专利名称：一种快速提取质粒dna的试剂盒及其提取方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种快速提取质粒DNA的试剂盒及其提取方法。
背景技术：
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从11Λ至2001Λ以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取。
碱裂解法是一种应用最为广泛的现有制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA 是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在PH值高达12. 6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以PH4. 8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其PH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体 DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
碱裂解法存在以下不足
①耗时较长由于使用此方法提取质粒DNA需要提前人工配制数种新鲜溶液，导致实验过程延长
②成功率较低现有技术由于溶液配比的不适宜，容易导致DNA提取的失败
③提取到的DNA纯度较低普通印pendorf管对DNA没有特别的吸附作用，会导致 DNA的流失和提取纯度降低。若要再次纯化DNA，需要用到有毒的苯酚等化学药剂发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种快速提取质粒DNA 的试剂盒及其提取方法。
本发明的技术方案如下
一种快速提取质粒DNA的试剂盒，该试剂盒由溶液I-VI组成
溶液I :50mM Tris-HCI 禾Π IOmM EDTA, pH = 8. 0 (25 °C )，50 微克 / 毫升 RNaseA ；
溶液II 0. 2M NaOH 禾口 1% SDS ；
溶液III :4M盐酸胍和0. 5M醋酸钾，pH = 4. 2 ；
溶液IV :5M盐酸胍，20mM Tris-HCI, pH6. 6(25°C )，使用前加入乙醇，乙醇浓度为 38% ；
溶液V:20mM NaCL, 2mM Tris-HCI, pH 7. 5 (25°C )，使用前加入乙醇，乙醇浓度为80% ；
溶液VI =IOmM Tris-HCI, pH 8. 5 (25°C )。
应用权利要求1所述试剂盒的质粒DNA提取方法，包括以下步骤A1、用1. 5ml离心管收集l-5ml菌液。12，OOOrpm离心Imin,弃上清；
A2、加入250 μ 1溶液I，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮；室温静置Hmin ；
A3、加入250 μ 1溶液II，轻柔地反复颠倒混勻5_6次；室温静置l-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液；
A4、加入350 μ 1溶液III，立即轻柔地反复颠倒混勻5_6次；
Α5、12，OOOrpm 室温离心 lOmin，收集上清；
A6、将上清置于DNA纯化柱中，静置Hmin ；
A7、12，OOOrpm 离心 lmin，弃滤液；
A8、加入 500 μ 1 溶液 IV，12，OOOrpm 离心 lmin,弃滤液；
A9、加入 500 μ 1 溶液 V, 12，OOOrpm 离心 lmin,弃滤液；
A10、加入 500 μ 1 溶液 V, 12，OOOrpm 离心 lmin,弃滤液；
All、12，OOOrpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体；
A12、将DNA纯化柱置于新的离心管中，向纯化柱中央处悬空滴加50-100 μ 1溶液 VI，室温放置anin ；12，OOOrpm离心lmin，管底即为高纯度质粒DNA。
用此试剂盒及方法提取出来的DNA纯度较高O拟60/280在1. 7-1. 9之间，而用一般方法提取出来的DNA —般在1. 6-2. O之间。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1试剂盒由溶液I-VI组成
溶液I :50mM Tris-HCI 禾Π IOmM EDTA, pH = 8. O (25 °C )，50 微克 / 毫升 RNaseA ；
溶液II :0. 2M NaOH 和 1 % SDS ；
溶液III :4M盐酸胍和0. 5M醋酸钾，pH = 4. 2 ；
溶液IV :5M盐酸胍，20mM Tris-HCI, pH6. 6 (25°C )，使用前加入乙醇，乙醇浓度体积百分比为38% (ν/ν) 0
溶液V :20mM NaCL, 2mM Tris-HCI,pH 7. 5 (25°C )，使用前加入乙醇，乙醇浓度体积百分比为80% (ν/ν) 0
溶液VI =IOmM Tris-HCI, pH 8. 5(25°C )；
实施例2应用实施例1中试剂盒的提取方法
Al、用1. 5ml离心管收集l_5ml菌液。12，OOOrpm离心lmin，弃上清。
应根据所培养菌体的浓度与质粒的拷贝数，确定收集的菌液量。菌量过大可能导致溶菌不充分，纯化时会影响质粒纯度。菌体的体积与质粒拷贝数参见注意事项。
A2、加入250μ 1溶液I，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。室温静置 l-2min(为使溶液中的RNA被充分降解)。不能有残留细小菌块。菌体悬浮充分与否将决定质粒DNA得率的高低；
