑶E自发发光基因的启动子、 至少一可大量复制的ColEl复制子、至少一抗性基因、至少一pir基因(SEQ ID NO 3)、至少一 parG 基因(SEQ ID NO 4)、至少一 parF 基因(SEQ ID N05)、至少一 stbD 基因(SEQ ID NO 6)与至少一 StbE基因(SEQ ID NO 7)，以及包含至少一 pilXl基因(SEQ ID NO 8)、至少一 pilX2 基因(SEQ ID NO 9)、至少一 pilX4 基因(SEQ ID NO 10)、至少一 pilX5 基因 (SEQ ID NO 11)、至少一 pi 1X6 基因(SEQ ID NO 12)、至少一 pi 1X7 基因(SEQ ID NO 13)、 至少一pilX8基因(SEQID NO 14)、至少一pilX9基因(SEQ ID NO 15)、至少一pilXlO基因 (SEQ ID NO 16)、至少一 pi 1X11 基因(SEQ ID NO 17)、至少一 taxA 基因(SEQ ID NO 18)、 至少一 taxB 基因(SEQ ID NO 19)与至少一 taxC 基因(SEQ ID NO 20)。其中，该可启动IuxAB⑶E自发发光基因的启动子为Plaez启动子(SEQ ID N022)。其中，该抗性基因可为对氨比西林(ampicillin，Amp)的抗性基因或对卡那霉素 (kanamycin,Kan)的抗性基因，或含有对氨比西林(ampicillin，Amp)的抗性基因加上对卡那霉素(kanamycin，Kan)的抗性基因两种抗性基因。
其中，该pir、parG、parF、stbD与stbE为稳定质粒的相关基因；该pilXl、pilX2、 pilX4、pilX5、pilX6、pilX7、pilX8、pilX9、pilXlO、pilXll、taxA、taxB 与 taxC 基因为接合生殖相关的基因，有助于质粒的接合生殖作用，帮助质粒的克隆以及在细菌与其他菌种细菌间的传递(如将质粒从沙门氏菌传递至大肠杆菌)。其中，IuxAB⑶E自发发光基因既含有发光酶IuxAB基因又有脂肪酸还原酶Iux⑶E 基因，即可合成脂肪醛，直接供发光酶于发光时所需的受质，因此无需额外受质(如脂肪醛类)的填加。本发明的质粒pSE-Luxl可表现自发发光基因蛋白质，又可非常稳定的存在细菌中持续发光，在细菌世代繁殖中可稳定且大量存在于细菌中，更有利于活体动物内直接观察。本发明的可稳定自发光的细菌质粒制备步骤如下(a)、将缺乏启动子的发光基因(luxABCDE)接入一含启动子的质粒中，使发光基因(luxABCDE)可利用启动子来启动转录。(b)、将含至少一 ColEl复制子及至少一抗性基因的革兰阴性细菌质粒接入质粒 pSE34 中。(C)、将步骤(a)所构筑的质粒接入步骤(b)所构筑的质粒中以制得该可稳定自发光的细菌质粒。实施例本发明实际在制备可稳定自发光的细菌质粒的详细制备步骤如下(a)、构筑质粒p3ZLux4(10)将缺乏启动子的发光基因(luxABCDE)从质粒pXen_5 中以I3StI限制酶切出，并接入含&。2启动子的质粒pGEM3-Zf+中，使发光基因(IuxAB⑶E) 可利用质粒pGEM3-Zf+中的Pla。z启动子来启动转录。 其中，质粒pXen-5为Xenogen公司的商品化的质粒(Alameda，CA, USA)，有18，357 个碱基对(bp)。含对卡那霉素(kanamyCin，Kan)的抗性基因及IuxAB⑶E的自发发光基因。 但缺启动子来启动luxABCED，以致不能启动发光基因。其中luxABCDE既含有发光酶IuxAB 基因又含有脂肪酸还原酶IuxCDE基因，可将脂肪酸还原成脂肪醛，直接提供发光酶于发光时所需的受质，因此无需额外填加其它如脂肪醛类的受质。其中，质粒pGEM3_Zf+为！Iomega公司的商品化的质粒(Madison，WI, USA)，有 3，199bp。含可大量复制的ColEl复制子、多克隆位点及对氨比西林(ampicillin，Amp)的抗性基因，但属窄寄主范围的ColEl型复制子，且为不稳定的质粒，容易于数代繁殖后遗漏掉质粒于细菌中。其中，步骤(a)所构筑的质粒P3ZLux4有ll，766bp，为可大量复制的发光质粒，但本身不稳定。