草酸青霉bam-1及其分离纯化方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种菌株草酸青霉（Penicillium?oxalicum）BAM-1。该菌株是从林地有机材料覆盖雷竹林土壤、长期堆放的有机覆盖物中分离出来的一支纯的菌株，该菌株序列与草酸青霉(Penicillium?oxalicum)的26SrRNA基因序列高度同源(99.3%)。本发明提供了该菌株的培养、产酶、发酵条件及竹林中应用的环境条件。该菌株能够有效分解高纤维素含量的林地有机覆盖物稻草、砻糠，加速了林地存留有机覆盖物的快速生态腐解，尤其在竹林可持续经营中具有广阔的应用前景。
【专利说明】草酸青霉BAM-1及其分离纯化方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，具体涉及一种草酸青霉BAM-1及其分离纯化方法与应用。
【背景技术】
[0002]雷竹是我国优良的笋用竹种，笋味鲜美、产量高、效益好，在我国南方的浙江、江西等地有规模栽培，目前我国雷竹林面积达20多万hm_2。以雷竹为主栽竹种的竹笋业已成为区域农村经济社会发展的支柱产业和农民家庭经济收入的主要来源。自上世纪90年代初以来，许多笋用竹产区大面积推广应用有机材料(主要为砻糠、稻草)林地覆盖技术，利用覆盖物的发酵增温、保温、保湿作用促使笋芽提早分化、萌发，在秋冬季、早春有竹笋产出，满足市场对鲜笋供应淡季的大量需求，显著地提高了笋用竹林的经济效益，这对雷竹在许多适生区的大规模推广栽培起到了极大的促进作用。然而，林地有机材料覆盖过程中大量有机覆盖物(39 t.hm_2.a-1稻草和54 t.hm_2.a—1砻糠)的输入对雷竹林生态系统健康产生了严重的影响，突出表现在覆盖竹林极易产生立地生产力衰退，仅浙江省临安市3万hm2的雷竹林中就有1/2以上竹林出现了不同程度的退化，重度退化竹林几乎无经济产出。究其原由，短期内难以自然分解的有机材料覆盖物的大量林地存留是引起竹林退化的主要原因之一。有机覆盖物均为高C/N比材料，特别是砻糠，自然条件下分解需3年以上时间，覆盖后林地很难清理彻底，多年覆盖的竹林地存留覆盖物厚度至少5cm以上，每年竹林出笋成竹后的林地垦复使大量有机覆盖物充斥于土壤中，导致土壤发生物理、化学和生物性劣变。目前针对雷竹林覆盖过程中存留的大量的有机覆盖物尚无生态、环保的处理方法，竹农也多采取深翻林地和加客土的方式来减轻有机覆盖物存留所带来的负面影响，但仍无法很好地解决有机覆盖物短期内难以有效分解的现实问题。因此，分离与筛选高C/N比有机覆盖材料高效分解微生物，并掌握其培养条件、产酶特性、发酵方法及覆盖雷竹林中的应用技术，有利于雷竹林土壤环境改善，促进退化雷竹林恢复，保障雷竹林健康可持续经营和竹笋质量安全，也是竹农生产中迫切需 要的实用技术，推广应用前景巨大。
【发明内容】
[0003]针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种能高效分解有机覆盖物的菌种，尤其是对竹林地存留的有机覆盖物具有高效分解能力的微生物菌株，并提供该菌株的筛选、分离纯化、培养等方法，以及该菌株在分解林地有机覆盖物上的应用技术，从而解决竹林地有机覆盖物大量存留引起竹林退化的现实问题。
[0004]本发明的技术方案如下:
本发明提供的具有高效分解有机覆盖物能力的微生物菌株为草酸青霉ox37icw?)BAM-l，保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日:2013年10月10日，保藏号为CGMCC N0.8315。
[0005]草酸青霉iPeniciIlium oxalicum ) BAM-1的特征为:菌落形态平坦，质地绒状，菌丝体白色，分生孢子灰绿色，无可溶性色素。显微镜下观察菌株的菌丝体，分生孢子梗发生于基质，壁平滑，帚状枝双轮生，偶有三轮生或单轮生；梗基每轮2-3个，13-20X3.2-3.7 μ m，彼此通常较紧贴；瓶梗幼龄时为瓶状至披针状，充分成熟时近圆柱形，梗颈明显，分生孢子椭圆形，4.5-5.5X3.0-4.0 μ m，壁平滑。该菌株26S rRNA基因序列递交到GenBank数据库,序列与草酸青霉(Penicillium oxalicum) 26S rRNA基因序列高度同源(99.3%)。
[0006]所述的草酸青霉iPeniciIlium oxalicum ) BAM-1,其分离纯化方法包括以下步骤:
