一种溶磷草酸青霉菌p8的制作方法

专利名称：：一种溶磷草酸青霉菌p8的制作方法
技术领域：
：本发明属于微生物菌剂领域，具体地，涉及一种溶磷草酸青霉菌(尸emW〃&wojra/z'CMm)P8、含有该菌的溶磷菌剂及其用途。
背景技术：
：全世界范围内严重缺磷的威胁向人类袭来，地球上天然磷矿的使用寿命只有50年。我国磷肥需求量大、磷矿资源严重不足。磷肥施入土壤后90。/。左右被土壤固定，形成溶解性极低的磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝等化合物，进入土壤难溶磷资源行列。土壤磷素90%以上为无机磷，北方土壤的难溶磷50%以上以磷酸钩的形态存在，磷酸铁磷酸铝次之。经过几十年的磷肥施用，我国土壤全磷增加。利用溶磷微生物，提高土壤磷的有效性、提高磷肥的利用效率和节约磷肥资源，以及促进磷素吸收、增加作物产量，对于我们这样一个13亿人口大国的目前和未来的粮食安全意义重大。Staltrom(1903)和Sachett"a/.(1908)发现土壤溶磷微生物以来，前苏联20世纪40年代开展了溶磷微生物的研究(Pikovskaya,1948),蒙金娜1935年从土壤中分离出解有机磷和溶解磷磷酸三《丐的巨大芽孢杆菌(Menkina,1950)。此后研究工作在近100个国家相继展开，并且取得了巨大成就。研究的重点集中在筛选高效、安全、生存力强的溶磷菌株，并以此作为接种剂，使之在根表和根际建立优势菌群，达到促进土壤难溶磷溶解和作物增产的目的。Jonhson(1954)最早研究了真菌的溶磷作用，在他分离的三株真菌中，^spwg/〃附m'gw的溶磷作用最好。Rao，etal.(1982)分离到第一株链霉菌，可使培养基的pH降低，能溶Ca3(P03)2和磷矿石。BanikandDey(1983)报道了他们分离出的两株放线菌(链霉菌)的溶磷作3用，它们能溶解Ca3(P03)2和AlP04。Taha"a/.(1969)报道了酵母菌真菌的溶辚作用。报道酵母菌溶解无机磷的还有VarshaandPatel(1995)。FalihandWainwright(1995)则报道了一株具有硝化、氧化硫和溶磷等多重作用的酵母菌。Struthers和Siding(1950)的研究结果指出，分泌有机酸是微生物的溶磷机理，减少土壤中Fe3+、A13+离子对PO^的化学固定。Johnston(1952)首次提出只有特定结构的有机酸的作用才是溶磷的主要机制。LouuwandWebley(1959)和Johnston(1959)也证明了有机酸的种类决定溶磷菌的溶磷能力。Duff"a/(1963)测定了能溶解和螯合各种难溶磷酸盐或矿物使之溶解的阴离子，溶磷细菌能产生2-酮基-葡萄糖酸。溶磷菌产生的葡萄糖酸(Feniceetal.2000)、梓檬酸(Vassilavaaa/.1998)、甲叉丁二酸、草酸、丙烯二羧酸(Parksetal.1998),以及3-N基-3-乙酸(nitrilotriaceticacid)、乙烯-2-氨基-4-乙酸(NarsianandPatel，2000;Rashid"a/.2004;)，是溶磷作用产生的主要机理。溶磷微生物分泌H"质子是其溶嫌又一机理。研究发现，尸em'c/〃/簡qycpz'"m在培养基中分泌tf增加了培养基酸度(RoosandLackner,1984),溶磷微生物溶解羟基磷灰石有两种不同方式，一种需要NH/的存在，另一种则无需NH4+(Haideretal,1992;AbdAlla，1996)。溶磷微生物合成氧化还原物质成为其第三个主要溶磷机理。层析技术分析显示木霉7Hc/2o&wwsp的溶磷物质与铁结合的复合体的存在，它能够分泌还原Fe(m)和Cu(II)的复合体，以螯合和还原两种反应溶解难溶磷(AltomareWa/.,1999)。溶磷微生物在有氧条件下2-酮基葡萄糖酸(2-KGA)产量高，厌氧时产生量急剧下降，有机酸不再成为溶磷的主要途径，而还原作用扮演重要角色(Hwangbo"a/.，2003)。科学家对溶磷微生物活化土壤难溶磷的能力进行了不懈研究。田间条件下，高粱接种溶磷青霉菌尸emW〃&msp.和臭曲霉A.foetidus，显著增加了土壤有效磷，而且磷矿石+溶磷菌的作物吸磷量高于重过磷酸钙(Salih"a/.,1989);利用"P同位素稀释法研究发现，用尸emW〃/wm6z7q/7(PB)接种的小麦所吸收的磷素有18%来自于难溶性磷源，对于没有接种过PB的土壤则植物无法利用这种磷源(Asea等，1988)，而且接种尸em'cz'〃/MmMa"的具有溶解土壤微量元素Cu、Fe、Zn等的作用(Kucey，1987));其他溶磷细菌在增加土壤有效磷同时，也表现活化了土壤微量元素(Orhan，e^/.，2006)。使用溶磷微生物肥料能够提高了作物叶片氣磷含量，土壤有效磷含量，土壤接种溶磷菌比种子表面接种显著提高土壤有效嫌(KapureandNaik,2004)。小麦接种溶磷菌剂节省磷肥、提高土壤有效磷，收获后土壤有效磷依然高于未施溶磷菌剂的处理(Suil",2006)。有些溶磷微生物受土壤有效磷购抑制。有些菌株则不受土有效磷的影响(MikanovaandNovakova，.2002)。溶磷草酸青霉菌P8能够提高磷肥的有效性、防止磷肥向难溶磷的转化(范丙全等J004)。上述结果表明，溶嫌菌对于提高土壤难溶磷的生物有效性具有巨大应用潜力。