专利名称：草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)Po-5菌株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵领域，尤其涉及一株产果胶酶的草酸青霉菌 oxalicum) Po-5菌株及其液体发酵生产果胶酶的方法。
背景技术：
果胶酶的研究应用迄今已有七十多年的历史。现在许多国家都有商品果胶酶制剂出售，品种也日趋多样化，其产量己跻身世界四大酶制剂行列。果胶酶用途广泛，在很多领域中都能得到良好的应用。在水果加工业中，能破坏果汁中悬浮物的稳定性，使其凝聚沉淀，果汁得到澄清，降低果汁的粘度。在饲料生产工业中， 果胶酶可降低饲料的粘度，促进饲料在动物消化道内的消化吸收。在纺织工业中，果胶酶处理过的棉织物被去除了大部分的果胶质，同时也去除了大部分的棉蜡物质和其他杂质，最终达到棉织物精练的目的。另外，果胶酶在木质防腐、生物制浆、环境保护、污物软化处理等行业中也有着重要作用。基于果胶酶特有的这些特点和用途，目前有关果胶酶高产菌株的筛选、培养条件的优化等的研究异常活跃，成为生物酶学领域中一个新的研究热点。但目前可用于果胶酶生产且有自主产权的高产菌株还很缺乏。中国发明专利申请(申请号20081008拟48. 2申请日2008-04-26)公开了动物源草酸青霉发酵产饲料级果胶酶工艺，一种以鹅体内分离所得到的草酸青霉发酵产饲料级果胶酶工艺，属于微生物发酵领域。通过固态发酵，生产出酶活力大，保存期长，耐贮性好， 各组分百分含量稳定和纯度高的酶制剂。生产的果胶酶制剂总酶活力达10123. 22U · G-1 ； 聚半乳糖醛酸酶活力5101. 23U .G—1，为总酶活力的50% ；果胶酯酶活力6986. 52U .G—1，为总酶活力的69% ；果胶裂解酶0. 56U · G-1，为总酶活力的0. 005%。中国发明专利申请(申请号03120793.6申请日2003-03-20)公开了草酸青霉固态发酵生产果胶酶，发明以甜菜废渣作为碳源，以硫酸氨作为氮源，接种草酸青霉 BZH-2002菌株，在接触空气条件下，于温度30°C左右，环境相对湿度70%左右固态发酵，培养72小时左右达到产酶高峰。用水浸提培养物，过滤，滤液即果胶酶液。经脱胶法测定酶活力，果胶酶产率达到1. 2 X IO5单位/克甜菜渣。
发明内容
基于现今市场上高活性果胶酶的价格昂贵，且主要被国外市场垄断，本发明的第一个目的是提供一种草酸青霉菌oxalicum) Po-5菌株，该草酸青霉菌 iPenicillium oxalicum)Vo-h菌株为从自然生境中筛选得到的高产果胶酶的菌株，并用液体发酵的形式来生产果胶酶，以期降低果胶酶的生产成本、优化工艺、降低环境压力。本发明的第二个目的是提供上述的草酸青霉菌、PeniCillium oxalicum) Po-5菌株制备果胶酶的方法。为了实现上述第一个目的，本发明采用了以下的技术方案草酸青霉菌milliwn oxalicum) o-^菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO: M 2010350，保藏日期是2010年12月14日。该菌株筛自金华东阳荷塘中的污泥，其ITS基因序列已登录于Genbank，登录号为HQ680452。上述草酸青霉菌iPenicillium oxalicum) Po_5菌株的培养特征草酸青霉Po_5 菌株在PDA培养基上，28°C，3 d即形成典型菌落，菌落呈蓝绿色，边缘为白色，直径19 mm, 轮廓规则，外观呈绒毛状；显微镜下观察，菌丝细胞丝状交织，具横隔；分生孢子梗不具足细胞，帚状枝为对称双轮型，瓶梗细长渐变尖锐；分生孢子椭圆形，蓝绿色。为了实现上述第二个目的，本发明还公开了采用上述的草酸青霉菌 oxalicum) Po-5菌株用于制备果胶酶。该方法采用包括桔皮与米糠的培养基基质，在温度 26 30°C、pH5. 5 6. 5、摇床转速140 200 PmirT1的条件下，发酵后获发酵液；取发酵液经离心，其上清液即为果胶粗酶液。作为进一步的改进，该方法包括以下的步骤
1)草酸青霉菌(/^ iciBi 菌种使用前菌株经固体 PDA斜面培养基活化后，用无菌水配成0. 5 X IO6 2. OX IO6个每毫升的孢子悬浮液；
2)然后取摇瓶装液量的1% 8%的孢子悬浮液接入种子培养基，在洸 30°C，140 200 rmirr1,培养M h后作为种子液；
3)取摇瓶装液量的5% 15%的种子液接入摇瓶培养基中，在沈 30°C，继续培养70 h后获发酵液；