1)富集培养:取土壤和腐烂有机覆盖物样品，在无菌水中振荡分散后，取悬浊液接种于马丁氏孟加拉红富集培养基中，28 1:下120 PmirT1振荡培养2 d，反复培养3次；马丁氏孟加拉红富集培养基的配方为:KH2PO4 I g、MgSO4.7Η20 0.5 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、琼脂20 g、孟加拉红3.3 mg、链霉素30 μ g、H2O 1000 ml、自然pH值；
2)初筛:取第三次富集培养液，用玻璃涂布棒均匀涂布在刚果红纤维素平板培养基上，28 °C下培养，以在平板上出现透明水解圈的时间以及培养4-5 d后水解圈直径与菌落直径的比值大小为基准，筛选水解圈出现早且直径较大的菌株。将筛选出的菌株保存在PDA平板培养基上；
刚果红纤维素平板培养基配方为:CMC-Na 2.1 g、刚果红0.39 g、(NH4) SO4 2.1 g、MgSO4*7H20 0.5 g, K2HPO4 1.05 g、NaCl 0.5 g、琼脂 18 g、H2O 1000 ml、自然 pH 值；
3)复筛:将初筛获得的透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株在PDA培养基上活化后，用直径I cm打孔器在菌落生长均匀处取菌块接种到赫奇逊液体复筛培养基中，28 °C下120 r.mirT1振荡培养5 d，测定发酵液滤纸酶活力，筛选出酶活力最高的菌株，测序，该菌株的26S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示；赫奇逊液体复筛培养基配方为:稻草25 g、KH2PO4 1.05 g、NaCl 0.11 g、MgSO4.7Η20 0.29 g,NaNO3 2.51 g,FeCl3 0.01 g、CaCl2 0.10g、H20 1000 ml、pH 值 6.05。
[0007]尊窗着霉^Penicillium οχ3^7----)ΒΑΜ-1的活化方法如下:配制PDA固体培养基，高压灭菌，冷却至50 °C左右，倒平板，冷却后用粘菌株的接种环在平板培养基上划线，用封口膜封好培养皿，倒置28 1:静置培养3-5 d，可重复复壮1-2次，整个接种与培养过程在超净工作台中无菌条件下进行；所述的PDA固体培养基的制作方法为:1)取去皮马铃薯200g,切碎,加入500 ml蒸懼水煮沸15 min,过滤,得到马铃薯汁；2)在该马铃薯汁中加入葡萄糖20 g ;3)然后加水至1000 ml，调节pH值至6.05 ;得到液体PDA液体培养基；4)向PDA液体培养基中加入18 g琼脂，得到固体PDA培养基。
[0008]尊窗着霉^Penicillium οχ3^7----)ΒΑΜ-1的培养方法如下:配制PDA液体培养基，灭菌，冷却后，用接种环从复壮菌落边缘取直径0.5 cm的生长旺盛且无污染的菌块2-3块，接种至PDA液体培养基中，120 r.min-Ι摇瓶培养3_5 d，整个接种与培养过程在超净工作台中无菌条件下进行。
[0009]尊窗着霉^Penicillium (Ora/icw?) BAM-1可用于分解林地有机覆盖物。
[0010]驾履"着霉(FeniciIIium oxalicum) BAM-1在分解雷竹林有机覆盖物的应用,其特征在于其应用方法为:取用草酸青霉BAM-1发酵菌液,发酵菌液生物量为38.5 g干菌.L—1，菌液滤纸酶活力为8.65-10.91U，用量为60-90 kg.hm_2，按1:10稀释后均匀喷洒于土壤表面，并浅锄表层土壤，使发酵菌液与土及有机覆盖物充分接触；应用季节为5-6月和9-10月，气温以30-35°C为宜，林地土壤体积水分率为50_60%。
[0011]所述的草酸青霉BAM-1在分解雷竹林有机覆盖物的应用，其特征在于所述的发酵菌液的制备方法为:采用含1%食用油的改良PDA液体培养基，其组分为:去皮马铃薯220 g，葡萄糖21 g，食用油10ml，加水至1000 ml，调节pH值至6.05 ;28 °C下发酵3 d，溶氧量为73 %，搅拌子转速为20 r.mirT1，消泡剂为非离子型改性聚硅氧烧 。
[0012]上述的草酸青霉oxali cum) BAM_1,是从林地有机材料覆盖雷竹林土壤、长期堆放有机覆盖物中分离出来的一支纯的菌株，能在以竹叶、稻草、砻糠为唯一碳源的培养基上良好生长，且生物量与产酶效果明显优于已公布的优良纤维素降解菌株哈茨ifMXTrichoderma harziamumy$\绿色Jf.霉 iTrichoderma Kirofe)。本发明提供了该菌株的分离纯化方法并对其培养、产酶、发酵条件进行了优化，培养方法简单，效果好。该菌株能够有效分解高纤维素含量的林地有机覆盖物稻草、砻糠，加速了林地存留有机覆盖物的快速、生态腐解，尤其是在竹林可持续经营中具有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1 % Penicillium oxali cum BAM-1与绿色木霉、哈茨木霉产酶活性比较 图2为搖'瓶培养Pen i c i 11 i um oxali cum BAM-1生物量积累曲线