溶磷微生物具有促进作物生长和提高作物生物量的作用(H6flichetal.，1995;FreitasWa/,1997;KatiyarWa/"2003;Morales"a/.，2007)，还有促进作物吸磷、提高作物产量效果(Chabot,1996;Peix，"a/.，2001;Hameeda"a/.,2006);豌豆接种尸em'c/〃z'ww6z7a"后增加根毛量22%,增加根毛长度33%，可能增加了吸收养分的面积而达到增产的效果(Gulden,2000;Vessey，2001)。用携带潮霉素抗性基因标记溶磷青霉菌尸emW仏'wmn/gw/osom，将获得的转化子接种玉米，玉米的干物重比对照增加28%(Reyes,2002))。溶磷青霉菌真菌接种小麦、苜蓿、兵豆能够提高产量15-18%(Wakelin"a/.，2007)。据不完全统计，全世界共筛选出36属，89种溶磷微生物，其中真菌27个种，细菌58个种，放线菌4个种。自上个世纪50年代以来，溶磷微生物肥料进入商业化生产和较大规模的使用。但是，真正用于农业生产的菌株很少。前苏联20世纪50年代开展了具有溶磷作用的解磷巨大芽孢杆菌的大面积应用(Cooper,1959)。同时，解磷巨大芽孢杆菌被其它国家引进用于生产(Smith"a/，1961;BajpaiandSundara,1971)。印度自20世纪70年代以来生产和应用了较多的溶磷微生物肥料，产品有Phosphobacterin(SharmaandSingh,1971)、Phosphobacteria(KunduandGaur,1980;Sharma^a/.,1983)、Microphos(TomarWa/.,1994)、Biophos(KambleandMohite，1996)、Phosphotika(AhlawatandRai，1997)和AzoPhos(Premalatha，Wa/.,2004)。加拿大的PhilomBios公司使用溶磷青霉菌尸em'c/〃/Mm&7a"生产溶磷微生物肥料(商品名JumpStart)，平均增产6-9%(GleddieWa/.,1991)。比利时以溶磷细菌生产的菌剂Phosphorene在促进橄榄树苗生长和磷素吸收效果显著(Ahmed，"a/.，1999)。我国目前应用最多的还是上个世纪5060年代筛选的溶磷菌株(葛诚，吴薇1995;姜瑞波2005)。人类拥有巨大的溶磷微生物菌种资源与目前较少的溶磷菌种用于溶磷微生物肥料的生产使用，形成了鲜明的对照，这个问题不能不引发人们的深刻思考。国内外的研究报道显示，几乎所有作物接种适宜的溶磷微生物菌剂都能够提高产量，然而却不是所有的溶磷菌剂都能够溶解土壤难溶磷，有些溶磷菌株表现促进磷素吸收的作用，而且溶磷作用和促生效果在土壤条件下极不稳定。筛选高效溶磷、环境适应能力强的优良菌株是长期以来科学家追求的目标。但是，依然缺少高效的溶磷菌资源，尤其缺少显著溶解土壤难溶磷、提高磷肥利用效率、适应不同地域的土壤类型和不同作物品种的能力强的溶磷菌株。加拿大农业部RegKucey博士筛选的拜莱青霉菌(尸emW肌"m)被认为是当前世界上溶磷促生效果最好的菌株，本发明涉及的草酸青霉菌P8的溶磷能力显著高于拜莱青霉菌。溶磷草酸青霉菌P8菌株能够溶解土壤多种难溶磷如辚酸三钩、磷酸八钙和磷酸十钙，其促进作物吸磷和促进作物生长的效果在土壤条件下稳定，亦不受磷肥施用的影响。同时，它能够增强外源难溶磷的生物利用效果，减少土壤对磷肥的固定，阻止有效磷向难溶磷的转化，从而提高磷肥的利用效率。在溶解难溶Ca3(P04)2和MRP过程中，草酸青霉菌P8分泌有机酸、蛋白质、氨基酸、酸性磷酸酶和多糖，分泌量高低与水溶磷浓度呈高度负相关。溶磷草酸青霉菌P8溶磷作用是有机酸、酸性磷酸酶、蛋白质、多糖共同参与的结果。溶磷草酸青霉菌P8的诸多特性在以往的研究中未见报道。
发明内容本发明的目的是提供一种溶磷草酸青霉菌(尸em'c朋画P8。本发明的又一目的是提供一种含有青霉菌P8的溶磷菌剂。本发明的第三个目的是提供一种青霉菌P8的应用。本发明的一种溶磷草酸青霉菌P8，是1996年从河北省石家庄太行山麓平原的石灰性褐土中分离。该菌株已于2007年12月15日保藏在中国普通微生物菌种保理中心，保藏号CGMCCNO.2272。本发明所提供的溶磷草酸青霉菌P8，其具有如下微生物学特性1、溶磷草酸青霉菌P8菌落在CYA上25。C生长7d,直径45-47mm，线状，产生大量的分生孢子结构，微黄暗棕色，近于水松绿，无渗出液，反面淡黄色。2、麦芽汁琼脂上25。C生长7d，菌落直径35-37mm，分生孢子结构较多，中部带粉红色，近于洋葱皮粉红色，边缘暗绿色，近于林肯绿反面紫黄褐色。3、在CYA上5。C生长7d，少数萌发；在CYA上37°C生长7d;生长茂盛。4、分生孢子梗发生于基质，180-300pmx3.0-4.0pm，壁平滑；梗基每轮通常2-4个，通常13-20pmx3.0-4.0|mi，彼此近于平行；梗7基每轮通常5-6个，瓶状或近于圆柱状，通常9.0-13pmx2.5-3.2|am;分生孢子椭圆型，通常4.8-6.0pmx2.8。本发明的草酸青霉菌P8具有提高土壤溶磷的作用，尤其具有溶解土壤中多种难溶磷的作用，可以防止磷肥的土壤化学固定，提高磷肥利用效率的多种作用功能。适合南方的红壤、北方的褐土、潮土等多种土壤类型。本发明还提供一种含有草酸青霉菌P8的溶磷菌剂，其由草酸青霉菌P8和添加剂制成溶磷菌剂。