(b)、构筑质粒 pBS_SE34(ll)将质粒 pBlueScript II KS (+/")以 XbaI 限制酶切出并接入质粒PSE34中而得的质粒。其中，质粒pBlueScript II KS(+/")为Mratagene公司的商品化的载体(Lajolla，CA, USA)。含可大量复制的ColEl复制子、多克隆位点及对氨比西林 (ampicillin, Amp)的抗性基因。其中，质粒pSE34(SEQ ID NO 2)有32，9501Λ，来自肠内菌的一种稳定的原生型肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica serotype Enteritidis)，其噬菌体分型为 PT34。肠炎沙门氏菌是世界上(包括台湾)造成动物及人的沙门氏菌相关病症的主要病源，其中噬菌体分型PT34是台湾第二普遍的肠炎沙门氏菌。此噬菌体分型PT34经本申请人研究团队研究发现是来自最普遍的噬菌体分型PT4的肠炎沙门氏菌，噬菌体分型PT4的肠炎沙门氏菌因为获得质粒PSE34后改变而成为噬菌体分型PT34。本申请人研究团队也发现此质粒拥有 pir、parG、parF、stbD、及stbE基因，有助于细胞增殖分裂时，质粒可稳定地分配于子细菌中。以及含 pilXl、pilX2、pilX4、pilX5、pilX6、pilX7、pilX8、pilX9、pilX10、pilXll、taxA、 taxB及taxC基因可帮助质粒在细菌与其他菌种细菌间以接合生殖作用(conjugation)来散布。其中，步骤(b)所构筑的质粒PBS-SE34有34. 61Λ，具有质粒pSE34的优点，含有稳定质粒的相关基因和接合生殖作用相关的基因特性，以及具有质粒PBlueScript II KS的优点，含可大量复制的ColEl复制子、多克隆位点及对氨比西林(ampicillin，Amp)的抗性基因。(c)、构筑质粒pSE-Luxl (12)利用MlI限制酶及BioI限制酶分别切割第(a)步骤所构筑的质粒p3ZLux4及第(b)步骤所构筑的质粒pBS-SE34，再将质粒p3ZLux4及质粒 PBS-SE34接合成一个质粒pSE-Luxl，该质粒pSE_Luxl有46. 3kb,为一革兰阴性细菌专用的稳定自发发光载体。功能测试请参阅下表一，为本发明的质粒pSE-Luxl稳定性测试，我们将质粒p3Zlux4植入克隆株大肠杆菌(E. coli)中当作对照组，将质粒pSE-Luxl植入沙门氏菌(S. Typhimurium LBNP4417)中当作实验组，分别在不含抗生素筛选的Luria-Bertani(LB)液体培养基中培养79代后，此菌液于不同稀释倍数下分别涂盘于不含抗生素及含抗生素(如ampicillin 及kanamycin)的LB洋菜胶(含1.5%的洋菜胶)培养皿中生长，隔夜后计算总细菌数及含质粒的细菌数(colony formationunit, CFU)，可以清楚的发现本创作的质粒pSE-Luxl可以在79代后，仍有75% (1550/2030)的细菌仍具有发光质粒，细菌经四天(约79代)的继代培养后，发现本创作的发光质粒pSE-Luxl存在细菌内的稳定效率优于质粒p3ZLux4约十万倍，在培养皿上观察菌落发光情形，质粒p3ZLux4所产生的发光效果约8小时，而质粒 PSE-Luxl发光至少2天以上。此结果显示本发明所构筑的质粒pSE-Luxl既可表现自发发光基因蛋白质，又可非常稳定的存在细菌中持续发光。表一、质粒pSE-Luxl稳定性测试CFU/ ml植入质粒p3Zlux4的大肠杆菌植入质粒pSE-Luxl的沙门氏菌LB培养基含Amp与Kan的 LB培养液LB培养基含—ρ与Kan的LB培养基IO2菌数过多无法计算43菌数过多无法计算菌数过多无法计算IO3菌数过多无法计算4菌数过多无法计算菌数过多无法计算IO4菌数过多无法计算0菌数过多无法计算菌数过多无法计算IO5菌数过多无法计算0菌数过多无法计算菌数过多无法计算IO648802’ 0301,550
权利要求