图 3 % Penicillium oxali cum BAM-1 显微结构图
图 4 为 Penicillium oxali cum BAM-1 的系统分类图
图5为Penicillium oxali cum BAM-1在发酵试验中的生物量积累曲线
图6为Penicillium oxali cum BAM-1对竹叶、稻草和砻糠的分解效果
图7为对照对竹叶、稻草和砻糠的分解效果
戰込为Penicillium oxali cum BAM-1雷竹林存留有机覆盖物分解率曲线。
【具体实施方式】
[0014]下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步具体的说明。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述
【发明内容】
对本发明做出一些非本质的改进和调整。以下通过具体实施例来进一步说明本发明。
[0015]实施例1:菌株的分离、活化和培养
该菌株分离自浙江省临安市太湖源镇高云村长期堆放的雷竹林地有机覆盖物和覆盖雷竹林土壤，经过样品的富集培养、初筛、复筛分离得到的一支纯的菌株。
[0016]样品的富集培养:各称取土壤和腐烂有机覆盖物样品10.0 g，加入装有90 ml无菌水和玻璃珠的250 ml三角瓶中，180 PmirT1振荡30 min使样品充分分散，用无菌移液器取悬浊液5 ml接种于45 ml富集培养基中，28 1:下120 PmirT1振荡培养2 d。再取培养液接种到新鲜无菌富集培养基中，反复培养3次。
[0017]富集培养基采用改良的马丁氏孟加拉红液体培养基，其配方为:KH2PO4 lg、MgSO4.7H20 0.5 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10g、琼脂20 g、孟加拉红3.3mg链霉素30 μ g、H2O1000 ml、自然 pH 值。
[0018]初筛:选用刚果红纤维素培养基进行纤维素降解菌的初步筛选。取第三次富集培养液100 μ?，用玻璃涂布棒均匀涂布在刚果红纤维素平板培养基上，28 °c下培养，以在平板上出现透明水解圈的时间以及培养4-5 d后水解圈直径与菌落直径的比值大小为基准，筛选水解圈出现早且直径较大的菌。将筛选出的菌株保存在PDA平板培养基上。
[0019]刚果红纤维素平板培养基配方为:CMC_Na 2.1 g、刚果红0.39 g、(NH4) SO4 2.1 g、MgSO4*7H20 0.5 g, K2HPO4 1.05 g、NaCl 0.5 g、琼脂 18 g、H2O 1000 ml、自然 pH 值。
[0020]复筛:将初筛获得的透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株在PDA培养基上活化后，用直径I cm打孔器在菌落生长均匀处取菌块接种到以稻草秸杆为唯一碳源的赫奇逊液体复筛培养基中(配方为:稻草 25g, KH2PO4 1.05g、NaCl 0.llg、MgS04.7H20 0.29 g, NaNO32.51 g、FeCl3 0.01g、CaCl2 0.10g、H2O 1000 ml、pH 值 6.05)，28。。下 120 r.mirT1 振荡培养5 d，测定发酵液滤纸酶活，筛选出酶活力高的菌株，观察菌落特征并测序。
[0021]该菌株具有如下特征:菌落形态平坦，质地绒状，菌丝体白色，分生孢子灰绿色，无可溶性色素。显微镜下观察菌株的菌丝体(见图3)，分生孢子梗发生于基质，壁平滑，帚状枝双轮生，偶有三轮生或单轮生；梗基每轮2-3个，13-20X3.2-3.7 μ m,彼此通常较紧贴；瓶梗幼龄时为瓶状至披针状，充分成熟时近圆柱形，梗颈明显，分生孢子椭圆形，