所述的溶磷菌剂包括如下重量份的组分草酸青霉菌P8l份添加剂10-15份。上述溶磷菌剂，优选地，包括如下重量份的组分草酸青霉菌P8l份添加剂10份。其中，所述添加剂为草炭或硅藻土，吸附草酸青霉菌P8后，菌体含量达到2xio8cfii/g以上。本发明的溶磷草酸青霉菌P8及其溶磷菌剂，其制备过程如下1、培养基的组成(/L):可溶性淀粉IO克黄豆饼粉IO克玉米粉5克葡萄糖l克蔗糖IO克酵母粉5克(NH4)2S043克K2HP040.2克NaCl2.5克MgS047H20O.l克CaC030.5克FeS04O扁克硼酸(1%)l毫升pH7.02、培养过程将草酸青霉菌P8菌株接种于土豆蔗糖(PDA)培养基上，28-30。C培养48h，然后接入500mL三角瓶，30°C,180r/min下液体培养36h。然后按1。/。接种量接入到15L种子罐中，在220r/min,pH7.0,通气量0.6vvm下，培养24h后，再按5%的接种量装入到IOOL的发酵罐中，在220r/min，pH7.0，通气量0.7wm下，培养3d。发酵完成后，按照l:10-15的比例加入灭好菌的草炭或者硅藻土，混匀，包装。本发明的草酸青霉菌P8，也可以以麦麸(糠)、稻糠、秸杆粉、发酵畜禽粪便等有机物料作为吸附载体和吸附剂，结合其他添加剂生产溶磷生物肥料。本发明的溶磷草酸青霉菌P8在提高土壤难溶磷有效性、防止磷肥固定和提高磷肥利用率以及在增加作物产量中的应用。菌株保藏信息本发明的溶磷草酸青霉菌P8，编号为CGMCCNO.2272,其分类命名为尸em'c/肌wmojcfl/ZcwmP8,现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京巿朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCCN0.2272，保藏日期2007年11月30曰。摇床培养条件下，对草酸青霉菌P8的溶磷机理进行研究可知青霉菌P8分泌有机酸、蛋白质、酸性磷酸酶、多糖的数量受培养基中水溶磷浓度的显著影响，其分泌量与有效磷浓度呈高度负相关，这些受有效磷水平影响较大的有机分泌物与溶磷相关密切。难溶磷的种类影响有机分泌物的数量，在Ca3(P04)2、FeP04、A1P04三种难溶磷培养9基中，草酸青霉菌P8分泌的有机酸、酸性磷酸酶、蛋白质、多糖都高于水溶磷KH2P04数倍乃至数十倍。这些物质是磷胁迫诱导的产物.经研究表明草酸青霉菌P8溶磷机理为①有机酸不是溶磷的唯一机制，草酸青霉菌P8的溶磷作用是有机酸、酸性磷酸酶、蛋白质、多糖共同参与的结果；②草酸青霉菌P8的溶磷作用与能力受环境中有效磷水平的诱导或影响。本发明的草酸青霉菌P8及其溶磷菌剂，具有如下有益效果1、本发明的草酸青霉菌P8，能提高作物产量、活化土壤难溶磷、防止磷肥固定、减少磷肥用量、提高磷肥利用率、促进根系发育。2、固体培养基上草酸青霉菌P8表现较强的溶解Ca3(P04)2、Ca8H2(P04)65H20、CaHP04、FeP04和骨粉的能力；在液体培养条件下，能有效的溶解摩洛哥磷矿粉，氮源对其溶磷效果有显著影响，硝态氮高于铵态氮；接种草酸青霉菌P8能够显著增加灭菌和不灭菌土壤的有效磷含量，灭菌土壤增加的有效磷略高于不灭菌土壤。具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例l草酸青霉菌菌株P8及其溶磷菌剂的制备1、培养基的组成(/L):可溶性淀粉10克黄豆饼粉10克玉米粉5克葡萄糖l克蔗糖10克酵母粉5克(NH4)2S043克K2HP040.2克NaCl2.5克MgS04.7H20O.l克CaC030.5克FeS040.00l克硼酸(1%)l毫升pH7,02、培养过程将菌株P8接种于土豆蔗糖(PDA)培养基上，28-30。C培养48h,然后接入500mL三角瓶，30°C，180r/min下培养时间36h。然后按1%接种量接入到15L种子罐中，在220r/min,pH7.0，通气量0.6vvm下，培养24h后，再按5%的接种量装入到100L的发酵罐中，在220r/min,pH7.0，通气量0.7vvm下，培养3d。发酵完成后，按照1:IO的比例加入灭好菌的草炭或者硅藻土，混句，包装。实验例l草酸青霉菌P8的溶磷能力1、固体培养条件下的溶辚效果在选择性的改良Pikovskaya培养基(培养基组成(g/L):(NH4)2SO40.5,NaC10.2,KC10.2,MgS04'711200.03,MnSO40.03,FeS040.003,酵母粉0.5，葡萄糖10.0，磷源5.0)上，将在石家庄郊区草地釆集的土壤样品进行逐级稀释，以土壤溶液的10"涂布平板，进行了溶辚微生物的分离。根据溶磷圈的大小初步分离出溶磷细菌和真菌70株。然后，在以磷酸三钙为唯一磷源的选择性培养基上，进一步比较了这些溶磷菌株的溶磷能力，真菌溶磷能力大于细菌。最后获得两株溶磷能力较强的真菌P8和Pnl。以ATCC20851(尸em'c/〃^附.^7a")和巨大芽孢杆菌ATCC14581为对照菌株，对菌株P8和Pnl在不同磷源琼脂培养基上溶磷圈和菌落生长直径进行了比较，结果如表l所示。表l溶磷青霉菌在不同裤源琼脂培养基上菌落生长与溶磷圈直径(mm)P8PnlATCC20851ATCC14581溶磷圈菌落溶磷圈菌落溶磷菌落溶磷圈菌落骨粉50.5b45.5cb48.5b41.2b无22.5ab15,012.3bFeP0441.2b38.5d40.5d37.5de无21.7bc无10.3cdCaHP0444.5c37.2cd46.3cd41.7c无21.0bc无11.3cCa3(P04)249.2b39.0b45.5bc42.5c24.022.7a无10.3cdCa8H2(P。