A3、加入250 μ 1溶液II，轻柔地反复颠倒混勻5_6次。室温静置l-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。若溶液II出现沉淀，请于37°C保温溶解。待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。不可剧烈混和，否则会使染色体 DNA断裂。此步骤不宜超过5min。
A4、加入350 μ 1溶液III，立即轻柔地反复颠倒混勻5_6次。此时会出现白色絮状沉淀。
A5、12，OOOrpm 室温离心 lOmin，收集上清。
A6、将上清置于DNA纯化柱中，静置Umiru
如果收集的上清液过多，超过DNA纯化柱容积(800 μ 1)，可将上清分次加入DNA纯化柱中。
Α7、12，OOOrpm 离心 lmin，弃滤液。
此时质粒DNA被吸附于DNA纯化柱的硅胶膜上。
A8、加入 500 μ 1 溶液 IV, 12，OOOrpm 离心 lmin,弃滤液。
此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。
A9、加入 500 μ 1 溶液 V，12，OOOrpm 离心 lmin,弃滤液。
A10、加入 500 μ 1 溶液 V, 12，OOOrpm 离心 lmin,弃滤液。
All、12，OOOrpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。
A12、将DNA纯化柱置于新的离心管中。向纯化柱中央处悬空滴加50-100 μ 1溶液 VI，室温放置anin。12，OOOrpm离心lmin，管底即为高纯度质粒DNA。质粒DNA于_20°C保存。
纯度高本方法中，硅胶膜可以和DNA的特异性结合，再经过溶液IV和溶液V对蛋白质和其他杂质的洗脱，可以使被提取的DNA最大限度地纯化。
成功率高标准化的最优溶液配比可以最大限度地减少实验人员因不适宜地配制提取、洗脱溶液而引起的提取失败。
所需时间短采用本方法提取DNA，减少了配制溶液的时间、减少了对提取后的 DNA进行纯化的时间，从而大大缩短了 DNA提取的时间。
提取效率高由于采用硅胶管、适宜的溶液配比，使单位底物所能提取到的DNA量大大增加。
经过试验表明用此方法提取出来的DNA纯度较高，其O拟60/280在1. 7-1. 9之间，而用一般方法提取出来的DNA 0D260/280 一般在1. 6-2. O之间。
备注一般用0D260/280来检测DNA的纯度。0D260/280在1. 7-1. 9之间表明比较纯。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种快速提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于，试剂盒由溶液I-VI组成 溶液 I :50mM Tris-HCI 禾Π IOmM EDTA, pH = 8. 0 (25 °C )，50 微克 / 毫升 RNaseA ； 溶液 II :0. 2M NaOH 和 SDS ；溶液III :4M盐酸胍和0. 5M醋酸钾，pH = 4. 2 ；溶液IV :5M盐酸胍，20mM Tris-HCI，pH6. 6 (25°C )，使用前加入乙醇，乙醇浓度为38% ； 溶液V:20mM NaCL, 2mM Tris-HCI,pH 7. 5 (25°C )，使用前加入乙醇，乙醇浓度为80% ； 溶液 VI: IOmM Tris-HCI, pH 8.5(25°C)。
2.应用权利要求1所述试剂盒的质粒DNA提取方法，其特征在于包括以下步骤:A1、 用1. 5ml离心管收集l-5ml菌液。12，OOOrpm离心Imin,弃上清；A2、加入250 μ 1溶液I，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮；室温静置Ι-aiiin ； A3、加入250 μ 1溶液II，轻柔地反复颠倒混勻5-6次；室温静置l-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液；A4、加入350 μ 1溶液III，立即轻柔地反复颠倒混勻5-6次；Α5、12，OOOrpm室温离心lOmin，收集上清；A6、将上清置于DNA纯化柱中，静置Ι-aiiin ；A7、12，OOOrpm 离心 Imin,弃滤液；A8、加入500 μ 1溶液IV，12，OOOrpm离心Imin,弃滤液；Α9、加入500 μ 1溶液V，12，OOOrpm离心Imin,弃滤液；Α10、加入500 μ 1溶液V，12，OOOrpm离心Imin,弃滤液；All、12，OOOrpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体；A12、将DNA纯化柱置于新的离心管中，向纯化柱中央处悬空滴加50-100 μ 1溶液VI，室温放置anin ； 12，OOOrpm离心lmin，管底即为高纯度质粒DNA。
全文摘要
本发明公开了一种快速提取质粒DNA的试剂盒，试剂盒由溶液I-VI组成溶液I50mM Tris-HCI和10mM EDTA，pH＝8.0(25℃)，50微克/毫升RNaseA；溶液II0.2MNaOH和1％SDS；溶液III4M盐酸胍和0.5M醋酸钾，pH＝4.2；溶液IV5M盐酸胍，20mM Tris-HCI，pH6.6(25℃)，使用前加入乙醇，乙醇浓度为38％；溶液V20mM NaCL，2mM Tris-HCI，pH 7.5(25℃)，使用前加入乙醇，乙醇浓度为80％；溶液VI10mMTris-HCI，pH 8.5(25℃)。还公开了应用所述试剂盒的质粒DNA提取方法；用此试剂盒及方法提取出来的DNA纯度较高OD260/280在1.7-1.9之间，而用一般方法提取出来的DNA一般在1.6-2.0之间。
文档编号C12N15/10GK102533732SQ20121001653
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月19日 优先权日2012年1月19日
发明者季阳, 张新全, 杨盛婷, 梁小玉, 江双吕, 许畅, 黄琳凯 申请人:四川农业大学