4.5-5.5X3.0-4.0 μ m，壁平滑。该菌株26S rRNA基因序列递交到GenBank数据库，序列见 SEQ ID NO:1 (即 CCCGGGGGTATGCCTCAGTAACGGCGAGTGAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAAGCTGGCTCCTTCGGGGTCCGCATTGTAATTTGCAGAGGATGCTTCGGGAGCGGCCCCCATCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCATAGAGGGTGAAAATCCCGTCTGGGATGGGGTGTCCGCGCCCGTGTGAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGT GGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATATTGGCCGGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGACCAGACTCGCCCACGGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTACTTCCCCGCGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGCCGGTCAAAGGCCCTCGGAATGTAACGCCCCCCGGGGCGTCTTATAGCCGAGGGTGCCATGCGGCCAGCCCAGACCGAGGAACGCGCTTCGGCTCGGACGCTGGCATAATGGTCGTAAGCGACCCGTCTTGAAACACGGACCCAA)；该序列与Penicillium oxalicum 26S rRNA基因序列高度同源(99.3%),见图4,命名为草酸青霉iPeni ci Ilium oxali cum ) BAM-1。
[0022]本发明所提供的有机覆盖物分解菌株均在PDA培养基中进行活化与培养，具体活化与培养方法为:
菌株活化:配制PDA固体培养基，高压灭菌，冷却至50 °C左右，倒平板，冷却后用粘菌株的接种环在平板培养基上划线，用封口膜封好培养皿，倒置28 1:静置培养3-5 d，每天观察菌落生长发育情况，可重复复壮1-2次，整个接种与培养过程需在超净工作台中无菌条件下进行。
[0023]菌株培养:配制PDA液体培养基，并灭菌，冷却后，用接种环从复壮菌落边缘取直径0.5 cm的生长旺盛且无污染的菌块2-3块，接种至PDA液体培养基中，120 r.mirT1摇瓶培养3-5 d,观察菌落生长情况(摇瓶培养草酸青霉(Penicillium oxalicum) BAM-1生物量积累曲线见图2)，整个接种与培养过程需在超净工作台中无菌条件下进行。
[0024]该菌株的活化与培养分别采用固体和液体PDA培养基进行。所述液体PDA培养基组分为:去皮马铃薯200 g(先用约500 ml蒸馏水煮沸15 min，弃去马铃薯并过滤)，葡萄糖20 g，加水至1000 ml，调节pH值至6.05。向液体PDA培养基中加入18 g琼脂即得到固体PDA培养基，其他组分相同。
[0025]实施例2:菌株滤纸酶活力
将草酸青霉(Penicillium oxali cum) BAM-1、绿色木霉、哈茨木霉接种于赫奇逊液体培养基(配方为:1 cmX6 cm 新华定量滤纸、KH2PO4 1.05g、NaCl 0.llg、MgSO4.7H20 0.29g,NaNO3 2.51 g,FeCl3 0.01gXaCl2 0.10g、水 1000 ml、pH值6.05)中，28。。下120 r.rnirT1摇瓶振荡培养，结果见图1，发现三菌株滤纸酶活力随培养时间延长呈先升高而后降低变化趋势，培养5 d时酶活力最高，分别为9.83 U、3.93 U、4.64 U，草酸青霉oxali cum) BAM-1滤纸酶活力是绿色木霉和哈茨木霉的2倍以上。
[0026]实施例3:菌株产酶培养基优化
在单因素试验的基础上，采用4/力正交试验设计，对含有不同浓度碳源(稻草?οg.L'15 g.L'25 g.L—1)、氮源(牛肉膏 1.5 g.L'2.0 g.L'2.5 g.L—1)与无机盐(FeCl3
0.01 g.L'0.015 g.L'0.02 g g.!/1 及 KH2PO4 1.0 g.L'1.5 g.L'2.0 g.L-1)赫奇逊液体培养基进行优化，见表1。菌株产酶的最优培养基因素组合为:稻草25 g.!/1、牛肉膏2.5g.L'FeCl3 0.01 g.L'KH2P04 1.5 g.L'
[0027]表1 L9 (34)正交试验设计和结果
【权利要求】
1.尊窗管霉iPenicilliumBAM-1,保藏号为 CGMCC N0.8315。