4)644.7c36.7cd44.3cd39,0cd无22.0bc无10.3cdMPR无43.5d无38.7e无20,3cd无lO.Od卵磷脂无54.7a无58,7a无22.0bc17.013.2aA1P04无25.2e无29.7f无21.3bc无ll.Ocd氟磷灰石无27.7e无29.0f无18.5d无lO.Ocd显著性p.=磷源间0.00010.00010.010.0001注a,b,c字母不同表明处理之间差异显著。在以难溶磷酸盐为唯一磷源的Pikovskaya改良固体盐培养基上，30。C培养菌株P8、Pnl以及对照菌株ATCC20851(尸e"/"'〃/wm.6z7m7)和巨大芽孢杆菌ATCC14581，对骨粉、FeP04、CaHP04、Ca3(P04)2、磷酸八每、摩洛哥磷矿粉的溶磷能力进行了比较，结果如表2所示。表2接种溶磷菌平板培养基5d的溶磷量(Pmg/20ml)\菌株P8PnlATCC20851ATCC14581磷源溶磷量占加入溶磷量占加入溶磷量占加入溶磷量占加入mgP%mgP%mgP%mgp%骨粉4.1931.254,5629.110.372.76FeP043.4821.023.3620.28——CaHP044.4124.453.5826.51一—Ca3(P04)26.0230.145.1225.621.467.28-Ca8H"P04)64.70424.854.6124.36——卵磷脂-—_——0.1635.92MPR-—一———A1P04一一-———氟磷灰石——————显著性磷源间O扁lO扁l0.010.001注"-"表示无溶磷圏或未测有效磷12结果显示，P8、Pnl表现出较强的溶解骨粉、FeP04、CaHP04、Ca3(P04)2、磷酸八钙、摩洛哥磷矿粉的能力。溶磷能力显著高于对照菌株ATCC20851(尸em'c/〃^m.6z7a")和巨大芽孢杆菌ATCC14581。本发明菌株P8溶磷种类多、效率高、适应能力强，表现了良好的应用潜力。2、液体培养条件下的溶磷效果在以难溶磷酸盐为唯一磷源的液体培养基(培养基组成(g/L):(NH4)2S040.5，NaCl0.2，KC10.2，MgS04'7H200.03,MnS040.03，FeS040.003,酵母粉0.5，葡萄糖IO.O,摩洛哥磷矿粉(过80目筛)5.0)中，3(TC培养草酸青霉菌P8、ATCC20851以及不接菌的对照，160r/min，溶磷能力测定结果如表3所示。表3液体培养条件下不同溶磷菌10d转化磷矿粉为水溶磷的数量<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注表中a、b、c字母不同表示处理之间差异显著，字母相同表示没有差异；0.01,0.05,ns分别表示处理之间的差异达到极显著、显著和不显著水平；"-"表示未测有效磷P8和ATCC20851菌株都有明显的溶磷效果，菌株间差异显著，铵态氮供应时，溶磷青霉菌P8经过10d的培养，50ml培养基中的水溶磷(P)为9,71mg，显著高于对照菌P20851(5.952mgP)。硝态氮供应时草酸青霉菌P8的溶磷量高于铵态氮，50ml培养基中的水溶磷(P)为12.786mg，占磷矿粉中总磷的47.5%，高于铵态氮为氮源时溶磷量的7.745mg,(占施入磷矿粉总磷量的36.07%)。无论使用硝态氮还是铵态氮，草酸青霉菌P8都具有最高的溶磷能力。3、溶磷草酸青霉菌P8溶解土壤磷的效果在三种不同土壤环境，l号土壤为轻壤质潮土，取自北京巿大兴区农田，有效磷(P)13.5吗/g;2号土壤为中壤质潮土，取自河北省武强县旱薄地粮田，有效磷(P)4.7吗/g;3号土壤为中壤质脱潮土，取自北京巿昌平区，多年撂荒地，有效磷(P)^g/g5.2。菌株P8具有较显著的溶磷作用，结果如表4所示。表4盆栽耗竭实验磷分组(吗/g)土作物菌剂磷组分总量壤处理Ca2-PCa8-PA1國PFe-P0-PCa10-P1花生有7.80110.3826.8136.604.68447.1620.81无7.32115.2923.8836.714.05456.9630.31玉米有10.06110.8324.9740.414.74458.2640.81无10.51115.2930.4839.814.卯461.1660.61油菜有16.86110.7112.2835.125.35431.5611.81无16.91112.9012.1834.975.36447.4629.72花生有6.3098.0320.7228.293.67375.9532.92无4.5497.0520.2127.933.93380.8534.42玉米有5.4197.4321.5731.523.66384.7543.42无5.6698.3923.1330.763.64393.7554.42油菜有15.1896.1914.0928.454.30382.0540.22无14.5898.7612.4727.514.44373.7531.53花生有5.4775.1413.6328.393.99372.2498.83无6.4778.3416.0628.533.87381.0515.83玉米有7.1975.1914.4530.884.76374.5503.33无6.6874.4516.5329.234.38366.8497.03油菜有15.9671.748.2725.804.67366.3492.83无14.4572.957.2024.224.99359.8483.6显著性检验P二l号土接种P8ns0.05nsnsns0.012号土接种P8nsnsnsnsnsns3号土接种P8tisnsnsnsnsns注0.01,0.05,ns分别表示处理之间的差异达到极显著、显著和不显著水平。