专利名称：一种提取质粒dna的试剂和方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种提取质粒DNA的试剂和方法。
背景技术：
质粒DNA是基因工程常用的载体，可以携带外源基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达，质粒DNA的提取和纯化是分子生物学研究领域中应用最广泛和最基本的技术，质粒提取的效率和质量对于后续实验(酶切、PCR扩增和测序等)的成功与否有着直接的关系。目前在国内外，很多生物试剂公司都研制了与提取质粒技术相关的试剂盒， 如普洛麦格、天根生化、生工等。该类试剂盒多以纯化柱为主，成本高，价格昂贵，试剂繁杂且耗时较长。若以改良的碱裂解、酚-氯仿抽提方法提取质粒，获得的质粒DNA产量低，质量不高，不能满足下游的酶切和测序的要求，同时多种试剂混合应用，无疑加大了实验的工作量，使得实验时间显著延长，影响生物学实验操作和实验结果。
发明内容
本发明提供了一种提取质粒DNA的试剂和方法，本发明所用提取质粒的试剂成本低，提取质粒DNA的方法操作简单，且本发明所述的试剂和方法提取出的质粒产量高、纯度高，本发明具有快速、简易、高效、高质且成本低的优点。为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案一种提取质粒DNA的试剂，其特征在于它包括菌体裂解试剂、蛋白抽提试剂、质粒DNA沉淀试剂和质粒DNA溶解试剂；所述菌体裂解试剂的组分为10mM Tris-HClUmM EDTA, IOOmM氯化钠和5mg/ml溶菌酶，以超纯水为溶剂，所述Tris-HCl的PH值为7. 4-8. 0 ； 所述蛋白抽提试剂的组分为体积比为1 1的酚和氯仿混合物；所述质粒DNA沉淀试剂的组分为PH7. 5的5. 5M醋酸钠溶液和无水乙醇，所述醋酸钠溶液和无水乙醇体积比为 1 3 ；所述质粒DNA溶解试剂的组分为含有0. lmg/ml RNase的超纯水。其中，所述试剂Tris-HCl的最佳PH值为8. 0。本发明还提供了一种提取质粒DNA的方法，它包括以下步骤(1)摇菌扩增质粒；将携带质粒的大肠杆菌接种于LB固体培养基中，挑选单克隆菌落接种于LB液体培养基扩增培养，置于在30-38°C恒温摇床上以150-250转/分钟摇动培养；(2)取培养12-16小时OD6tltl达到0. 6以上的生长状态良好的细菌菌液1. 5ml于 1. 5ml离心管，20°C -25°C下以13000g离心30秒，弃上清；(3)沉淀中加入50 μ 1所述菌体裂解试剂，充分振荡混勻；(4)加入50μ 1所述蛋白抽提试剂，置于涡旋振荡仪上混勻2秒钟；(5) 200C -250C以13000g离心5分钟以释放质粒DNA ；(6)收集上清，切勿触动蛋白质界面；(7)加入17 μ 1质粒DNA沉淀试剂和250 μ 1的无水乙醇，颠倒混勻；
(8) 20°C -25°C以13000g离心 1分钟以沉淀质粒DNA ；(9)弃上清，并干燥质粒DNA ；(10)用40 μ 1质粒DNA溶解试剂溶解质粒DNA，_20°C保存备用。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是本发明的所用试剂采用溶菌酶溶解细菌，通过酚-氯仿一步法去除蛋白质和RNA。用本发明所述提取质粒的方法提取质粒操作时间短，提一种质粒的时间总共不超过10分钟；本发明所用提取质粒的试剂组成简单， 均为常见实验试剂，来源广泛且价格低，各组分均可以采用国产分析纯就可以提取到高产量和纯度的质粒，大大降低了实验经费；获得的质粒DNA产量高，纯度好，无蛋白和RNA的污染，满足分子生物学相关实验要求，提取到的质粒DNA可以直接用于下游的酶切、连接、测序、原核转化和真核转染等实验，大大方便了生物实验操作，节省了实验时间，提高了实验效率。
图1是本发明中应用本发明方法和应用天根柱式纯化试剂盒提取的质粒DNA电泳对照图谱。图中，M为λ-HindIII消化的DNA分子量标准，1、2为使用本发明方法所提取的质粒DNA图谱，3、4为使用天根柱式纯化盒所提取的相同质粒DNA图谱。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明的技术方案作进一步详细的说明。实施例1本发明所述的提取质粒DNA的试剂包括四种试剂，分别为菌体裂解试剂Rl ；蛋白抽提试剂R2 ；质粒DNA沉淀试剂R3 ；质粒DNA溶解试剂R4。所述菌体裂解试剂Rl 组分10mMTris-HCl (pH 8.0)；ImM EDTA ；IOOmM 氯化钠；5mg/ml 溶菌酶。按如下方法配制IOOml的试剂Rl 取超纯水75ml0. 5M EDTA (ρΗ8· 0) 0. 2ml5M NaCl2mlIM Tris-HCl(pH 8. 0) Iml用超纯水定容至100ml，置于121°C灭菌15分钟，再加入500mg溶菌酶，于4°C保存。所述蛋白抽提试剂R2 组分取水饱合酚 50ml氯仿50ml混勻后，避光于4°C保存。