4)取发酵液经5000 20000 r*min_1离心8 20 min，其上清液即为粗酶液。作为优选，上述的PDA斜面培养基包括马铃薯150 250份、葡萄糖15 25份、 琼脂15 20份、水1 000份，ρΗ5· 5 6. 5。作为优选，上述的种子培养基包括果胶30 50份，(NH4)2SO4 8 15份，KH2PO4 35 40 份，K2HPO4 · 3Η20 1 3 份，水 1 000 份，ρΗ5· 5 6. 5。作为优选，上述的摇瓶培养基包括桔皮粉30 80份，米糠40 100份， (NH4)2SO4 8 15 份，KH2PO4 35 40 份，K2HPO4 ·3Η20 1 3 份，水 1 000 份，ρΗ5· 5 6. 5。本发明由于采用了上述的技术方案，从自然生境中筛选高产果胶酶的菌株，并用液体发酵的形式来生产果胶酶，以期降低果胶酶的生产成本、优化工艺、降低环境压力。该菌株利用天然廉价的桔皮与米糠等作为培养基基质，发酵得到的果胶酶活可达1. 39X IO5 UmirT^mr1，属高产果胶酶菌株。Po-5菌株液体发酵生产的果胶酶在30 50°C，pH 5.0 左右时能够保持良好的稳定性。
图1为基于Po-5菌株的ITS序列建立的系统发育树。图2为Po-5菌株黄色水解圈的培养特征。图3为Po-5菌株在PDA上的菌落培养特征。图4为Po-5菌株有隔菌丝的显微形态特征。图5为Po-5菌株分生孢子梗和分生孢子的显微形态特征。图6为Po-5菌株分分生孢子的显微形态特征。
图7为采用本发明Po-5菌株制备的果胶酶的热稳定性测试图。图8为采用本发明Po-5菌株制备的果胶酶的pH稳定性。生物材料保藏说明
草酸青霉菌、PeniCilliim oxalicum)Vo-h菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学生命科学学院，其保藏编号为=CCTCC NO: M 2010；350，保藏日期是2010年12月14日。
具体实施例方式一、Po-5 菌株。用来液体发酵生产果胶酶的菌株是草酸青霉菌oxalicum) Po-5 菌株，该菌株筛自金华东阳荷塘中的污泥，其ITS基因序列已登录于Genbank，登录号为 HQ680452。基于Po_5菌株的ITS序列建立了系统发育树(图1)。本发明所用的草酸青霉菌iPenicillium oxalicum) Po-5菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为=CCTCC M 2010350，保藏日期为2010年12月14日。Po-5菌株的培养特征草酸青霉Po-5菌株在PDA培养基上，28°C,3 d即形成典型菌落，菌落呈蓝绿色，边缘为白色，直径19 mm，轮廓规则，外观呈绒毛状。显微镜下观察，菌丝细胞丝状交织，具横隔。分生孢子梗不具足细胞，帚状枝为对称双轮型，瓶梗细长渐变尖锐；分生孢子椭圆形，蓝绿色。经数代连续培养，生物学性状和产酶特性基本稳定(图2 图 6所示)。二、用Po-5菌株液体发酵生产果胶酶。(一)培养基。马铃薯葡萄糖培养基(PDA):马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 20 g、水1 000 mL, pH 6. 0。种子培养基果胶40 g, (NH4)2SO4 10 g,KH2PO4 38 g，K2HPO4 ·3Η20 2 g，水 1 000 mL, pH 6· O。摇瓶培养基桔皮粉50 g，米糠 60 g, (NH4)2SO4 10 g, KH2PO4 38 g, K2HPO4 · 3H20 2 g,7jC 1 000 mL, pH 6. 0。(二)液体发酵生产果胶酶实例。草酸青霉菌(/^ iciBi oxalicum) Po-5菌种用甘油保藏于_20°C冰箱中，使用前菌株经固体PDA斜面培养基活化后，用无菌水配成1. OX IO6的孢子悬浮液，然后取2 mL (摇瓶装液量的5%)孢子悬浮液接入种子培养基(250 mL三角瓶装40 !^)，在^°C，160 !■ mirT1，培养M h后作为种子液。取3. 6 mL (摇瓶装液量的9%)种子液接入摇瓶培养基中 (250 mL三角瓶装40 mL)，继续培养70 h后获发酵液。取发酵液经10 000 r-min"1离心10 min，其上清液即为粗酶液。粗酶液酶活利用DNS (3，5—二硝基水杨酸)法，在MO nm处用紫外分光光度计测定其酶活性。最终得到粗酶液果胶酶酶活约为1.39X 105 UmirT^mr1。三、Po-5菌株生产的果胶酶性质。(一)热稳定性将粗酶液分别在301、401、501、601、701水浴下保温1 h、2 h、3 h、4 h，然后按照