草酸青霉菌P8菌剂能够活化土壤中的磷酸八钙磷、磷酸铝和磷酸十钙等组分，保持较高的Ca2-P含量。花生上P8主要活化Cas-P、Ca1()-P,而对CarP的吸收量最高；玉米上主要活化Cag-P、Al-P和CaurP组分；油菜上主要活化Cas-P组分而以Ca2-P形态积累，Cag-P是易于被草酸青霉菌P8活化的部分。土壤类型对草酸青霉菌P8活化难溶磷的有不同程度的影响，对于l号高有效磷土壤，种植玉米、花生、油菜作物活化CaurP组分较多；2号土壤，花生、玉米接种青霉菌P8活化CaurP组分的效果明显；3号土接种草酸青霉菌P8，只有花生表现溶解CaurP组分的能力。4、草酸青霉菌P8对外源难溶磷的利用盆栽条件下，釆用北京巿大兴区的潮土，玉米为供试作物，研究了溶磷草酸青霉菌P8对外源难溶磷的生物有效性的影响效果，试验用难溶磷包括磷酸三钙、磷酸八钙、磷酸铁、磷酸铝、骨粉、氟磷灰石、开阳磷矿石(KYRP)、晋宁磷矿石(JNRP)和摩洛哥磷矿石(MRP)作为供试磷源，溶磷效果如表5所示。表5不同礫源处理土壤有效磷随时间的变化处理土壤有效磷10d30d60d卯dCK1无6.96de8.96c26.23bed19.91abCK2有13.68cd3.48cd17.65cd8.42cCa3(P04)2有35.09a33.27a42.22abc22.43aBonemeal有23.59b4.94cd16.30cd22.53aA1P04有14.34dc9.22be64.17a15.85abcFeP04有7.32de5.01cd11.59d14,50abcCa8H2(P。4)6有15.16c15.59b59.14a8.35cMRP有6.00e1.24d51.97ab12.57beFA有8.64cde3.62cd21.10cd9.41c显著性0.010.010.010.05_Signif.P=_注表中a、b、c、ab、abc字母表示处理之间的差异显著性，字母不同表示处理之间差异显著，字母相同表示没有差异；0.01，0.05，ns分别表示处理之间的差异达到极显著、显著和不显著水平。结果显示，溶磷草酸青霉菌P8对增强难溶磷的生物有效性具有显著效果。Ca3(P04)2、MRP二种磷源在草酸青霉菌P8的作用下，生物有效性显著提高，不接种青霉菌P8时几乎未显示增加生物产量的效果。本试验条件下，草酸青霉菌P8对Ca3(P04)2、FeP04、开阳磷矿石、摩洛哥磷矿石的活化能力较强，对晋宁磷矿石和A1P04活化作用较弱，表现了草酸青霉菌P8对难溶磷种类有一定的选择性。草酸青霉菌P8作用下，3种磷矿石中以摩洛哥磷矿石被作物利用的效果最好；嫌酸三钙和骨粉释放磷素较快；磷酸铝、磷酸八钙、摩洛哥磷矿石释放较慢，磷的有效供应时间比较长。草酸青霉菌P8的溶磷效果主要表现在10-60d之间，超过60d溶磷效果下降。实验例2草酸青霉菌P8促进作物增产作用在盆栽条件下，利用花生、玉米、油菜在3种不同磷水平的石灰性土壤上(l号土壤取自北京巿大兴区，土壤为轻壤质潮土，有效磷(P)13.5(ig/g;2号土取自河北省武强县單薄地，土壤为中壤质潮土，有效磷(P)4.7昭/g;3号土取自北京巿昌平区，土壤为中壤质脱潮土，多年撂荒地，有效磷(P)pg/g5.2),釆用土壤耗竭性连续种植的方法，研究了溶磷草酸青霉菌P8对吸收土壤磷素和作物生长的影响，结果如表6、7、8所示。表6玉米接种青霉菌P8菌剂的生物产量(g/盆)土壤编号菌剂茬数1234平均接种P83.38a4.63a3.18a2.08a3.91a3.441对照2.31b3.69b2.77a1.94a2.98b2.74显著性0.010.01nsns0.05接种P84.12a4.44a3.35a2.02a3.39a3.462对照3.95a3.29b2.68a1.96a2.69a2.91显著性ns0.05nsnsns接种P83.84a3.72a2.54a2.13a3.31a3.11对照3.36b3.34a2.20a2.05a2.93a2.77显著性0.05nsnsnsns注表中a、b字母表示处理之间的差异显著性，字母不同表示处理之间差异显著，字母相同表示没有差异；0.01,0.05，ns分别表示处理之间的差异达到极显著、显著和不显著水平。表7花生接种青霉菌P8菌剂的生物产量(g/盆)茬数set土壤编号菌剂124平均接种P88.71a7.57a6.06a3.83a3.99a6.031对照6.68b6.07b5.27b3.19a3.28a4.90显著性0.050.050.05Nsns接种P88,04a8.50a6.37a4.00a4.17a6.222对照7.16b7.24b5.49b3.42a3.65b5.39显著性0.010,010.05Ns0.05接种P87.23a7.48a5.94a3.65a4.13a5.693对照6.56b5.77b4,82b2.84a3.28b4.65显著性0.050,010.05Ns0.05注表中a、b字母表示处理之间的差异显著性，字母不同表示处理之间差异显著，字母相同表示没有差异；0.01,0.05,ns分别表示处理之间的差异达到极显著、显著和不显著水平。