所述质粒DNA沉淀试剂R3 组分5· 5M醋酸钠+无水乙醇。先按如下方法配制IOOml的5. 5M醋酸钠取醋酸钠 45g超纯水80ml搅拌溶解后，用IOM NaOH调至pH7. 5，用超纯水定容至100ml，避光于室温保存。再将所述5. 5M醋酸钠和无水乙醇按照体积比为1 3的比例混合，制得所述试剂 R3。所述质粒DNA溶解试剂R4 组分0·lmg/ml RNase 的超纯水。按如下方法配制IOOml的试剂R4 称取IOmg的RNase，WA IOOml超纯水定容，4°C保存。本发明用上述配制好的四种试剂按照如下步骤提取质粒DNA (1)按常规摇菌扩增质粒(详见《分子克隆实验指南》)，具体步骤如下A、准备LB液体培养基和LB固体培养基称取胰蛋白胨2克，酵母提取物1克，氯化钠2克，加入无菌蒸馏水至200毫升，高压蒸汽灭菌20分钟，制得LB液体培养基；称取胰蛋白胨2克，酵母提取物1克，氯化钠2克，琼脂3克，加入无菌蒸馏水至 200毫升，高压蒸汽灭菌20分钟，制得LB固体培养基；B、挑取LB固体培养基上生长的携带质粒的大肠杆菌单克隆菌落，接种于LB液体培养基中，200转/分钟，放在37度恒温摇床上摇动；(2)取常规培养16小时0D_达到0. 6以上的生长状态良好的细菌菌液1. 5ml于 1. 5ml离心管，室温下以13000g离心30秒，弃上清；(3)向沉淀中加入50 μ 1试剂Rl，充分振荡混勻；(4)再加入50 μ 1试剂R2，于涡旋振荡仪上混勻2秒钟；(5)室温下以13000g离心5分钟以释放质粒DNA ；(6)用无菌移液枪吸取上清，切勿触动蛋白质界面；(7)向上清中加入17 μ 1的试剂R3和250 μ 1的无水乙醇，颠倒混勻；(8)室温下以13000g离心1分钟以沉淀质粒DNA ；(9)弃上清，并干燥质粒DNA ；(10)用40 μ 1的试剂R4溶解质粒DNA，_20°C保存备用。所提取到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳加以验证。如图1所示，含同一质粒DNA的菌体应用本发明方法和应用天根柱式纯化试剂盒提取的质粒DNA电泳对照图谱。 图1中，M为DL2000分子量标准，1、2为使用本发明方法所提取的质粒DNA，3、4为使用天根柱式纯化 盒所提取的相应质粒DNA。从图中看出用两种试剂盒所得的质粒DNA，电泳条带清晰，无RNA污染。说明使用本发明提取的质粒DNa与使用天根柱式纯化试剂盒提取的同一质粒DNA比较，在纯度和产量上无明显区别，但本发明所述的提取质粒DNA的试剂相对于天根柱式纯化试剂盒成本降低很多，而且操作简单，操作所用时间短。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换 ，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
权利要求
1.一种提取质粒DNA的试剂，其特征在于它包括菌体裂解试剂、蛋白抽提试剂、质粒DNA沉淀试剂和质粒DNA溶解试剂；所述菌体裂解试剂的组分为10mM Tris-HClUmM EDTA, IOOmM氯化钠和5mg/ml溶菌酶，以超纯水为溶剂，所述Tris-HCl的PH值为7. 4-8. 0 ； 所述蛋白抽提试剂的组分为体积比为1 1的酚和氯仿混合物；所述质粒DNA沉淀试剂的组分为PH7. 5的5. 5M醋酸钠溶液和无水乙醇，所述醋酸钠溶液和无水乙醇体积比为 1 3 ；所述质粒DNA溶解试剂的组分为含有0. lmg/ml RNase的超纯水。
2.根据权利要求1所述的一种提取质粒DNA的试剂，其特征在于所述试剂Tris-HCl的最佳PH值为8.0。
3.一种根据权利要求1所述的试剂提取质粒DNA的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)摇菌扩增质粒；将携带质粒的大肠杆菌接种于LB固体培养基中，挑选单克隆菌落接种于LB液体培养基扩增培养，置于在30-38°C恒温摇床上以150-250转/分钟摇动培养；(2)取培养12-16小时OD_达到0.6以上的生长状态良好的细菌菌液1. 5ml于1. 5ml 离心管，20°C -25°C下以13000g离心30秒，弃上清；(3)沉淀中加入50μ 1所述菌体裂解试剂，充分振荡混勻；(4)加入50μ 1所述蛋白抽提试剂，置于涡旋振荡仪上混勻2秒钟；(5)200C -250C以13000g离心5分钟以释放质粒DNA ；(6)收集上清，切勿触动蛋白质界面；(7)加入17μ 1质粒DNA沉淀试剂和250 μ 1的无水乙醇，颠倒混勻；(8)200C -250C以13000g离心1分钟以沉淀质粒DNA ；(9)弃上清，并干燥质粒DNA;(10)用40μ 1质粒DNA溶解试剂溶解质粒DNA，_20°C保存备用。
全文摘要
本发明提供了一种提取质粒DNA的试剂和方法，它包括菌体裂解试剂、蛋白抽提试剂、质粒DNA沉淀试剂和质粒DNA溶解试剂。用本发明所述提取质粒的方法提取质粒操作时间短，提一种质粒的时间总共不超过10分钟；本发明所用提取质粒的试剂组成简单，均为常见实验试剂，来源广泛且价格低，各组分均可以采用国产分析纯就可以提取到高产量和纯度的质粒，大大降低了实验经费；获得的质粒DNA产量高，纯度好，无蛋白和RNA的污染，提取到的质粒DNA可以直接用于酶切、连接、测序、原核转化和真核转染等实验，大大方便了生物实验操作，节省了实验时间，提高了实验效率。
文档编号C12R1/19GK102206627SQ20111007475
公开日2011年10月5日 申请日期2011年3月18日 优先权日2011年3月18日
发明者刘世海, 刘相萍, 姚如永, 杨堃, 隋爱华 申请人:青岛大学医学院附属医院