1.一种可稳定自发光的细菌质粒，其包含至少一 IuxAB⑶E自发发光基因、至少一可启动IuxAB⑶E自发发光基因的启动子、至少一 ColEl复制子、至少一抗性基因、至少一 pir基因、至少一 ParG基因、至少一 parF基因、至少一 StbD基因与至少一 StbE基因，以及包含至少一 pilXl基因、至少一 pilX2基因、至少一 pilX4基因、至少一 pil)(5基因、至少一 pil)(6 基因、至少一 pilX7基因、至少一 pilX8基因、至少一 pilX9基因、至少一 pilXlO基因、至少一 pilXll基因、至少一 taxA基因、至少一 taxB基因与至少一 taxC基因。
2.如权利要求1所述的可稳定自发光的细菌质粒，其特征在于，该可启动luxABCDE自发发光基因的启动子为Pla。z启动子。
3.如权利要求1所述的可稳定自发光的细菌质粒，其特征在于，该抗性基因包含对氨比西林(ampicillin)的抗性基因。
4.如权利要求1所述的可稳定自发光的细菌质粒，其特征在于，该抗性基因包含对卡那霉素(kanamycin)的抗性基因。
5.如权利要求1所述的可稳定自发光的细菌质粒，其特征在于，该抗性基因包含对氨比西林(ampicillin)的抗性基因与对卡那霉素(kanamycin)的抗性基因。
6.如权利要求1所述的可稳定自发光的细菌质粒，其特征在于，该可稳定自发光的细菌质粒为如SEQ ID NO :1所述的核甘酸序列。
7.一种制备可稳定自发光的细菌质粒的方法，包含下列步骤(a)、将缺乏启动子的发光基因(luxABCDE)接入一含启动子的质粒中，使发光基因 (luxABCDE)可利用启动子来启动转录。(b)、将含至少一ColEl复制子及至少一抗性基因的革兰阴性细菌质粒接入质粒PSE34中。(c)、将步骤(a)所构筑的质粒接入步骤(b)所构筑的质粒中以制得该革兰阴性细菌专用的稳定自发发光载体。
8.如权利要求7所述的制备可稳定自发光的细菌质粒的方法，其特征在于，步骤(a)所述的启动子可为Pla。z启动子。
9.如权利要求8所述的制备可稳定自发光的细菌质粒的方法，其特征在于，步骤(a)所述的含启动子的质粒可为质粒pGEM3-Zf+。
10.如权利要求9所述的制备可稳定自发光的细菌质粒的方法，其特征在于，步骤(a) 所述的缺乏启动子的发光基因(IuxAB⑶E)来自质粒pXen-5。
11.如权利要求7所述的制备可稳定自发光的细菌质粒的方法，其特征在于，步骤(b) 所述的至少一 ColEl复制子及至少一抗性基因的革兰阴性细菌质粒可为质粒pBlu必cript II KS(+/-)。
12.—种革兰阴性细菌的质粒，于细菌细胞分裂时该质粒可稳定地分配于子细菌中，且使细菌与其他菌种细菌间可以利用接合生殖作用来散布该质粒，该质粒系包含至少一 Pir 基因、至少一 ParG基因、至少一 parF基因、至少一 stbD基因与至少一 stbE基因，以及包含至少一pilXl基因、至少一pilX2基因、至少一pilX4基因、至少一pilX5基因、至少一pilX6 基因、至少一 pilX7基因、至少一 pilX8基因、至少一 pilX9基因、至少一 pilXlO基因、至少一 pilXll基因、至少一 taxA基因、至少一 taxB基因与至少一 taxC基因。
13.如权利要求12所述的革兰阴性细菌的质粒，其特征在于，该质粒为如SEQID NO2所述的核甘酸序列。
全文摘要
一种可稳定自发光的细菌质粒及其制备方法，其包含luxABCDE自发发光基因、可启动luxABCDE自发发光基因的启动子、ColE1复制子、对氨比西林与卡那霉素的抗性基因、稳定质粒的相关基因以及接合生殖作用相关的基因，使本发明可容易地以接合传递进入细菌中表现发光基因蛋白质，又可稳定且大量地存在细菌中，不需额外填加发光受质以及筛选抗生素仍可持续且高效能地发光，方便于活体动物中直接观察细菌的动态变化；本发明制备步骤如下a.获得一可启动发光基因的质粒；b.将含ColE1复制子及抗性基因的质粒接入质粒pSE34中；c.结合步骤a.与b.质粒制得本发明的质粒。
文档编号C12N15/70GK102268447SQ20101018805
公开日2011年12月7日 申请日期2010年6月1日 优先权日2010年6月1日
发明者邱政洵, 陈奇良, 黄耀广 申请人:长庚医疗财团法人林口长庚纪念医院