表8油菜接种青霉菌的生物产量(g/盆)茬数土壤编号菌剂12*34平均接种P83.21a15.18a0.85a3.50a5.681对照2.87a10.96b0.70b3.10—a4,41显著性ns0.050.05ns接种P8-6.07a1.73a0.48a2.762对照-5.99a0.94b0.35a2.42显著性-ns0.05us接种P81.34a12.7131.41a0.98a4.11对照0.96b7.18b0.88b0.39b2.35显著性0.010.010.050.05注表中a、b字母表示处理之间的差异显著性，字母不同表示处理之间差异显著，字母相同表示没有差异；0.01，0.05,ns分别表示处理之间的差异达到极显著、显著和不显著水平。结果表明:171、接种草酸青霉菌P8增强了作物从土壤中吸收磷素的能力。生长量大、需磷多的花生增幅最大，玉米次之，油菜最小。有效磷高的土壤接菌效果大于有效磷低的土壤。但油菜吸磷量增幅在低磷土壤上高于高磷土壤。2、接种草酸青霉菌P8具有促进作物生长的作用，无论土壤有效磷高或低接种草酸青霉菌都比不接种生物产量增加，玉米、花生、油菜表现一致的效果。高磷土壤上玉米接种草酸青霉菌P8的效果较好，花生在3种土壤上接菌有良好效果，而油菜则以3号土壤的增产效果最高。表明草酸青霉菌P8有着广泛的土壤应用范围和潜力。3、在较低温度时不同作物对接种草酸青霉菌P8的效果反应不同，玉米生物产量和吸磷量对低温敏感，其生物产量和吸磷量增加幅度明显下降；但花生、油菜在低温时仍有明显增加生物量和吸磷量的效果。说明草酸青霉菌P8在一定程度上能够改善低温造成的不良影响。4、土壤有效磷高低并不影响溶磷草酸青霉菌P8的接种效果。有效磷高的土壤仍可较好地发挥溶磷草酸青霉菌P8的增加作物生物量和吸磷量的作用。3种土壤上接种草酸青霉菌P8菌剂都能提高作物的吸磷量，其生物产量比不接种显著提高，且在有效磷低的土壤上其增产幅度大于有效磷高的土壤；接种草酸青霉菌P8在一定程度上能缓解和改善低温对作物生长和磷素吸收的不良影响。无论在有效嫌高还是低的土壤，草酸青霉菌P8都具有活化土壤磷、提高土壤磷素的利用效率和促进作物苗期生长的作用。实验例3草酸青霉菌P8的田间试验效果试验设在河北省武强县，土壤为中壤质潮土。每亩施用氮肥15kg，P2O510kg。施验处理3个不施用菌剂(对照)、草酸青霉菌P8和草酸青霉菌Pnl。重复3次。以草碳作为菌株P8、Pnl的吸附载体，按照每亩施用菌剂4kg计算各个小区的菌剂用量，三分之一拌18种，三分之二基施。小区面积8x8m2，小麦品种为冀麦26号，结果如表9所示。表9不同溶磷菌肥对小麦产量的影响(kg/亩)处理号溶磷菌剂千粒重(g)kg/亩比对照增产(％)1CK41.15453.7b-2Pnl42.86482.1a6.863P845,21508.6a12.1注表中a、b字母表示处理之间的差异显著性，字母不同表示处理之间差异显著，字母相同表示没有差异。结果显示，使用草酸青霉菌P8比不使用菌剂的对照增产显著，达到12.1%;使用草酸青霉菌Pnl菌剂的小麦产量比对照增产显著，达到6.86%。草酸青霉菌P8菌剂的增产效果最好。实验例4草酸青霉菌P8防止土壤磷素固定作用釆用^P示踪技术，研究了溶磷草酸青霉菌P8对磷肥、土壤有效磷的转化、固定及其有效性的影响，结果如表IO、11、12所示。表10菌剂施入3周时3"P在6种土壤磷组分中的分布项目磷组分(％)总和Ca2-PCa8-PAl-PFe-PO-PCa10-P土壤处理灭菌30.226.210,222.18.60.7198.1不灭菌27.228.210.523.19.10.6498.7显著性(p=)0.0010.01Il.S0.014n.s0.01n.s作物无作物28.127.79.622.08.90.6797.1玉米29.925.710.522.88.50.6798.1花生28.228.211.022.99.10.68跳O显著性0.010.010.01n.sn.sn.s0.05菌剂处理对照28.026.810.322.89.10.7297.8Po+P828.126.910.221.98.60.6597,5P.5+P830.227.810.623.18.90,65100.0显著性(P^0.010.05n.s0.05n.s0.040.05注P。+P8代表接种草酸青霉菌P8不使用磷肥、P7.5+P8代表施用磷肥P2057.5kg/亩(以15万公斤土壤计算，折合为每公斤土壤施磷量)与接种青霉菌P8;P8的施用量均为lg/kg土壤；0.01,0.05,ns分别表示处理之间的差异达到极显著、显著和不显著水平。