酶活力测定方法分别测定其酶活。结果显示Po-5菌株液体发酵产生的果胶酶在30°C 50°C温度范围内维持稳定(图7)。
(二)pH 稳定性
将粗酶液分别在PH值为4.0 8.0的缓冲液中处理1 h、2 h、3 h、4h，然后按照酶活力测定方法分别测定其酶活。结果显示Po-5菌株液体发酵产生的果胶酶在pH 5.0左右时稳定性最好(图8)。
权利要求
1.草酸青霉菌菌株，其特征在于该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为=CCTCC NO: M 2010350，保藏日期是2010年12月14日。
2.根据权利要求1所述的草酸青霉菌(/^fliciBiy oxalicum) Po-5菌株，其特征在于草酸青霉Po-5菌株在PDA培养基上，28°C,3 d即形成典型菌落，菌落呈蓝绿色，边缘为白色，直径19 mm，轮廓规则，外观呈绒毛状；显微镜下观察，菌丝细胞丝状交织，具横隔；分生孢子梗不具足细胞，帚状枝为对称双轮型，瓶梗细长渐变尖锐；分生孢子椭圆形，蓝绿色。
3.根据权利要求1所述的草酸青霉菌(/^fliciWi腫oxalicum) o~^菌株用于制备果胶酶。
4.根据权利要求1所述的草酸青霉菌iPenicilliwnoxalicum ) Po-5菌株制备果胶酶的方法，其特征在于该方法采用包括桔皮与米糠的培养基基质，在温度26 30°C、 pH5. 5 6. 5、摇床转速140 200 r-min"1的条件下，发酵后获发酵液；取发酵液经离心，其上清液即为果胶粗酶液。
5.根据权利要求4所述的草酸青霉菌腫菌株制备果胶酶的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤(1)草酸青霉菌、PeniciIliumoxalicum) Po-5菌种使用前菌株经固体PDA斜面培养基活化后，用无菌水配成0. 5 X IO6 2. OX IO6个每毫升的孢子悬浮液；(2)然后取摇瓶装液量的1% 8%的孢子悬浮液接入种子培养基，在沈 30°C，140 200 rmiiT1,培养24 h后作为种子液;(3)取摇瓶装液量的5% 15%的种子液接入摇瓶培养基中，在沈 30°C，继续培养70 h后获发酵液；(4)取发酵液经5000 20000r-min"1离心8 20 min，其上清液即为粗酶液。
6.根据权利要求4所述的草酸青霉菌腫菌株制备果胶酶的方法，其特征在于PDA斜面培养基包括马铃薯150 250份、葡萄糖15 25份、琼脂 15 20 份、水 1 000 份，ρΗ5· 5 6. 5。
7.根据权利要求4所述的草酸青霉菌腫菌株制备果胶酶的方法，其特征在于种子培养基包括果胶30 50份，(NH4)2SO4 8 15份，KH2PO4 35 40 份，K2HPO4 · 3H20 1 3 份，水 1 000 份，ρΗ5· 5 6. 5。
8.根据权利要求4所述的草酸青霉菌腫菌株制备果胶酶的方法，其特征在于摇瓶培养基包括桔皮粉30 80份，米糠40 100份，(NH4)2SO4 8 15 份，KH2PO4 35 40 份，K2HPO4 · 3H20 1 3 份，水 1 000 份，ρΗ5· 5 6. 5。
全文摘要
本发明属于微生物发酵领域，尤其涉及一株产果胶酶的草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)Po-5菌株及其液体发酵生产果胶酶的方法。草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)Po-5菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M2010350，保藏日期是2010年12月14日。本发明从自然生境中筛选高产果胶酶的菌株，并用液体发酵的形式来生产果胶酶，以期降低果胶酶的生产成本、优化工艺、降低环境压力。该菌株利用天然廉价的桔皮与米糠等作为培养基基质，发酵得到的果胶酶活可达1.39×105U min-1 ml-1，属高产果胶酶菌株。Po-5菌株液体发酵生产的果胶酶在30～50℃，pH5.0左右时能够保持良好的稳定性。
文档编号C12R1/80GK102154124SQ20111007468
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者宋迤明, 蒋冬花, 蓝丽精, 韦风 申请人:浙江师范大学