2.如权利要求1所述的草酸青霉(arayicw?)BAM-1,其特征在于其分离纯化方法包括以下步骤: 1)富集培养:取土壤和腐烂有机覆盖物样品，在无菌水中振荡分散后，取悬浊液接种于马丁氏孟加拉红富集培养基中，28 1:下120 PmirT1振荡培养2 d，反复培养3次； 2)初筛:取第三次富集培养液，用玻璃涂布棒均匀涂布在刚果红纤维素平板培养基上，28 °C下培养，以在平板上出现透明水解圈的时间以及培养4-5 d后水解圈直径与菌落直径的比值大小为基准，筛选水解圈出现早且直径较大的菌株，将筛选出的菌株保存在PDA平板培养基上； 3)复筛:将初筛获得的透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株在PDA培养基上活化后，用直径I cm打孔器在菌落生长均匀处取菌块接种到赫奇逊液体复筛培养基中，28 °C下120 r.rniiT1振荡培养5 d，测定发酵液滤纸酶活力，筛选出酶活力最高的菌株，测序，该菌株的26S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求2所述的草酸青霉BAM-1,其特征在于:步骤O中所述的马丁氏孟加拉红富集培养基的配方为=KH2PO4 I g、MgSO4.7H20 0.5 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、琼脂20 g、孟加拉红3.3 mg、链霉素30 μ g> H2O 1000 ml、自然pH值。
4.如权利要求2所述的草酸青霉(ora/icw?)BAM-1,其特征在于:步骤2)中所述的刚果红纤维素平板培养基配方为=CMC-Na 2.1 g、刚果红0.39 g、(NH4) SO4 2.1g> MgSO4.7Η20 0.5 g、K2HPO4 1.05 g、NaCl 0.5 g、琼脂 18 g、H20 1000 ml、自然 pH 值。
5.如权利要求2所述的草酸青霉(ora/icw?)BAM-1,其特征在于:步骤3)中所述的赫奇逊液体复筛培养基配方为:稻草25 g、KH2PO4 1.05 g、NaCl 0.11 g、MgSO4.7Η20 0.29 g,NaNO3 2.51 g,FeCl3 0.01 g、CaCl2 0.10 g、H20 1000 ml、pH 值 6.05。
6.如权利要求1或2所述的草酸青霉οxaIicum、BAM-1,其特征在于其活化方法如下:配制PDA固体培养基，高压灭菌，冷却至50 °C，倒平板，冷却后用粘有菌株的接种环在平板培养基上划线，用封口膜封好培养皿，倒置28 1:静置培养3-5 d，可重复复壮1-2次，整个接种与培养过程在超净工作台中无菌条件下进行；所述的PDA固体培养基的制作方法为:1)取去皮马铃薯200 g，切碎，加入500 ml蒸馏水煮沸15 min，过滤，得到马铃薯汁；2)在该马铃薯汁中加入葡萄糖20 g ;3)然后加水至1000 ml，调节pH值至6.05，得到液体PDA液体培养基；4)向PDA液体培养基中加入18 g琼脂，得到固体PDA培养基。
7.如权利要求1或2所述的草酸青霉iPenicilliumοχ3^7----)ΒΑΜ-1,其特征在于其培养方法如下:配制PDA液体培养基，灭菌，冷却后，用接种环从复壮菌落边缘取直径0.5 cm的生长旺盛且无污染的菌块2-3块，接种至PDA液体培养基中，120 r.min-Ι摇瓶培养3_5d，整个接种与培养过程在超净工作台中无菌条件下进行；所述的PDA液体培养基的制作方法为:I)取去皮马铃薯200 g，切碎，加入500 ml蒸馏水煮沸15 min，过滤，得到马铃薯汁；2)在该马铃薯汁中加入葡萄糖20 g;3)然后加水至1000 ml，调节pH值至6.05。
8.驾履"着霉(FeniciIIiumBAM-1在分解林地有机覆盖物的应用。
9.草酸青霉在分解雷竹林有机覆盖物的应用,其特征在于其应用方法为:取用草酸青霉BAM-1发酵菌液,发酵菌液生物量为38.5 g干菌.L—1，菌液滤纸酶活力为8.65-10.91U，用量为60-90 kg.hm_2，按1:10稀释后均匀喷洒于土壤表面，并浅锄表层土壤，使发酵菌液与土及有机覆盖物充分接触；应用季节为5-6月和9-10月，气温以30-35°C为宜，林地土壤体积水分率为50_60%。
10.根据权利要求9所述的草酸青霉在分解雷竹林有机覆盖物的应用，其特征在于所述的发酵菌液的制备方法为:采用含1%食用油的改良PDA液体培养基，其组分为:去皮马铃薯220 g，葡萄糖21 g，食用油10ml，加水至1000 ml，调节pH值至6.05;28 °C下发酵3 d，溶氧量为73 %，搅拌子转速为20 r.mirT1，消泡剂为非离子型改性聚硅氧 烷。
【文档编号】C12N1/14GK103525710SQ201310497471
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】郭子武, 陈双林, 李迎春, 杨清平 申请人:中国林业科学研究院亚热带林业研究所