表ll菌剂施用5周"P在土壤6种磷组分中的分布项目_磷组分(％)_总和Ca2-PCa8-PAl-PFe-PO-PCa10-P土壤处理灭菌29.024.315.016.67,00.6692.6不灭菌23.726.99.721.77.50.5990.1显著性0細0.0050.001O扁0.012n.s0.054作物无作物26.927.312.319.47.40.7194.1玉米26.324.312.519.17.40.57卯.2花生25.725.212.419.06.90.6089,8显著性n,sn.sn.sn,s0.0280.0210.001菌剂处理对照24.724.711.919.07.50.7088.5Po+P824.625.612.319.37.00.5689.3P.5+P829.726.513.119.27.20.6396.2显著性0扁n.sn.sn.s0.050.0210.001注P0+P8代表接种青霉菌P8不使用磷肥、P7.5+P8代表施用磷肥P2057.5kg/亩与接种青霉菌P8;0.01,0.05，ns分别表示处理之间的差异达到极显著、显著和不显著水平。表12菌剂施用8周时32P在土壤6种磷组分中的分布项目_磷组分(％)_总和Items_Ca2-PCa8-PAl-PFe-PO-PCa10-P_土壤处理灭菌22.723.116,015.96.62.2786.6不灭菌28.219.413.917.77.91.7088.8显著性0,0010.0010.0010.0020.0030.0010.00820作物无作物24.921.915.417.17.42.0488.7玉米26.120.715.116.97.61,8787.6花生25,321.314.416.46.72.0886.9显著性n,stl.Sn.sn.sn.sn.sn.s菌剂处理对照24.521.314.717,97.32.1487.9Po+P824.321.115.217.77.61.9688.0P7.5+P827.521.414.914.86.81.8687.4显著性0.001n,sn.s0.001n.s0.049n.s注P。+P8代表接种青霉菌P8不使用磷肥、P7.5+P8代表施用磷肥P2057.5kg/亩与接种青霉菌P8;0.01,0.05，ns分别表示处理之间的差异达到极显著、显著和不显著水平。结果显示，溶磷菌剂具有防止有效磷转化为难溶的磷酸十锦(Ca1(rP)的作用，增加有效态磷(Ca2-P、Ca8-P)的比例。随时间延长，施入的"P转化为CanrP的数量(或比例)逐渐增加，但是相对于未接种菌剂的对照处理，接种草酸青霉菌P8菌剂的土壤磷和肥料磷转化为CaurP比例最低。溶磷草酸青霉菌P8菌剂能够防止有效磷向难溶磷CaurP的转化。根据^P分析结果，磷肥施入土壤3周，很快转化为其它的磷形态,但是，使用菌剂溶磷菌剂表现出防止有效磷转化为难溶磷的作用，尤其减少了有效磷向难溶CanrP的转化量。5周测定数据表明，使用菌剂增加了有效态磷(Ca2-P、Ca8-P)的比例，降低了O-P、CanrP的转化比例。种植作物能够减少有效磷转化为难溶CaurP的比例，土壤灭菌加剧土壤对有效磷的固定，导致有效磷转化为CanrP的数量增加。随时间延长，所有处理的土壤3￥转化为Ca1(rP的数量和比例在增加，至第8周时，不管是肥料磷还是土壤磷，无论是否接种菌剂，转化为CaurP的比例都较3周、5周显著增加，已占施入量的2%以上。但施用菌剂处理转化为CaH)-P比例仍然是最低，表明菌剂能够防止有效磷向难溶磷CaK)-P的转化，并且其效果能够维持较长时间。21实验例5溶磷草酸青霉菌P8菌剂对作物生物量的影响通过实施例1的培养过程，制作菌剂，在盆栽条件下，种植玉米，花生，用菌剂(施用量lg/kg土壤)和无机磷肥(施用量为7.5kg/亩)处理、结果如表13所示。表13玉米、花生生物量(mg/盆)作物处理不灭菌土壤灭菌土壤根茎合计根茎合计无磷肥793.01771.02564a475.01584.02059b玉米P8730.01932.02662a1020.72187.03207.7aP2057.5+P8850.01983.02833a1284.02450.73734.7a无嫌肥291.31534.01825.3a344.01451.01795b花生无磷+P8296.71552.51849.2a378.01952.02330aP2057.5+P8377.017卯.52167.5a418.02047.02465a结果显示菌剂、磷肥+菌剂在不灭菌土壤上增加生物量效果较低,但不同作物稍有差异，菌剂在玉米上效果大于花生，磷肥在花生上效果大于玉米。而在灭菌土壤上，菌剂、菌剂+磷肥处理表现的增产作用高于不灭菌土，菌剂对玉米增产效果大于花生。土壤灭菌有利于发挥溶磷菌剂的增产作用。实验例6溶磷草酸青霉菌P8在不同土壤条件下的生存能力盆栽试验条件下，种植作物，通过研究草酸青霉菌P8在土壤中存活数量和分布位置，对青霉菌P8在土壤中生存能力进行了研究，结果如表14、15、16、17、18所示。表14温度对青霉菌生存的影响效果温度作物玉米P8菌数存活率生物量.有效磷'0C个/g%g/盆10无3.20xl04a24.86a-3.72a20无2.06xl04b6.98b-1.92ab30无1.79xl04b6.48b-1.68b20有3.37xl04a15.15a1.96a1.11a30有2.27xl04a10.24a2.36a1.29aSignif.温度0.050.05nsnsp=作物nsnsnsns温度*作物nstisnsns表15土壤相对水分含量对溶磷青霉菌存活能力的影响水分含量%作物玉米P8菌数个/g存活率%玉米生物量g/pot有效磷"g/g40无有19802162168.917.301.622.422.4370无有16127140997.266.342.153.923.43100无有16745155187.536.982.584.074.53Signif.水分nsnsO扁l0.01P=作物nsnsnsns水分*作物nsnsnsus表16土壤类型与菌剂使用方式对青霉菌P8存活的影响土壤类型菌剂使用方法P8菌数个/g存活率%玉米生物量g/pot有效磷Hg/g不施--2.947.511拌种53913.643.1514.57基施76265.152.9510.63不施--4.4912.632拌种33872.294.5312.89基施70744.784.7713.05不施--2.836.57拌种27331.853.1711.62基施21051.423.1710.76Signif.P=120.050.05ns0.05nsnsnsns3nsusnsns表17土壤类型对P8在玉米根际、非根际土壤定殖的影响土壤出苗14d后P8菌数出苗35d后P8菌数根际土非根际土根际土.非根际土黑土8.22x105a3.71x105a9,86x105a2.92xI05a潮土红壤7.63x105a5.21xlQ5b4.23>3.68>:105a6,81><105a8.61><105b<104c3.22>7.43><105a(104b显著性P>0,05表18作物种类对青霉菌P8生存的影响效果作物P8菌数存活率o/。第l茬第2蓬第l茬第2蓬无作物7.69xl04a1.59xl04a57,7a11.93a玉米4.58xl04ab1.05xl04b54.3ab7.卯b花生3.17xl04b1.06xl04b23.8b7.97b油菜3.18xl04b1.05xl04b23,9b7.90bSignif.P=0.050.010.050.01结果表明，土壤温度、土壤水分、作物种类、土壤类型、菌剂施用方式对草酸青霉菌P8存活影响较大。土壤温度对施入土壤中的草酸青霉菌P8数量有显著的影响，无论种植作物与否，低温处理活菌数量超过高温处理活菌数量。在无作物时，10。C的存活率最高，平均为24.9%,当温度升高到20。C和30。C时，存活率大幅度下降，分别为7.0%和6.5%。种植作物条件下同样显示出温度对青霉菌P8存活的影响，30。C时，青霉菌P8的存活率为10.2%，当温度降为2(TC时，存活率达到15.2%。相同温度下，种植作物处理的青霉菌P8存活率大于无作物处理。不同水分处理之间对草酸青霉菌P8的存活率的影响没有差异，土壤较低的水分含量有利于草酸青霉菌P8的生存，水分供应为40%、70%和100%土壤的草酸青霉菌P8的生存率为8.1%、6.8%和7.3%,40%的处理存活率最高，大于100%的水分处理，70%的水分存活率最低，3个水分处理之间差异不显著。无作物处理的青霉菌P8的存活率为7.2%,有作物的存活率6.9%。施入土壤的青霉菌P8经过44d时间，存活率急骤下降，最高只8.9%，最低的6.3%,90%以上的草酸青霉菌P8失去了活性。因此，延长施入土壤的溶磷菌的存活时间是稳定接种效果的一个重要课题。土壤类型、菌剂施用方式都极大的影响草酸青霉菌P8的存活率。草酸青霉菌8在土壤中经过43d培养，活菌数量大幅度下降。l号土壤>2号土壤>3号土壤，平均为4.4%、3.4%和1.6%。1号土是有效磷高、常年耕种的较肥沃的土壤，有利于溶磷草酸青霉菌的存活；有效磷低2、3号土壤不利于溶磷草酸青霉菌的存活。东北黑土、北京潮土、湖南红壤种植玉米，接种草酸青霉菌P8，草酸青霉菌P8存活数量黑土>潮土〉红壤。草酸青霉菌P8在黑土中菌体的存活数量都表现出优势，可能与黑土中的有机质含量较高以及菌株P8适应土壤环境有关。不同作物种类对草酸青霉菌P8的存活有显著影响，种植作物的处理草酸青霉菌P8数量都低于无作物处理，无作物处理在35d时存活率为57%，玉米为54.3%，花生、油菜上草酸青霉菌的存活率仅为23.8%和23.9%;81d时，玉米接种草酸青霉菌P8的存活率最高，油菜不利于草酸青霉菌P8的存活。权利要求1、一种溶磷草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)P8，保藏号CGMCCNo.2272。2、一种溶磷菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的草酸青霉菌P8。3、如权利要求2所述的溶磷菌剂，其特征在于，所述溶磷菌剂包括如下重量份的组分草酸青霉菌P8l份添加剂10-15份。4、如权利要求3所述的溶磷菌剂，其特征在于，所述溶磷菌剂包括如下重量份的组分草酸青霉菌P8l份添加剂10份。5、如权利要求3或4所述的溶磷菌剂，其特征在于，所述的添加剂为草炭或硅藻土，吸附溶磷草酸青霉菌后，菌体含量达到2x108cfU/g以上。6、权利要求1所述的草酸青霉菌P8在提高土壤磷有效性中的应用。7、权利要求1所述的草酸青霉菌P8在防止磷肥固定和提高磷肥利用率中的应用。8、权利要求1所述的草酸青霉菌P8在增加作物产量中的应用。全文摘要本发明提供了一种溶磷草酸青霉菌P8，草酸青霉菌P8具有溶解土壤中多种难溶磷的作用，适合南方的红壤、北方的黑土、褐土、潮土等多种土壤类型，具有提高作物产量，活化土壤难溶磷、防止磷肥的土壤化学固定，提高磷肥利用效率的多种作用功能。文档编号C12N1/14GK101643704SQ20081011807公开日2010年2月10日申请日期2008年8月7日优先权日2008年8月7日发明者范丙全,龚明波申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所